2016, Vol. 43扩展功能
文章信息
- 李文静, 梁运祥, 赵述淼
- LI Wen-Jing, LIANG Yun-Xiang, ZHAO Shu-Miao
- 3株罗伊氏乳杆菌生物学特性的分析比较
- Comparative analysis of the biological characteristics of three strains of Lactobacillus reuteri
- 微生物学通报, 2016, 43(5): 1035-1041
- Microbiology China, 2016, 43(5): 1035-1041
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.150800
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文章历史
- 收稿日期: 2015-10-17
- 接受日期: 2016-01-05
- 优先数字出版日期(www.cnki.net): 2016-01-11
仔猪腹泻是影响养猪产业快速发展的主要疾病，在饲料中添加抗生素提高仔猪免疫力的做法在我国十分普遍。然而，在饲料中添加抗生素的弊端日益显现，我国在未来几年可能会禁止饲喂抗生素，因此，急需寻找新的抗生素替代品[1-3]。益生菌可以抑制病原菌的生长，调节宿主体内的微生物生态平衡，减少腹泻等疾病的发生。乳酸杆菌属均没有毒副作用，是一类很有应用价值的益生素生产菌种，其中罗伊氏乳杆菌是已报道的几乎存在于所有哺乳动物和脊椎动物肠道内的乳杆菌，具有很强的黏附能力，可以调节肠道菌群分布[4]。
研究发现，益生菌能在宿主体内发挥作用的前提是到达肠道的活菌数在106 CFU/mL以上[5]。Hill等[6]也提出，益生素为服用足够数量后有益于宿主健康的活性微生物，强调了足够数量的活菌。仔猪胃肠道为低pH、高胆盐的环境，因此，所应用菌株需具备一定的耐受性，到达肠道后，需能黏附小肠壁定殖才能发挥其作用。本实验分析比较了实验室保藏的3株罗伊氏乳杆菌的生物学特性，通过比较3株菌对低pH胃液和高胆盐环境的耐受性、对HT-29细胞的黏附性、抑菌能力和对抗生素的耐药性来选择一株生物学特性较好的菌株，为后期生产应用提供一定的参考。
1 材料与方法 1.1 材料1.1.1 实验菌株与细胞： Lactobacillus reuteri (罗伊氏乳杆菌)代号L0，分离自某罗伊氏乳杆菌产品；Lactobacillus reuteri (罗伊氏乳杆菌，CICC6118) 代号L1；Lactobacillus reuteri (罗伊氏乳杆菌，CICC6132) 代号L2；Escherichia coli (大肠杆菌，CICC10389) ；Staphylococcus aureus(金黄色葡萄球菌，CICC10384) 均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。结肠腺癌细胞系HT-29由中国科学院武汉病毒研究所赠送。
1.1.2 培养基： MRS培养基和LB培养基制备参见文献[7]。
1.1.3 主要试剂： 胃蛋白酶(酶活力1:10 000) 、胰蛋白酶(酶活力250 NFu/mg)、猪胆盐、牛肉浸粉、大豆蛋白胨、酵母浸粉、琼脂均为生化试剂；无水乙酸钠、氯化钠、盐酸、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、一水硫酸锰、柠檬酸铵均为分析纯；吐温80为化学纯。
1.1.4 主要仪器： DHG-9070A恒温培养箱购自上海索普仪器有限公司；I类B型医用型洁净工作台购自北京东联哈尔仪器有限公司；HQL150BLC恒温摇床购自武汉中科科仪技术发展有限公司；鼓风干燥箱购自上海索普仪器有限公司；HH-6数显恒温水浴锅购自常州温华仪器有限公司；分析天平购自梅特勒-托利多国际股份有限公司；722 s可见分光光度计购自上海精密科学仪器公司。
1.2 方法1.2.1 菌株鉴定： 将从罗伊氏乳杆菌产品中得到的菌株L0与购买的菌株L1、L2培养后涂布MRS平板，观察其菌落形态；简单染色后显微镜下观察菌体形态。然后将3株菌进行16S rRNA基因PCR扩增，并将扩增产物委托武汉市易航生物有限公司进行测序。登录NCBI将所得序列与已知序列进行比对。同时将所测得的序列采用MEGA 5.0软件进行系统发 育分析。
1.2.2 生长曲线和pH 曲线的比较： 将3株菌株活化后，按1%接种量接种于MRS液体培养基中，37 °C静置培养，分别在第0、3、6、9、12、15、18、21、24 h取样测定OD600和pH，比较3株菌的生长曲线和pH曲线。
1.2.3 耐受人工胃液能力的比较： 参照文献[8]配制人工胃液。将3株菌活化后，分别取1 mL接种于 9 mL人工胃液中，37 °C静置培养，0、30、180 min后分别用活菌平板计数法检测活菌数量。
1.2.4 耐受猪胆盐能力的比较： 分别配制0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的猪胆盐MRS液。将 3株菌活化后，分别取1 mL接种于9 mL不同浓度的猪胆盐MRS液，37 °C静置培养12 h，稀释 10 000倍后取100 μL涂布平板计数。若生长数目超过30个(3×106 CFU/mL)则表明其生长良好，能耐该浓度的胆盐；若生长数目在5−30个则表明其生长较差，耐该浓度胆盐能力差；若生长数目小于5个则表明其不生长，不能耐该浓度胆盐。
1.2.5 黏附HT-29细胞能力的比较： 将HT-29细胞置于含10%新生牛血清的DMEM细胞培养液中，在37 °C、5% CO2条件的培养箱中静置培养，每天更换培养液，5 d传代一次，15−20 d后进行黏附实验。将HT-29细胞接种于24孔培养板，静置培养过夜使其长成致密单层细胞，同时将3株罗伊氏乳杆菌接种于MRS液，37 °C静置培养过夜，将菌液3 000 r/min离心5 min后弃上清，加入DMEM液重悬菌体，调整菌液浓度为1×109 CFU/mL。将菌液加入24孔培养板与细胞孵育2 h，用PBS漂洗5次以除去未黏附的菌体，然后用胰酶将细胞从培养板中消化下来，稀释涂布MRS平板计数。
1.2.6 体外抑菌能力的比较： 分别将指示菌和罗伊氏乳杆菌接种于LB培养基和MRS培养基中，37 °C静置培养15 h。用乳酸调节MRS液的pH值，使其与罗伊氏乳杆菌发酵液的pH值相同，将其作为对照。取100 μL指示菌发酵液均匀涂布LB平板，待平板干后放置牛津杯，孔径为6.00±0.10 mm，在各牛津杯中分别加入罗伊氏乳杆菌发酵液和对照液，先于4 °C放置6 h，后置于37 °C培养箱18 h，观察有无抑菌圈并测定其直径[9]。
1.2.7 对抗生素耐药性的比较： 将3株菌活化后，按1%接种量接种于MRS液体培养基中，37 °C静置培养15 h，调整菌体浓度为1×109 CFU/mL，取100 μL涂布平板，待平板稍干后，用无菌镊子将药敏纸片贴于培养基表面，37 °C培养18 h后测定透明圈直径。
1.2.8 数据处理： 每组实验重复3次，结果表示为x±s。运用SPSS 19.0软件进行分析，采用单因素方差分析。
2 结果与分析 2.1 菌株鉴定3株菌在MRS平板上生长菌落均呈圆形，乳白色，表面光滑；显微镜观察菌体呈杆状。将获得的序列在GenBank中比对，3株乳酸菌16S rRNA基因PCR扩增产物比对结果：菌株L0与L. reuteri CICC 6119的16S rRNA基因序列的一致性达到了99% ，L1与L. reuteri ZJ615的16S rRNA基因序列的一致性达到了100%，L2与L. reuteri CICC 6132的16S rRNA基因序列的一致性达到了99%。初步鉴定3株菌为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)。通过系统发育树比较3株菌的亲缘关系，见图 1。
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| 图 1 基于16S rRNA 基因序列的系统发育树 Figure 1 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences |
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由图 2可知，3株罗伊氏乳杆菌的生长趋势大致相同，3株菌在0−3 h均生长缓慢，在3−9 h为对数生长期，OD600变化很大，菌株迅速增长，9 h后变化趋势趋于平缓。虽然生长趋势大致相同，但很明显3株菌的生物量区别较大，L0>L2>L1。3株菌的pH变化趋势基本相同，最终都稳定在4.5附近。
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| 图 2 罗伊氏乳杆菌的生长曲线和pH 曲线 Figure 2 Growth curve and pH curve of Lactobacillus reuteri |
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乳酸菌经口服进入受体内发挥作用，首先要能耐受低pH的胃液。通常胃液的pH值在3.0左右，流体食物在胃内停留的时间为1−2 h[10]。由表 1可以看出，3株菌都可以耐受pH 2.5的人工胃液达 180 min，活菌数高达109 CFU/mL，存活率均大于80%，说明3株菌都能较好地耐受低pH的胃液，可以顺利通过胃存活。
| 菌株 Strains | Time (min) | ||
| 0 | 30 | 180 | |
| L0 | 24.26±0.86 | 22.59±1.12** | 20.52±1.51** |
| L1 | 19.46±1.10 | 17.04±0.52** | 16.00±0.85** |
| L2 | 20.38±1.09 | 19.43±0.97 | 18.68±1.00** |
| 注：与本组0 min比较，表示差异显著(P<0.05) ，**表示差异极显著(P<0.01) . | |||
| Note: In a row,compared with 0 min,: P<0.05,**: P<0.01. | |||
乳酸菌通过低pH胃液后顺利进入小肠，小肠中因胆盐形成的高渗透压环境是另一障碍。小肠内的胆盐浓度在0.03%−0.30%的范围内波动[11]。由表 2可以看出，随着猪胆盐浓度的增加，菌株生长情况变差甚至不生长，L0和L2菌株在0.3 g/100 mL的猪胆盐培养基中均不生长，不能耐受高浓度的胆盐培养基，而L1菌株在0.4 g/100 mL的猪胆盐培养基中仍能生长良好，对胆盐具有良好的耐受能力。
| 菌株 Strains | 猪胆盐浓度 Bile salt concentration (g/100 mL) | ||||
| 0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 | 0.5 | |
| L0 | + | (+) | − | − | − |
| L1 | + | + | + | + | (+) |
| L2 | + | + | − | − | − |
| 注：+：生长良好；(+)：生长较差；-：不生长. | |||||
| Note: +: Growth well; (+): Weak growth; −: No growth. | |||||
乳酸菌在受体内发挥作用，除了能耐受胃肠道的不利环境，还需具有良好的黏附能力，能够在肠壁定殖并大量繁殖。由表 3可以看出，菌株L0黏附HT-29细胞能力较差，推测该菌株不能在肠道内良好定殖，菌株L1和L2黏附HT-29细胞能力很强，推测其可以顺利在肠道内定殖以发挥作用。
| 菌株 Strains | 黏附活菌数/100细胞 Adhesion bacterias/100 cells (±s) |
| L0 | 90.26±2.46 |
| L1 | 1 603.17±17.66 |
| L2 | 1 289.42±49.01 |
采用牛津杯法研究了3株罗伊氏乳杆菌对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌能力。3株菌发酵液最终pH值均为4.5左右。由表 4可以看出，3株菌对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均表现出一定的抑制特性，与对照组比较差异极显著，抑制金黄色葡萄球菌能力强于抑制大肠杆菌能力。
| 供试菌株 Tested strains | 大肠杆菌 Escherichia coli (mm) | 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus (mm) |
| CK | 11.58±0.17 | 8.00±0.10 |
| L0 | 14.06±1.08** | 15.19±0.91** |
| L1 | 14.76±1.24** | 15.08±0.66** |
| L2 | 14.00±1.12** | 15.23±0.58** |
| 注：各组与对照组比较，**：差异极显著(P<0.01) | ||
| Note: In a column,compared with CK,**: P<0.01. | ||
3株罗伊氏乳杆菌对不同类别药物敏感性试验结果见表 5。“S”代表敏感，表示由被测菌株所引起的感染可以用常用剂量该抗菌药物治愈；“I” 代表中介，表示被测菌株可以通过提高剂量被抑制，或在药物生理性浓集的部位被抑制；“R”代表耐药，被测细菌不能被常用剂量抗菌药物抑制，或属于具有特定耐药机理[12]。由表 5可知，该3株罗伊氏乳杆菌对一些抗生素的耐受性具有一定的差异，同时，对一些抗生素具有相同的耐受性，3株菌对呋喃唑酮、青霉素、苯咗西林、头孢拉定、诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、万古霉素、多粘菌素B等药物不敏感。所以，在动物日粮中罗伊氏乳杆菌可以选择与其不敏感的药物配合使用。
| 抗生素名称 Name of antibiotics | 纸片含药量 Dosage of drug (μg) | 抑菌圈判断标准 The standard of bacteriostatic circle (mm) | 菌株 Strains | ||||
| 耐药(R) Resistant | 中介(I) Intermediate | 敏感(S) Susceptible | L0 | L1 | L2 | ||
| 青霉素 Penicillin | 10 IU | ≤28 | − | ≥29 | R | R | R |
| 苯唑西林 Oxacillin | 1 | ≤10 | 11−12 | ≥13 | R | R | R |
| 氨苄西林 Ampicillin | 10 | ≤13 | 14−16 | ≥17 | I | S | S |
| 羧苄西林 Carbenicillin | 100 | ≤19 | 20−22 | ≥23 | R | I | S |
| 哌拉西林 Piperacillin | 100 | ≤17 | 18−20 | ≥21 | S | I | S |
| 头孢氨苄 Cephalexin | 30 | ≤14 | 15−17 | ≥18 | S | R | I |
| 头孢唑林 Cefamezin | 30 | ≤14 | 15−17 | ≥18 | R | S | S |
| 头孢拉定 Cefradine | 30 | ≤14 | 15−17 | ≥18 | R | R | R |
| 头孢呋辛 Cefuroxim | 30 | ≤14 | 15−17 | ≥18 | S | S | S |
| 头孢他啶 Ceftazidime | 30 | ≤14 | 15−17 | ≥18 | S | R | I |
| 头孢曲松 Ceftriaxone | 30 | ≤13 | 14−20 | ≥21 | S | I | I |
| 头孢哌酮 Cefoperazone | 75 | ≤15 | 16−20 | ≥21 | S | R | S |
| 麦迪霉素 Aboren | 30 | ≤14 | 15−18 | ≥19 | S | S | S |
| 诺氟沙星 Norfloxacin | 10 | ≤12 | 13−16 | ≥17 | R | R | R |
| 氧氟沙星 Ofloxacin | 5 | ≤12 | 13−15 | ≥16 | R | R | R |
| 环丙沙星 Ciprofloxacin | 5 | ≤15 | 16−20 | ≥21 | R | R | R |
| 万古霉素 Vancomycin | 30 | − | − | ≥17 | R | R | R |
| 多粘菌素B Polymyxin B | 300 IU | − | − | − | R | R | R |
| 复方新诺明 Compound sulfamethoxazole | 25 | ≤10 | 11-15 | ≥16 | I | R | R |
| 呋喃唑酮 Furazolidone | 300 | ≤14 | 15-16 | ≥17 | R | R | R |
生长曲线主要反映了一种微生物的生长状况和数量。研究发现，益生菌进入肠道之后，若其生长速度缓慢，则很难在微生物竞争中处于优势地位，成为优势菌群。在本实验中，3株罗伊氏乳杆菌均在3 h就已进入了对数生长期，说明它们都可以在肠道中迅速繁殖，占据优势地位。到9 h时，3株菌均达到了最大值，对数生长期较短，因此在
后期培养中，应补充营养物质以提高菌体浓度。 3株菌的最大值相差较大，菌株L0>L2>L1。3株菌的pH曲线大致相同，说明罗伊氏乳杆菌在生长过程中会产生有机酸，在菌株生长的对数期pH下降最快，说明菌株在对数期产酸最快，产酸过多会抑制菌体生长，因此，可以通过实时调节pH来增加菌体浓度。
乳酸菌经口服进入受体内发挥作用，首先要能耐受低pH的胃液。胃液中有胃酸及各种酶类，通常胃酸的pH在3.0左右。邵景海等[13]研究了一株罗伊氏乳杆菌对pH 2.5人工胃液的耐受性，处理 4 h后活菌数达到106 CFU/mL。李清等[14]研究了 一株乳酸菌对人工胃肠液的耐受性，在pH为2.5的人工胃液中处理3 h，活菌数接近108 CFU/mL，存活率31.62%。本实验中3株菌都可以耐受pH 2.5的人工胃液达180 min，活菌数高达109 CFU/mL，存活率均大于80%，比较其他研究，该3株菌对人工胃液具有极好的耐受性。
乳酸菌通过低pH胃液后顺利进入小肠，小肠中因胆盐形成的高渗透压环境是另一障碍。益生菌要在小肠中发挥益生调节功能，还需耐受一定浓度的胆盐作用[15]。本实验中，随猪胆盐浓度的增加，菌株生长情况变差甚至不生长，L0和L2菌株在 0.3 g/100 mL的猪胆盐培养基中均不生长，而L1菌株在0.4 g/100 mL的猪胆盐培养基中仍能生长良好，对胆盐具有良好的耐受能力，在后期对益生菌的研究中具有明显的优势。
乳酸菌黏附并定殖于肠黏膜上皮细胞是其发挥作用的首要条件，并且生理性细菌的黏附可能参与了正常菌群的生物屏障形成机制[16]。罗伊氏乳杆菌在肠道中的定殖具有普遍性，有研究表明，罗伊氏乳杆菌可以黏附人结肠的上皮细胞[17]。本实验对3株罗伊氏乳杆菌的黏附性进行了研究，菌株L0黏附HT-29细胞能力较差，不利于菌株在肠道内良好定殖，菌株L1和L2黏附HT-29细胞能力很强。李平兰[18]等研究了24株乳酸菌对HT-29细胞的体外黏附实验，乳杆菌中黏附能力最好的为黏附10.2±1.8个/细胞，本实验中L1可黏附16.03±0.18个/细胞，优于其黏附能力。说明该菌株可以顺利在肠道内定殖以发挥作用。
本文分析比较了3株罗伊氏乳酸菌的生物学特性。通过生长曲线和pH曲线的对比可以看出，在培养过程中适当的补充营养物质并及时调节培养pH可以有效地提高菌体浓度。3株菌对胃肠道环境具有良好的耐受性，并可以抑制胃肠道病原菌，和现有抗生素很好地配合使用。其中菌株L1相对其他两株菌株表现了更好的生物学特性，具有良好的胃液、胆盐耐受性，并能很好地黏附于小肠黏膜。因此，菌株L1在益生菌研究方面具有极大的应用潜力。
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