稻瘟病(Blast disease of rice)是由稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)引起的水稻真菌性病害，是最严重的水稻病害之一，一般减产10%−20%，严重时可达40%−50%，大暴发时甚至颗粒无收^[1]。由于稻瘟病菌个体微小、种类繁多、繁殖迅速且受地理和气候影响，治理起来较为困难。目前，治理稻瘟病主要采用抗病品种、化学药剂和栽培管理，其中化学药剂防治造成环境污染、成本高、诱导病原菌产生抗性^[2]，不符合绿色农业发展需求。因此，探索新的防治方法迫在眉睫。

植物内生菌(Endophytes)是指能够在健康植物各器官或组织内度过其生活史的全部阶段或某一特定阶段的一类微生物。内生菌种类繁多，内生菌与宿主植物经长期协同进化，形成互惠互利、相互依存的关系^[3]。它们能促进植物根系发育和发挥固氮作用，为寄主提供更多营养^[4]；提高寄主抗病防病能力^[5]。顾沛雯^[6]研究抗植物病害的内生菌次级代谢产物并提出研发新农药的思路。吴海燕等^[7]研究表明大豆根瘤内生菌次级代谢产物对大豆胞囊线虫有一定抑制作用。此外，课题组前期研究^[8]表明，大豆根瘤内生菌具有溶磷、产植物激素及促进生长功能；野生艾蒿不同部位内生细菌对稻瘟病的抑制作用不同^[9]；枸骨内生菌对稻瘟病菌最大抑制率可达51.7%^[10]。利用植物内生菌防治植

物病害、促进生长已引起广泛关注^[11]。大豆属于大宗经济作物，在河南有较大种植面积，而大豆根部有特殊组织——根瘤，在根瘤微环境内根瘤菌和宿主形成共生固氮体系，与其共处微环境的还有丰富的内生菌资源，大豆根瘤内生菌为新型、高效和安全活性的生物药剂研制提供了丰富的微生物资源。水稻属于我国大宗粮食作物，在河南主要分布在信阳、新乡、原阳以及黄河沿岸。在水稻根部和大豆根系具有交叉的微生物群系，水稻和大豆间套可提高粮食产量。但目前，关于大豆根瘤内生菌抑制稻瘟病菌的研究未见报道。本试验通过对大豆根瘤内生菌的拮抗性筛选、分子鉴定，筛选出稻瘟病拮抗性内生菌株，为稻瘟病生物防治提供新的菌种资源。

供试菌株：稻瘟病菌MG102 (Magnaporthe grisea)由西北农林科技大学生命科学学院惠赠，以菌核形式保藏在−70 °C，传代采用PDA (马铃薯蔗糖琼脂培养基)^[10]，28 °C培养2 d；根瘤内生菌分离自河南部分地区采集的大豆根瘤(由本实验室分离纯化、保藏)。水稻品种：Y两优66 (豫审稻2014007，购自信阳市浉河区申丰种子批发站)。

用接种针挑取菌丝转接至PDA平板中央，28 °C恒温倒置培养3−5 d，待长满平皿后，用无菌打孔器(直径5 mm)选择同心环上生理年龄一致的菌苔打取菌饼，转接到PDA平板中央，倒置在恒温箱中28 °C培养待用。采用对峙培养法^[10]测定内生菌对稻瘟病菌的拮抗作用。在培养2 d的稻瘟病菌饼四周2.5 cm处分别接种5种不同内生菌，以不接内生菌的平板为对照。培养48 h后第一次测量并记录抑菌圈大小及对照直径，以后每隔24 h进行一次测量记录，记录3次。抑制率计算公式为：抑制率(%)=(对照菌落直径−处理菌落直径)×100/(对照菌落直径)^[10]。

复筛方法和初筛基本相同，不同之处在于：(1) 同一平板上病原菌周围等距离处点接的是同一株菌，以接等量无菌水的平板为对照。(2) 点接的是菌悬液。用LB液体培养基^[8]培养菌体并制备菌悬液，用分光光度测定并调整OD₆₀₀≈1 (大约 10⁻¹⁰ CFU/mL)，用移液器点接10 µL于病原菌菌落周围，同一株菌点接3次，培养48 h后测量并记录受抑制病原菌直径大小及对照直径，每隔24 h测量一次，测量3次，计算抑制率。

筛选复筛抑制作用较强的菌株，采用复筛方法培养24 h，在倒置显镜微镜下研究病原菌菌丝变化，观察并拍照记录结果。

筛选7株抑制效果明显的菌株，在牛肉膏蛋白胨固体培养基^[8]上30 °C培养4−5 d后，进行革兰氏染色，用显微镜观察染色结果，并测定菌株大小以及生理生化等表型特征，记录细胞形态、菌落特征及反应结果^[12]。

采用50 μL扩增体系^[13]：2×Taq Master Mix (0.1 U/μL Taq DNA polymerase，3 mmol/L MgCl₂，0.4 mmol/L dNTPs，2× PCR反应缓冲液) 25 μL，正向引物P₁ 10 μmol/L 1 μL，反向引物P₆ 10 μmol/L 1 μL，DNA模板2 μL，ddH₂O 21 µL。扩增条件：94 °C 5 min；94 °C 1 min，55 °C 1 min，72 °C 2 min，36个循环；72 °C 10 min。PCR产物经电泳、测序(北京奥科生物有限公司)。将测序结果放在GenBank数据库中进行相似性比对，用软件Clustalx 2.1和Treeconw进行系统发育树构建，利用DNAMAN软件进行相似性比较。

选饱满、无霉变种子用无菌水浸泡，置28 °C温箱中催芽48 h，待种子露白后播种在盛无菌有机营养土的花盆内(每盆干重200 g)，置于28 °C光照培养箱内培养2 d，待发芽整齐置于22−32 °C的强光照(20 000 lx)下培养。本试验主要调查叶瘟，筛选优良菌株制成菌悬液(5×10⁸ CFU/mL)，喷洒在水稻苗上，以叶面布满雾点为宜。每菌株重复3次，每重复处理5株稻苗。用无菌水接种的苗子为对照组(CK)，3 d后悬滴法^[14]接种病原菌MG102孢子悬液。严重程度分级标准如下：0级，无病症，不致病，叶色油绿；1级，病斑有针尖大小，0−0.5 mm，叶色绿色；2级，病斑直径0.5−2 mm，叶色黄绿； 3级，病斑直径2−4 mm，叶色泛黄色；4级，病斑直径4 mm以上，叶色局部发白。病情指数(%)= ∑(病害等级×该级叶数)/(调查叶数×最严重等级)×100；防治效果(%)=[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100。统计各菌株的叶片接种点发病率、发病严重度和病情指数，结果用SPSS 11.0软件进行统计分析。

从大豆根瘤中分离的内生细菌共276株，采用对峙培养法筛选对稻瘟病有拮抗作用的菌株(图 1)。培养6 d后记录初筛结果，抑制率在36%以上的有30株，见表 1。有16株菌抑制率大于45%，其中菌株DD160、DD266、DD299最大抑制率均为58.82%。

图 1　内生菌株对稻瘟病菌拮抗作用 Figure 1　Inhibitory effect of endophytic bacteria against Magnaporthe griseaas A：对照菌落； B：DD160抑菌作用；C：DD266抑菌作用；D：DD192抑菌作用. A: Colony of comparison; B: Inhibitory effects of DD160; C: Inhibitory effects of DD266; D: Inhibitory effects of DD192.

图选项

对初筛获得的30株对稻瘟病抑制作用明显的菌株进行复筛。在恒温箱中28 °C培养120 h后，复筛结果如表 2所示。有17株菌抑菌率在46%以上，其中菌株DD160、DD266、DD299抑菌率均为最大，达62.16%。

稻瘟病菌受大豆根瘤内生菌拮抗作用，引起菌丝发生明显变化(图 2)。对照病原菌菌丝粗直、健壮(图 2A)，受作用菌丝呈现瘤状、断裂、弯曲打结、原生质浓缩成球状等畸形状态。DD160对稻瘟病产生抑制作用使菌丝呈瘤状(图 2B中a)；DD266沿稻瘟病菌丝方向产生生物薄膜，包埋稻菌丝并使其降解(图 2C中b、c)；DD299使作用菌丝细胞壁溶解，菌丝断裂，成段存在(图 2D中d、e)；DD192使稻瘟病菌丝弯曲，呈树根状，且有打结现象(图 2E中f)；DD159使病原菌菌丝末端原生质浓缩呈球状且断裂(图 2F中g、h、i、j)。

图 2　大豆根瘤内生菌对稻瘟病菌的拮抗作用 Figure 2　Antagonistic effects of endophytic bacteria from soybean nodules against Magnaporthe grisea A：正常菌丝；B：DD160处理后菌丝出现瘤状；C：菌丝被DD266形成的生物薄膜包埋；D：DD299处理后菌丝断裂；E：DD192处理后菌丝畸形弯曲打结；F：DD159处理后菌丝末端原生质浓缩、断裂. A: Normal hyphae; B: Hyphae showed nodules shape after inoculated with DD160; C: Hyphae were buried with biofilm formed by DD266; D: Hyphae become fractures under treatment with DD299; E: hyphae become deformity,bending and knot under treatment with DD192; F: Hyphal tips become sphere due to protoplasm concentration and fractures under treatment with DD159.

图选项

对复筛抑菌率大于52%的10株菌进行理化特性以及菌体形态进行研究，结果见表 3。所有菌株对接触酶、D-葡萄糖产酸、肉汤反应均为阳性；V-P试验除DD290外其余均为阳性，L-阿拉伯糖产酸DD290、DD303、DD266反应均为阳性，对D-甘露醇利用除DD160均为阳性反应，DD201、DD232、DD290、DD299均能利用木糖，淀粉酶反应DD201和DD290为阴性，其余菌株均可代谢产生淀粉酶；苯丙氨酸脱氨酶只有DD290、DD303、DD192反应为阳性，菌株DD160、DD299、DD30、DD192、DD159能产生卵黄磷脂酶，反应为阳性。除DD201、DD232、DD192外其余菌株硝酸还原酶反应阳性；除DD232、DD192、DD260外其余菌株均能产生对酪素分解。大部分菌株对酪氨酸水解和柠檬酸盐利用反应阳性。菌体DD159、DD260大小为(0.3−1.1) μm × (0.6−1.5) μm，呈短杆状，其他菌株大小为 (0.5−1.2) μm×(1.0−6.5) μm，呈杆状。经革兰氏染色，菌株DD160、DD299、DD192为革兰氏阳性，呈紫色，且有芽孢。

对复筛中抑菌率大于52%菌株进行16S rRNA 基因PCR产物电泳检测，均获得1 500 bp片段，送测序公司获得核苷酸序列，构建系统发育树(图 3)、序列同源性比对(表 4)。由图 3可知，整个系统发育树中测试菌株分布在7属9种，DD201、DD232、DD290在系统发育树上均位于分支Ⅰ，与假单胞菌属(Pseudomonas)为同一个分支，菌株DD201、DD232与蒙氏假单胞菌P. monteilii CIP 104833^T距离最近，最大相似率为99.5%；菌株DD290与P. migulae CIP 105470^T相距很近，最大相似率为99.2%。结合细胞形态和理化特性，菌株DD232、DD201最相似率菌株为蒙氏假单胞菌(P. monteilii)，DD290为米氏假单胞菌(P. migulae)。菌株DD266位于系统发育树分支Ⅱ上，与肠杆菌属(Enterobacter)为同一个分支，且与阴沟肠杆菌(E. cloacae) ATCC 10347^T相距最近，最大相似率为99.0%。结合细胞形态和理化特性，菌株DD266最相似菌株为阴沟肠杆菌(E. cloacae)。DD299位于系统发育树分支Ⅲ，与寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)为同一个分支，且与嗜麦芽寡养单胞菌S. maltophilia D299序列最大相似率为100%。结合细胞形态和理化特性，菌株DD299最相似菌株为嗜麦芽寡养单胞菌(S. maltophilia)。DD303位于系统发育树分支Ⅳ，该分支为苍白杆菌属(Ochrobactrum)，与小麦苍白杆菌O. tritici DSM13340^T序列最大相似率为98.2%。结合细胞形态和理化特性，DD303最相似率菌株为小麦苍白杆菌(O. tritici)。DD260位于系统发育树分支Ⅴ，与农杆菌属(Agrobacterium)为同一分支，且与根癌土壤杆菌(A. tumefaciens LM6-1) 相距最近，二者序列最大相似率为100%。结合细胞形态和理化，菌株DD260最相似菌株为根癌土壤杆菌(A. tumefaciens)。菌株DD192、DD159位于发育树分支Ⅵ，该分支为芽孢杆菌(Bacillus)，菌株DD192与巨大芽孢杆菌B. megaterium JBS-4距离最近，最大相似率为100%，结合细胞形态和理化特性，菌株DD192最相似菌株为巨大芽孢杆菌(B. megaterium)；DD159与蜡状芽孢杆菌B. cereus DD28距离最近，且二者最大相似率为99.9%。结合细胞形态和理化，菌株DD159最相似菌株为蜡状芽孢杆菌(B. cereus)。DD160在系统发育树上位于分支Ⅶ，属于短芽孢杆菌属(Brevibacillus)，与短短芽孢杆菌B. brevis DSM30^T最大相似率为99%。结合细胞形态和理化特征，菌株DD160最相似菌株为短芽孢杆菌(B. brevis)。

图 3　基于16S rRNA 基因序列构建的系统发育进化树 Figure 3　The phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence by Neighbor-Joining method 括号内为菌株的16S rRNA 基因序列在GenBank中的登录号；分支上数字表示自举值(构建系统树时1 000次计算时形成该节点的百分比)；标尺表示100个核苷酸有1个替换. The numbers in parentheses represent the accession numbers in the GenBank for the 16S rRNA gene sequences of those reference strains and screened strains. The numbers in the branching points are bootstrap values (expressed as percentages of 1 000 replications; only values above 50% are shown). The scale bar indicates 0.01 substitutions one percent nucleotide position with their 16S rRNA gene sequences.

图选项

盆栽试验表明，10 d后对照组出现明显病状，叶片出现水渍状暗绿小点，扩大成短椭圆形且有灰绿色霉斑出现。发病率为72.24%。而内生菌处理组，只有部分叶片的接种点变暗绿色，整片也仍为绿色，发病程度较轻。由表 5可知，DD160、DD266和DD299处理的稻苗整体上发病率和病情指数均明显降低，发病率均小于30%，病情指数在20%以下，防治效果均在66%以上。另外，14 d观察DD160处理的稻苗，叶色逐步正常，病斑面积不再扩大，生长趋于正常；而对照组叶片病斑面积扩大，植株生长受到严重影响。总之，拮抗性内生菌菌株处理组的病情指数和防治效果与对照相比，防病效果在p<0.01水平上达极显著性降低，可作为稻瘟病病菌潜在的生防菌株资源。

以稻瘟病菌为靶标菌，从大豆根瘤内生菌中进行筛选，有18株抑制率达21%以上，占总菌数的6.6%，其中4株抑制率在30%以上。结果表明对稻瘟病拮抗效果明显的内生菌分布在7属9种，为稻瘟病菌的生物防治提供了丰富的微生物资源。DD160属于短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)，广泛存在土壤、水等环境中，曾大兴等^[15]对枯草芽孢杆菌研究表明，芽孢杆菌发酵原液对病原菌孢子萌发有较强抑制作用，从而抑制病原菌的传播、蔓延。Leelasuphakul等^[16]表明芽孢杆菌对不同植物病原真菌和细菌有防治作用，如对水稻纹枯病、稻瘟病、小麦纹枯病、豆类根腐病、水稻穗颈温、小麦全蚀病等。DD192、DD159属于芽孢杆菌属(Bacillus)菌株，吕黎等^[17]研究表明巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)能产生伊枯草菌素(Iturin A₂)对水稻纹枯病、烟草灰霉病、香蕉灰斑病都有一定防治作用。Kanjanamaneesathian等^[18]以Bacillus megaterium为基础开发的生物防治产品田间试验表明，对稻瘟病、水稻纹枯病都有很好的防治效果，在泰国当地正在推广和大力减少使用杀菌剂。蛋白组学分析^[19]表明，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)细胞和培养液上清蛋白中含有内切-1,4-β-葡聚糖酶，参与多糖降解产生的甘油酸-3-磷酸脱氢酶和丝氨酸蛋白酶对抑制稻瘟病菌活性发挥重要作用。蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)次生代谢产物具有丰富的生物学功能多样性^[20]。Lodewyckx等表明能产生高活性的酶类^[21]、小分子量表面活性剂、多肽类抗真菌活性物质等^[22]，对特定病原菌产生具有活性的抗生素；而地衣芽孢杆菌(B. licheniformis)分泌的脂肽(表面活性剂)，可诱导稻瘟病菌形态发生变化，阻碍其进一步生长，表现出杀菌剂活性，可作为潜在的稻瘟病抑制剂^[23]。菌株DD201、DD232、DD290均属于假单胞菌属(Pseudomonas)，该属菌株广泛分布在土壤、植物根际及植物组织内。假单胞菌能产生特异性抗菌化合物藤黄绿菌素(Pyoluteoin)和二乙酰间苯三酚(2,4-diacetylphloroglucinol)对稻瘟病菌、棉花黄萎病菌等有抑制作用^[24]。Spence等^[22]体外试验表明，假单胞菌EA105能减少90%稻瘟病菌附着胞形成，直接抑制76%病原菌生长，并且单独产生HCN，活体试验表明降低稻瘟病33%损害，激起宿主诱导系统抗性产生茉莉酸和乙烯。Jha等^[25]表明利用Pseudomonas pseudoalcaligenes在稻瘟病出现时单独接种和联合接种都能产生防御相关酶如几丁质酶、多酚氧化酶、多聚过氧化物酶，抑制菌丝生长、完全阻止病菌附着胞的形成，而且诱导宿主产生系统抗性，从而抑制稻瘟病的暴发。因此，假单胞菌属是抑制稻瘟病的另一类潜在的内生菌资源。DD299属于嗜麦芽寡养单胞菌(S. maltophilia)，Jha等^[26]分离自水稻根部的拮抗性细菌嗜麦芽寡养单胞菌不仅对稻瘟病菌抑制效果明显，且单独接种或复合接种都能提高水稻生长指标。已有研究表明寡养单胞菌对真菌性植物病菌都有潜在的生物控制作用，大多数菌株具有抗真菌活性^[27]、产生新的抗真菌化合物maltophilin、xanthobaccin^[28]，产生抗真菌的挥发性有机化合物(VOC_S)^[29]、超常水解活性、多样化蛋白酶、几丁质酶、葡聚糖酶、DNA酶、RNA酶、酯酶和漆酶等^[30-31]。这些酶类水解病原真菌细胞壁，菌丝因缺乏机械强度末端膨大变形，原生质浓缩，最终导致其死亡；此外，可激发宿主防御机制^[32]。

在筛选过程中，大豆根瘤内生菌处理病原菌，菌丝呈现扭曲打结、细胞壁溶解、菌丝断裂、原生质浓缩、末端分枝增多等畸形现象，可能机制有：(1) 竞争生态位。内生菌和病原菌有相同或相似生态位，内生菌与病原真菌生长在同一个PDA培养基上，二者在营养上形成竞争，使病原菌因缺乏营养萎缩、发生畸变。菌株DD160、DD192拮抗病原真菌使其菌丝扭曲打结现象。Loaces等^[33]研究表明分离自水稻的假单胞菌具有拮抗活性，能产生铁载体与病菌竞争铁元素，导致病菌因得不到铁而受抑制。(2) 产生水解酶类。内生菌能产生水解酶类，如几丁质酶和水解酶。病原真菌细胞壁主要为几丁质和葡聚糖，这些水解酶破坏真菌菌丝细胞壁以及尖端新合成几丁质，导致细胞壁变薄、因壁受力不均出现局部原生质浓缩。如DD299、DD159拮抗病原菌使其菌丝细胞壁溶解、菌丝断裂、原生质浓缩的现象。曾大兴等^[15]研究表明防治水稻稻瘟病内生菌Pseudomonas fluorescens产生的几丁质酶和葡聚糖酶的水平与它的防病效果有密切关系。(3) 产生抗生素及化感物质。内生菌通过自身代谢产生抗生素类物质，对植物病原菌具有防病、抗病作用。徐亚军等^[9]表明根系内生菌产生的抗生素类物质，如2,4-二乙酞藤黄酚(PHL)、吩嗪羧酸(PCA)、杀菌性挥发物(VOS)等，对小麦全蚀病菌有较强的抑制作用。分离自芽孢杆菌的抗生素肽类iturinA以及多烯大环内酰亚胺A可干扰和阻碍病原菌菌丝和孢子的形成^[34]。(4) 形成生物薄膜。生物膜是内生菌附着于表面或彼此吸附形成复杂胞外多聚物质的矩阵，并对其包埋的状态，以适应特定生存环境或生长阶段的需要^[35]。细菌高种群密度可执行单细胞无法完成的特有程序，如分泌某种代谢物和胞外酶，当达到一定阈值浓度就对病原菌发挥作用。如枯草芽胞杆菌6051能在拟南芥根系形成生物薄膜，敲除6051的表面活性素合成基因后，成膜能力下降，失去对病害的防治能力，证实生防菌在根系形成生物薄膜对植物病害防治具有重要意义^[36]。DD266在培养基表面形成生物薄膜对病原菌丝进行包埋(图 2C)，阻碍菌丝生长并将其溶解。

由于内生菌具有提高植物抗病性、与病原菌竞争生态位或产生拮抗物质等功能，被广泛的研究和探讨。但利用豆科植物特殊结构——根瘤内生菌资源探索生物防治资源的研究较为薄弱，生防作用机理还需进一步通过代谢组学和转录组学深入研究。因此，本研究筛选对稻瘟病具拮抗作用的大豆根瘤内生菌，并对其拮抗作用初步研究，为探索内生菌与病原菌的互作机制、研发生物防治菌剂提供了微生物资源。