细菌分类学始于19世纪后半叶，起初主要根据形态特征、生理生化反应等方面的相似程度将细菌进行简单分类，例如菌落形态、生长条件或者有无致病可能性等。然而这种经典的表型分类方法仅适用于菌种的常规鉴定，在揭示细菌间的系统发育关系方面具有一定的局限性^[1]。20世纪60年代到80年代间出现了一系列如生化分类法、数值分类法和DNA-DNA杂交(DNA-DNA hybridization，DDH)等分类学方法^[2]。尤其是DDH的出现，使生物的基因型相关性成为了微生物分类的可靠依据^[3]。DDH也一度被称为分类学中的“金标准”。然而这一方法也存在缺陷，一方面对亲缘关系较远的物种灵敏度不够，另一方面工作量大耗时长，不适用于野生菌种^[1]。

20世纪80年代后DNA扩增技术的发展为原核生物分类学研究注入了新的动力^{[2, 4]}，许多新的分子标记技术被用来进行细菌的分类和鉴定。其中 16S rRNA基因因其保守、稳定且不受水平基因转移的影响，在众多分子标记中脱颖而出成为细菌分类鉴定的重要依据^[2]。随即应用而生的16S rRNA基因序列分析方法在微生物分类中得到了广泛应用^{[5, 6, 7]}。但是这种方法在区分两个相似性很高的近缘菌种或亚种时会引起偏差，因此有学者提出全基因组分析的方法可以克服这个缺点^[8-9]。

生物学的研究进入基因组时代是在美国基因组研究所完成了对流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)的全基因组测序工作之后^[10]。随着高通量DNA测序技术在微生物领域应用的不断成熟，可以比表型特征和基因片段序列分析更精确的全基因组据被应用到了微生物分类学研究中^{[4, 11]}。随之也涌现出一些基于基因组数据的分析方法，使微生物分类学在精确度、可靠性等方面取得了重要的突破。

本文重点介绍了基于全基因组数据分析的5种具有代表性的微生物分类学方法，旨在为以后的研究提供一定的参考。

1 平均核苷酸同源性分析

平均核苷酸同源性(Average nucleotide identity，ANI)是指两个基因组之间同源基因的相似性^{[4, 12]}。ANI值可以通过两种运算方法得出：一种是以MUMmer运算法则为基础(ANIm)；另一种是以BLASTn方法为基础(ANIb)，相比之下后者应用更为广泛^[11]。普遍认为亲缘关系较近的种群间ANI值至少为70%−75%，而定义一个种的ANI值需要达到95%−96%以上，并且引起人们关注的是这些ANI的数值与“金标准”——DDH有紧密的对应关 系^{[3, 13]}。ANI具有方便、耗费工作量少、错误率低、分辨率高的优点，近年来得到了微生物分类学家们的青睐^[13]。

Zhang及其研究团队^[14]通过计算比较1 226个细菌菌株全基因组序列间的ANI值后，发现处于同一种的菌株间ANI为93.6%，同一属的菌株间ANI值为83.6%，而同一科菌株间ANI为78.9%。作者认为在测序技术快速发展的这一机遇下ANI可以同时用于可培养和不可培养微生物的种属鉴定中。Kim等^[12]通过研究6 787个基因组序列样本以期确定16S rRNA基因序列相似性的值和ANI值之间的相关性，发现用来区分两个不同种的98.65%的 16S rRNA基因相似性值与95%−96%的ANI值相对应。在这一方法良好准确性的前提下，ANI在解决微生物分类的实际问题中发挥着重大的作用。Yi 等^[15]通过计算ANI值和DDH值来研究枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)三个亚种之间的关系。比较发现，亚种B. subtilis subsp. inaquosorum和B. subtilis subsp. spizizenii可以归为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)下的一个种，且与亚种Bacillus. subtilis subsp. subtitlis有较远的亲缘关系。Tamura等^[16]计算了诺卡氏菌属(Nocardia)的ANI值(77.2%−95.2%)，并在这些值的基础上构建了诺卡氏菌属(Nocardia)的系统发育树，这一系统发育树显示有25个分支，并且所有分支的自展值都为100%，这些结果说明由ANI构建的系统发育树可以很好地反映诺卡氏菌属内菌种的进化关系。在大量的研究结果和基因组数据的支持下，众多研究团队都已开发了ANI值的计算工具，比如本地运算软件Jspecies (http://www.imedea.uib.es/jspecies)，Gegenees (http://www.gegenees.org/documentation.html) 和在线计算工具ANI caculator (http://enve-omics.gatech.edu/)，EzGenome (http://www.ezbiocloud.net/ezgenome/ani)等。

内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室研究团队利用这一方法重构了不同乳酸菌的系统发育关系。在对213株乳杆菌及其相关属的研究中，Sun等^[17]在计算乳杆菌(Lactobacillus) ANI值的同时，研究了这些数值的分布规律。对这些数值进行统计可以看出：乳杆菌ANI值的分布在同一科、属间有差异，但同一纲、目间却有一定的重叠性。这一结果对于建立全新的乳杆菌分类体系有一定的参考作用。另一项研究中，Sun等^[18]对双歧杆菌属(Bifidobacterium)基因多样性和进化关系进行了深入的探索。他们在利用ANI这一评价方法验证双歧杆菌属不同种间的分类地位时发现，之前划分为不同遗传谱系的B. indicum 和B. coryneforme间的ANI值高达98.27%，远远大于定义种的界限，依据这一结果可以将二者合并为一个单独的种。

ANI在微生物分类的应用中产生了大量可靠的结果，但是在实际操作中也不可避免地出现了一些问题，2009年Richter等^[19]和2014年Kim等^[12]的研究中发现，在计算ANI时会出现不属于同一种的菌株间ANI值大于96%的异常情况。这种异常情况的发生是由以前分类偏差或者ANI自身缺陷引起，尚未有定论，还有待于进一步的研究。总之，由于其具有快速便捷、应用范围广、同时与DDH具有良好的关联性等优点，一些学者认为可以把ANI作为代替DDH成为下一代金标准的候选方法^[12]。

2 最大唯一匹配指数法

MUMi (Maximal unique matches index，MUMi)是以两个基因组间的最大唯一配对数(maximal unique and exact matches，MUMs)为基础并结合MUMmer这一生物信息软件来计算基因组距离的方法，可用于种内比较。MUMi值将在0到1之间变动，值越小代表这两个基因组之间的亲缘关系越近。许多研究发现这种方法在衡量基因组亲缘关系时与ANI和DDH有很好的关联性，0.33±0.03的MUMi对应于95%±0.5%的ANI和70%的DDH^[20]。

Touzain等^[21]使用MUMi的数据建立了系统发育树，发现大肠杆菌(Escherichia coli)的MUMi树有较高的的准确性。Tiller等^[22]在对7株分离自野生澳大利亚啮齿动物的布鲁氏菌株(Brucella)的研究中，首先将这7株菌定义为布鲁氏菌属下的一个新种；在后续研究中，基于MUMi的分析结果也显示这7株菌之间有很紧密的亲缘关系，这个结果与多位点序列分型的分析结果相一致。Deloger等^[20]由MUMi得出了大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的系统发育关系，并且也得到了与采用多位点序列分型相似的结果。此外，Lugli等^[23]通过计算双歧杆菌属(Bifidobacterium)所有基因组之间的MUMi值来验证试验中ANI值的准确性，计算得出双歧杆菌属(Bifidobacterium)的MUMi在0.11 (菌株B. indicum188 LMG11587和菌株B. coryneforme LMG18911) 和0.99 (菌株Bifidobacterium tsurumiense 189 JCM13495和菌株Bifidobacterium asteroides LMG10735) 之间，这些值均与ANI呈良好的对应关系。以上研究表明，在使用MUMi分析时，得出结果的准确性不亚于多位点序列分型和ANI分析等这些已被科研工作者认可的方法。Ormeo-Orrillo等^[24]采用了MUMi的方法对根瘤菌(Rhizobium)进行了研究，并确定了Rhizobium tropiciCIAT899、Rhizobium sp. PRF 81与其他根瘤菌的亲缘关系，研究结果表明，CIAT899和PRF81为亲缘关系很近的菌株，而Rhizobium rhizogenes K84应属于其他分类群。

MUMi法在探测种内相近菌株的差异性方面有较高的敏感性^[20]，因此可用于种内相似菌株的鉴别中，此外还具有方便快捷的优点，并且与DDH和ANI有紧密的对应关系，因此具有较大的优势。

3 核心基因组分析

核心基因组(Core genome)的定义是在菌株基因组中的较为稳定、不易于发生水平转移的、包括看家基因在内的基因集，这些基因大都具有种属特异性^{[1, 25]}。由于核心基因组进化缓慢并且受种内重组的影响小，所以可以将之用于鉴定细菌菌株之间的亲缘关系中^[26-27]。构建核心基因组的方法是利用BLAST工具进行相似性比对，并且在比对同时设定研究所需要的阈值^[17]。

对于核心基因组在微生物分类中的应用，通常是将核心基因组进行比对，并据此绘制系统发育树。Kaas等^[28]在研究大肠杆菌(Escherichia coli)基因组数据后，证明了由核心基因组建立的系统发育关系具有良好的分辨率，并且指出使用核心基因组建树的方法应普遍应用于大肠杆菌的分型中。Leekitcharoenphon等^[27]从73个已公布的肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)基因组中识别了2 882个核心基因，发现根据不同核心基因建立的同一树比16S rRNA基因和多位点序列分型分析方法的分辨率更高。另外Zhang及其研究团队^[29]完成了对28个乳酸菌基因组的232个直系同源基因的系统发育分析，这一分析采用了两种不同的空位分配标准和两种不同的建树方法，结果产生了可靠且平行性良好的拓扑结构。他们研究发现这些待检的乳酸菌种大体上可以分为两个种群：第一个种群包括肠球菌科(Enterococcaceae)和链球菌科(Streptococcaceae)；第二个种群包括乳杆菌科(Lactobacillaceae)和明串珠菌科(Leuconostocaceae)，使用核心基因组分析得到的这些结论与之前的研究结果是一致的^[30-31]。van den Bogert等^[32]研究了链球菌(Streptococcus)核心基因组的子集基因并用来建树，得到了由5个明显的分支构成的系统发育树，其中3个分支的分类与之前使用飞行时间质谱分析和16S rRNA基因分析的结果相一致。

本研究团队在研究双歧杆菌属(Bifidobacterium)的45个模式菌株的基因多样性和进化关系时，采用了基于核心基因组的分类学方法。在建立了包含有402个基因的核心基因集之后，以这一基因集为基础绘制了双歧杆菌属(Bifidobacterium)的系统发育树。结果表明，基于核心基因构建的系统发育树具有很高的分辨率^[18]。后续研究中，团队成员Sun等^[17]又以213个乳杆菌和10个相关属的基因组为研究对象，鉴定得到由73个基因构成的核心基因组，并以这些基因为基础通过最大似然法构建了乳杆菌属系统发育树。这一结果不仅真实再现了乳杆菌不同种间的系统发育关系，也为我们理解乳杆菌与相关属间的发育关系提供了确实的证据。例如：嗜果糖乳酸细菌属(Fructobacillus)和魏斯氏菌属(Weissella)应是乳杆菌类群的成员。

由以上研究结果可以看出，核心基因组分析可广泛应用于原核生物种属及属以上微生物的研究中，并且也可用于揭示各群体内的进化关系。然而，对于这一方法的争议主要集中在如何定义核心基因组，定义核心基因组的界限是什么，到底这些基因需要保守到什么程度才可以列入核心基因组的范畴中。因此，核心基因组这一方法在微生物分类的应用中还有待进一步完善。

以上3种方法在应用时都需要将微生物基因组进行两两比对，而接下来所提及的两种方法K串组分矢量法和基因流动性分析则具有免对比的特点。

4 K串组分矢量法

K串(K-string)组分矢量法是一种通过计算蛋白质序列或者DNA序列中寡肽的出现频率来推断基因组相关性的方法^[33]。K串是指在一个长度为N的DNA或者RNA序列中长度为K的连续结构，对于基因序列有4^K个可能的K串^[34]。K可以选择1到N之间的任意数。长K值侧重于强调种的特异性，而短K值重点在于反映不同种之间的共同特征^[35]。通过观察由此方法建立的系统发育树可以看出，K=5或者K=6是最适用于细菌系统发育构建的K值，并且也有学者指出没有必要选择大于7的K值^[36]。在2014年Chan等^[37]将熵原理应用到组分矢量方程中并对原有方法进行了改善，使组分矢量法更加准确，应用范围更加广泛。为了研究人员更好地利用这一方法，网络服务平台CVTree (http://tlife.fudan.edu.cn/cvtree/)在2004年初步构建，并在2009年得到完善^{[38, 39]}。

Qi等^[33]利用组分矢量法分析了原核生物的系统发育关系，得到的结果与利用16S rRNA基因分析相似。另外，在Chan等^[40]的研究中，在K=5时绘制的不动杆菌属(Acinetobacter)种系发生关系图在种的水平上与由ANI建立的种系发生关系大体一致。以上结果均证明了K串组分矢量法能够很有效地应用于原核生物的系统发育分析中。在早期的表型实验和近期的若干分子研究中，志贺氏杆菌(Shigella)和大肠杆菌(Escherichia coli)被认为是相关性很高的分类群，因此将志贺氏杆菌(Shigella)归于大肠杆菌(Escherichia coli)中。然而Zuo等^[35]使用组分矢量法进行了一系列的试验后发现4个志贺氏杆菌种并不属于大肠杆菌，准确说来应该是大肠杆菌属中的另一个种，这一研究说明K串组分矢量法可以在一定程度上修正一些分类偏差。

虽然K串组分矢量法在种系发生关系分析中取得了重要的成就，并且适用范围广，可用于细菌、古菌及真菌的鉴定中^[33]。然而研究发现并不是所有的K串都可以有效地用于种系发生树的建立^[41]，并且水平基因转移也会影响到这一方法的准确性^[35]。

5 基因流动性分析

基因流动性φ (Genome fluidity)是指在一组个数为N的基因组中，独特基因数和总体基因的比值，它是属于一种基因容量的比对方法，可简单认为是基因组之间非重叠部分的度量，其最初主要用于衡量微生物种群内基因多样性^[42-43]。基因流动性的数值越小代表对应基因组的特异性程度越小，当基因流动性的值φ为0.1的时候，代表一对基因组有10%的独特基因，相应有90%的共同基因^[43-44]。基因流动性这一方法在计算时，它的优点在于不会因提供的基因序列过短或是鉴定基因同源性方法的不同而影响其结果的精确性^[42]。

Zwick等^[44]计算了蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的基因流动性，其结果显示蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的基因流动性的值φ=0.22，说明这个属的分类地位处于世界性物种如脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)或者大肠杆菌(Escherichia coli) (φ=0.3) 和狭分布物种如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) (φ=0.15) 之间。除了实验事实之外，Lan等^[45]介绍了一个基因组信息的简易比较平台POGO-DB (http://pogo.ece.drexel.edu/)，基因流动性是此平台所使用的比对方法之一。

基因流动性的准确性同样也会受水平基因转移的影响^[40]，在一定程度上制约了这一方法的应用。

6 展望

上文中论述的这几种基于基因组数据的方法，虽然它们的应用领域各有侧重，但在微生物分类中均有大量成功的实例。ANI分析因与DDH有良好的关联性而有望成为下一代的金标准。MUMi分析和ANI同为计算基因组指数的方法，与DDH也同样有一定的联系这一特性增加了其应用优势。核心基因组分析由于其所选基因有较强的保守性，因而在建树中有着较高的分辨率和准确性。基于基因含量的两种方法——K串组分矢量法和基因流动性分析，虽然目前在微生物分类中应用还比较少，但是由于其算法简便、免对比的特点因而有一定的应用前景。在这5种方法中ANI分析和核心基因组分析的应用最为成熟。

微生物分类学的最终目标是建立一个可以反映“自然秩序”的系统。因此，微生物的分类技术在不断的探索和争论中不断提高。目前已出现的分类学方法已经在很大程度上修正了之前存在的偏差，但是这些方法仍存在较大的改善空间。另一方面，由于目前对基因组序列信息所包含的生物学意义了解得不够透彻，所以在应用这些基因组数据时应当更加慎重。总体来说，以基因组数据为基础的这些分类方法具有快速、准确、节省人力等优点，相信会得到更广泛的应用。在今后的分类学方法研究中，为了提高微生物分类的合理性和准确性，除了对已有方法改进完善并且探索新方法之外，也需要考虑将这些基因组数据的方法同形态学、生理生化特性等表型标记方法联合使用。