乳酸菌是指能利用可发酵碳水化合物并产生以乳酸为主要代谢产物的革兰氏染色阳性、不运动、不产气、无芽孢，兼性厌氧或厌氧性细菌的总称^[1]。乳酸菌是一种习惯叫法，但不是微生物分类学上的名称。乳酸菌通常包括乳杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Streptococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)、双歧杆菌属(Bifidbacterium)和肠球菌属(Enterococcus)。其中，乳杆菌属、双歧杆菌属、肠球菌属、链球菌属和乳球菌属中部分菌种，由于其能够在寄主肠道存活生长，并且通过改善其寄主肠道微生物平衡的作用而有益于寄主，所以又称其为原生菌或益生菌(Probiotics)^[2]。

内蒙古地区牧民长期饮用的酸牛奶，俗称“老酸奶”，就是以鲜牛奶为原料，未经任何处理在自然环境中发酵而成的乳制品。酸牛奶口味酸甜细滑，营养丰富，当地的人们一直认为这种靠自然发酵的乳制品是安全的并且具有治疗疾病的功效。而在一些研究中发现从自然发酵的乳制品中分离的乳酸菌具有强烈的抑菌特性，从而抑制与食品安全有关的革兰氏阳性和阴性细菌的生长^[3-4]。同时，酸牛奶能降低血清胆固醇含量，预防由冠状动脉硬化引起的心脏病^[5]。此外，还具有抗癌抗肿瘤、提高免疫力、调节炎症反应、延缓衰老等功效^[6]。

本试验对内蒙古呼伦贝尔地区传统发酵乳制品中乳酸菌资源的生物多样性进行了研究，不仅能够了解该地区几千年流传下来的传统发酵乳制品中乳酸菌的组成和种类，同时可以丰富我国的乳酸菌菌库，特别是为更好地筛选一些益生特性及发酵特性较好的乳酸菌奠定了基础。

1 材料与方法 1.1 样品来源

研究所用的8份传统发酵乳制品是由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室的研究人员于2014年8月5日−2014年8月7日，在内蒙古呼伦贝尔市鄂温克旗5个地区采集的，具体采样信息见表 1。样品采集后低温保存，带回实验室于−80 °C超低温保藏，进行后续实验。

1.2 培养基及主要试剂

用于分离乳酸菌的培养基为MRS固体培养基(288210，美国BD)，购于无锡赛维技术有限公司；MRS液体培养基(CM0359，英国OXOID公司)、M17固体培养基(CM0785B，英国OXOID公司)、M17液体培养基(CM0817B，英国OXOID公司)，购于上海汉尼生物技术有限公司；蛋白酶K、DNA聚合酶，购于北京全式金生物技术有限公司；10×EasyTaq Buffer、DNA Marker，购于大连宝生物技术有限公司(TaKaRa)；PCR引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。

1.3 样品采集

采集样品时将液体发酵乳制品混匀，取1.5 mL置于螺口冻存管(内含0.5 g灭菌中和剂，淀粉:碳酸钙=50:1，质量比)中，混合均匀并标号；再用接种环将混合好的样品接种到斜面MRS固体培养基上，标号记录采样地点后封口低温(4 °C)储存。带回实验室尽快进行乳酸菌的分离及微生物组成的分析。

1.4 样品中乳酸菌的计数

在无菌条件下，用灭菌枪头吸取0.5 mL液体样品于4.5 mL的生理盐水(质量分数0.85%)中，充分混匀，以10倍稀释法对其进行梯度稀释后，吸取1 mL稀释度为10⁻⁵、10⁻⁶、10⁻⁷的稀释液于无菌培养皿中(每个稀释梯度做2个平行)，然后倒入已经灭菌并处于保温状态的几种不同的培养基，向每个平皿中倾注20 mL，旋转平皿，小心混合样品稀释液与培养基。待平板中培养基冷却凝固后，倒置平皿放入厌氧培养罐中(气体条件为CO₂:H₂:N₂=10:10:80) 并置于30 °C培养48−72 h。菌落形成后，选择菌落数在30−300之间的平板，进行计数^[7]。

1.5 乳酸菌的组成分析、分离纯化与保存

乳酸菌计数：采用倾注法。将样品用漩涡振荡器混匀，用0.85%的无菌生理盐水以10倍稀释法对样品进行梯度稀释，分别选取稀释度为10⁻⁵、10⁻⁶、10⁻⁷的稀释液1 mL于无菌培养皿中，与MRS和M17平板计数培养基混匀，置于30 °C恒温培养箱中倒置厌氧培养48 h。然后计数即为每毫升样品的菌落数^[8]。

将上述梯度为10^-5、10^-6、10^-7的稀释液分别涂布于含有0.01% (体积比)放线菌酮的无菌MRS、M17固体培养基上，30 °C厌氧培养48 h，挑取形态学特征不同的单个菌落于相应的液体培养基中，30 °C培养24 h。选取过氧化氢阴性、革兰氏阳性的纯培养物，加入含0.1%谷氨酸钠的脱脂乳保护剂，分装于无菌安瓿管中和冻存管中于−80 °C保存，备用^[9]。

1.6 乳酸菌基因组DNA的提取以及纯度检测

纯化好的菌株用CTAB法和冻融法相结合提取基因组DNA^[8-9]。使用ND-1000型微量紫外分光光度计检测基因组DNA的浓度和纯度。

1.7 乳酸菌16S rRNA 基因的PCR 扩增

PCR扩增16S rRNA基因所用引物为通用引物，正向引物为FA-27F (5′-GCAGAGTTCTCGGA GTCACGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)；反向引物为RA-1495R (5′-AGCGGATCACTTCACA CAGGACTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)^[10]。

16S rRNA基因的PCR扩增体系：5 μL 10×EasyTaq Buffer (含Mg²⁺)；4 μL High Pure dNTPs (2.5 mmol/L)；1.5 μL引物FA-27F (10 mmol/L)；1.5 μL引物RA-1495R (10 mmol/L)；0.5 μL EasyTaq DNA polymerase (5 U/μL)；2 μL DNA模板(100 mg/L)；35.5 μL ddH₂O。

16S rRNA基因的PCR扩增条件：94 °C 5 min；94 °C 1 min，58 °C 1 min，72 °C 2 min，30个循环；72 °C 10 min^[11]。扩增反应完毕后，取约2 μL的PCR扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，若在1 500 bp处有清晰的扩增条带且无拖尾、弥散现象，则PCR扩增成功。

1.8 16S rRNA 基因序列测定和构建系统发育树

将检测后片段长度约为1 500 bp的阳性产物直接送上海美吉生物科技有限公司进行序列测定。采用DNAStar 5.01软件中的SeqMan模块，对所测得菌株的两条16S rRNA基因序列进行整理、拼接、校准，得到1 300 bp左右的有效序列，于NCBI数据库中利用BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)工具与GenBank数据库中已知菌株的16S rRNA基因序列进行比对鉴定^[12]，寻找同源性最高的已知分类学地位的菌种。

利用软件Mega 6.0中的Neighbor-Joining法对24株乳酸菌作系统进化树，比较它们之间的亲缘关系进化距离^{[7, 13]}。

2 结果与分析 2.1 乳酸菌计数

样品活菌数显示了样品的新鲜程度或在储运过程的保存状况，由表 2可知从内蒙古呼伦贝尔地区采集的样品活菌数在6.80−9.00 lgCFU/mL之间。有2份样品活菌数大于10⁷ CFU/mL，有4份样品活菌数大于10⁶ CFU/mL，其余2份样品小于10⁶ CFU/mL。大部分样品的活菌数高于 10⁶ CFU/mL，符合新的酸奶国家标准和国家卫生标准，有利于进一步分离与研究。由于本次采样并未按照特定时间点进行，是随机采样，有的样品发酵和贮藏时间长，有的样品发酵和贮藏时间短，所以其中乳酸菌活菌数量存在较大差异。李道敏等^[14]对木糖醇酸奶发酵、贮藏期间质量变化做过研究，闫志国^[15]对发酵乳在贮藏期间的理化性质的变化也做过详细报道，均阐述自然发酵乳制品中微生物随着发酵和贮藏时间的延长，乳酸菌种属和数量有较大的变化。

2.2 乳酸菌的鉴定结果

2.2.1 乳酸菌的表型特征： 从8份传统发酵乳制品中分离出革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性的疑似乳酸菌菌株24株。在MRS固体培养基上，菌株的菌落形态均为乳白色、边缘规则的圆形菌落，菌落直径为1.0−1.5 mm，有些菌落表面光滑，有些菌落表面较粗糙。对分离出的24株菌株进行革兰氏染色，并在100倍油镜下观察菌体特征。结果表明，供试菌株均为革兰氏阳性菌株，其菌体形态各有不同，有球状的有杆状的，排列方式有单个、短链和成对。

2.2.2 菌种DNA 提取和16S rRNA 基因扩增： DNA浓度和OD_260/280的测定：OD_260/280值在1.8−2.0间即为纯DNA样品。将其浓度稀释至100 mg/L后进行16S rRNA基因扩增。

对乳酸菌分离株16S rRNA基因进行扩增。经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，可以观察到在大约 1 500 bp的位置处有一条清晰明亮的条带，并且无弥散现象，无明显非特异扩增现象。这表明菌株的16S rRNA基因扩增产物可以满足测序的要求。将16S rRNA基因扩增产物送上海美吉生物科技有限公司测序。所有的16S rRNA基因序列都与GenBank数据库中的标准菌株有99%及以上的相似度。

2.2.3 系统发育树的构建和乳酸菌鉴定： 为了将待测菌株鉴定到种，登录NCBI中的Blast分析所有待测菌株的16S rRNA基因的核苷酸序列。再将拼接好的序列上传到GenBank数据库中。利用MEGA 6.0 (http://www.megasoftware.net)软件进行乳酸菌模式株和分离株系统发育关系研究和系统进化树构建。内蒙古呼伦贝尔地区传统发酵乳制品中分离菌株用Mega 6.0构建系统发育树，如图 1所示。

从图 1中可以看出菌株IMAU11180、IMAU11181、IMAU11184、IMAU11204和IMAU11201与标准菌株Lactobacillus paracasei ATCC 25302^T聚为一类，且相似性为100%或99%，将其鉴定为Lactobacillus paracasei。菌株IMAU11190与标准菌株Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469^T聚为一类，且相似性为100%，因此可将其归为Lactobacillus rhamnosus。菌株IMAU11191、IMAU11209和IMAU11205与标准菌株Lactobacillus plantarum ATCC 14917^T聚为一类，且相似性为100%，故将其鉴定为Lactobacillus plantarum。菌株IMAU11197和IMAU11200与标准菌株Lactobacillus kefiri LMG 9480^T聚为一类，且相似性分别为100%和99%，因此可将其归为Lactobacillus kefiri。菌株IMAU11193与Enterococcus faecium LMG 11423^T聚为一类，且相似性为100%，因此将其鉴定为Enterococcus faecium。菌株IMAU11195和IMAU11199与标准菌株Lactobacillus kefiranofaciens DSM 5016^T聚为一类，且相似性分别为99%和100%，因此可将其归为Lactobacillus kefiranofaciens。菌株IMAU11185、IMAU11186、IMAU11192、IMAU11202、IMAU11207和IMAU11183与标准菌株 Lactococcus lactis subsp| lactis ATCC 19435^T聚为一类，且相似性为100%或99%，故将其鉴定为Lactococcus lactis subsp| lactis。菌株IMAU11203 和IMAU11194与标准菌株Streptococcus thermophilus ATCC 19258^T聚为一类，且相似性为100%，因此可将归为Streptococcus thermophilus。菌株IMAU11208和IMAU11187与标准菌株Leuconostoc mesenteroides subsp| dextranicum ATCC 19255^T聚为一类，且相似性为100%，因此将其鉴定为Leuconostoc mesenteroides subsp| dextranicum。

2.3 内蒙古呼伦贝尔地区传统发酵乳制品中优势菌种分析

8份乳制品共分离出24株乳酸菌，分别为9个种及亚种。内蒙古呼伦贝尔地区8份乳制品样品的菌株分离鉴定结果见表 3。

由表 3可知，8份样品中有4份样品能够分离得到Lactococcus lactis subsp| lactis，且共分离得到6株，占总分离株的25%，说明Lactococcus lactis subsp| lactis为呼伦贝尔地区发酵乳制品中乳酸菌的优势种。3份样品中能够分离得到Lactobacillus paracasei (20.83%)，3份样品中能够分离得到Lactobacillus plantarum (12.5%)，其他菌种，包括：Enterococcus faecium、Lactobacillus kefiranofaciens、Lactobacillus kefiri、Lactobacillus rhamnosus、Leuconostoc mesenteroides subsp| dextranicum、Streptococcus thermophilus在样品中分离数量相对较少。值得一提的是，Lactobacillus rhamnosus只有在酸马奶中分离，而在酸牛奶中没有。由于本次采样酸马奶的样本较少，需在以后的研究中改进。由表 3还可以得出，内蒙古呼伦贝尔地区酸牛乳样品中，共分离出8个种18株菌，其中Lactobacillus paracasei为优势菌群，占酸牛乳总分离株的22%。而酸马奶样品中，共分出4个种6株菌。其中Lactococcus lactis subsp| lactis为优势菌群，占酸马奶总分离株的50%。

综上所述，本研究传统乳制品样品中的优势菌株为Lactococcus lactis subsp| lactis，其次分离菌株数较多的是Lactobacillus paracasei。本研究与一些文献报道一致。卿蔓君研究内蒙古东部地区发酵酸牛乳中发现Lactobacillus helveticus、Lactococcus lactis subsp| lactis、Lactobacillus casei和Leuconostoc mesenteroides subsp| mesenteroides 为其中的优势菌株^[16]。雷霞从内蒙古伊敏河岸和海拉尔河岸牧区传统乳制品中共分离出33株乳酸菌，它们被鉴定为4个属Lactobacillus、Lactococcus、Enterococcus和Leuconostoc，其中Lactobacillus plantarum和Lactococcus lactis subsp| lactis为该地区传统乳制品中的优势菌群^[17]。而Sun等对蒙古国戈壁阿拉泰、东戈壁等地区采集自然发酵牛乳样品进行研究发现，Lactobacillus fermentum和瑞士乳杆菌Lactobacillus helveticus为该地区自然发酵牛乳的优势乳酸菌^[18]。剧柠对新疆传统发酵乳制品的研究发现Lactobacillus helveticus为该地区的优势菌株^[19]。这表明不同地区的自然发酵牛乳，因其地理位置、气候因素等差异，形成多样的乳酸菌菌相。

3 结论

本研究从呼伦贝尔地区采集的8份传统发酵乳制品样品中，共分出24株菌。通过16S rRNA基因同源性比较及系统发育树分析，它们分别属于乳球菌属、肠球菌属、乳杆菌属、链球菌属、明串株菌属，共5个属9个种或亚种。其中Lactococcus lactis subsp| lactis为呼伦贝尔地区传统发酵乳制品中的优势菌株，占分离株的25%。8份样品活菌数为6.80−9.00 lgCFU/ml。