真菌分为广义的真菌和狭义的真菌。广义的真菌是一个广泛生物类群，除了纯真菌(Pure fungi)外还有粘菌、卵菌、地衣以及一些单细胞的真核生物^[1]。狭义的真菌是指生物三域系统中真核生物域中的纯真菌，包含6个门，子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、球囊菌门(Glomeromycota)、微孢子虫门(Microsporidia)和接合菌门(Zygomycota)^[2]。真菌一般具有真正的细胞核；营养体通常为分枝繁茂的丝状体，单个的丝状体称为菌丝，菌丝呈顶端生长；有硬的细胞壁，大多数真菌的壁为几丁质；通过细胞壁吸收营养物质，分泌胞外酶降解不被吸收的多聚物为简单化合物吸收，是异养型；通过有性和无性繁殖的方式产生孢子延续种族^[1]。真菌在工业、农业和医药卫生等领域有广泛的利用，几乎遍及与人类生活相关的各个方面，例如在食品业、纺织业、制革、造纸、洗涤、医药等所用的原料和酶类，植物病害和生物防治，土壤微生物，环境污染和废弃物的降解等。

真菌的鉴定是真菌研究和利用的基础。DNA条形码(DNA barcoding)技术作为一新兴的物种鉴定方法以其灵敏、精确、方便和客观的优势，在动植物中已经得到广泛应用^[3]。Schoch等提出rDNA ITS作为真核生物域的第二大界——真菌界的DNA条形码，以利于真菌多型分类生态学和生物多样性的研究^[4]。rDNA ITS是指核糖体RNA基因(rDNA)的内转录间隔区(Internal transcribed spacer，ITS)，通常情况下ITS1、5.8S和ITS2这3个区段合称为ITS序列，真菌ITS的长度一般在650−750 bp之间^[3]。在GenBank中有约172 000条真菌的rDNA ITS全序列，其中56%有拉丁学名，代表约15 500种和2 500属，来源于500余种刊物的约11 500项科学研究^[4]。我国研究者应用rDNA ITS序列于医学、土壤、工业、植物内生、植物病原和污染真菌的鉴定中，对于口腔黏膜、临床浅部真菌^[5]，银杉根际土壤真菌^[6]，纤维素降解菌^[7]，甘草、麻疯树根部内生真菌^[8-9]，桃、猕猴桃果实贮藏期间病原真菌^[10-11]、黄瓜叶斑病菌^[12]、烟草根黑腐病致病菌^[13]，化妆品中污染真菌^[14]等真菌的鉴定中都以rDNA ITS序列作为主要的鉴定手段。

本实验研究的目的是选取中国农业微生物菌种保藏管理中心(Agricultural Culture Collection of China，ACCC)保藏的菌株，采用rDNA ITS序列测序和比对的方法进行菌种名称的复核，验证rDNA ITS序列在真菌属的水平上复核鉴定的可行性。

随机选取来自ACCC的真菌共计37属112株菌株(表 1)。

将菌株接种于PDA培养基^[15]或V8培养基上，25 °C恒温培养箱中培养。接种后3 d开始观察并测量菌落直径，记录初生菌丝表面特征、有无色素产生等并拍摄数码照片。待菌落覆盖培养皿2/3表面积时刮于2 mL离心管中，用于DNA提取。

V8培养基配方：200 mL V8蔬菜汁，碳酸钙0.3 g，琼脂20 g，自来水补足至1 L。1.0×10⁵ kPa灭菌30 min。

采用CTAB法提取DNA^[16]。将准备好的装有菌丝的离心管中放入钢珠，然后将离心管放于液氮中10 min，再置于MM400混合式研磨仪中3-5 min至研磨成粘稠状。随后用CTAB法进行DNA提取。

引物采用真菌通用引物：ITS5 (5ʹ-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3ʹ)和ITS4 (5ʹ-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3ʹ)。50 μL PCR扩增体系：DNA模板2 μL，Taq酶(2.5 U/μL) 0.4 μL，10×Buffer 5 μL，dNTPs (各2.5 mmol/L) 1 μL， 10 μmol/L的正向引物和反向引物各1 μL，加灭菌双蒸水至50 μL。PCR反应在Bio-Rad T100上进行，程序为：95 °C 3 min；95 °C 2 min，53 °C 30 s，72 °C 1 min，35个循环；72 °C 10 min，12 °C保持。配制1%琼脂糖凝胶，取4 µL的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭溶液染色15 min后，在凝胶成像系统中观察。将检测电泳条带达到一定亮度的PCR产物送交北京三博远志生物技术有限责任公司进行rDNA ITS序列测定。将所测得的rDNA ITS序列在GenBank中进行比对。

实验中的112株菌株经rDNA ITS序列比对，共有80株菌株的比对结果与原名称在属的水平上相同，占供试菌株的71.4%。这些比对一致的菌株，取每个属的代表性菌株的比对结果见表 2。

经rDNA ITS序列比对，比对结果与原名称在属的水平上相同的80株菌株与GenBank中的序列相似性均为98%−100%。测序结果中有特殊结构的情况基本不影响比对的相似率，但测序结果中有套峰的情况下比对的相似性会降低，有的可以达到90%，例如Rhizoctonia属的4株菌，Shiraia、Phytophthora、Corynespora、Torula属各1株菌在GenBank中比对的相似率≤95%，都是因为测序结果中存在套峰的情况。对于这几株菌株，还需重复试验，获得无套峰的正常序列结合形态学和其他方法进一步研究。Landeweert等认为采用ITS1F/ITS4B这对引物扩增土壤中的担子菌，通过ITS区域比对OTU (Operational taxonomic units)与GenBank中参照序列相似性99%-100%之间的鉴别为相同种^[17]。杨友联等对炭疽菌的研究指出，登录在GenBank中的Colletotrichum gloeosporioides的ITS序列中有部分极可能被错位定义，因此，在引用GenBank中的序列参与构建系统发育时需谨慎选择，尽可能的选择模式菌株的序列参与比较分析^[18]。

综上所述，通过试验和文献分析，采用rDNA ITS序列在属的水平上对菌株进行复核是相对准确的。

针对本实验涉及的真菌，在链格孢属Alternaria、葡萄孢属Botrytis、枝孢属Cladosporium、炭疽菌属Colletotrichum、棒孢属Corynespora、疫霉属Phytophthora、拟青霉属Paecilomyces、丝核菌属Rhizoctonia、核盘菌属Sclerotinia的真菌种类有通过rDNA ITS序列鉴定的研究报道。刘先宝等通过测定橡胶树多主棒孢菌(Corynespora cassiicola)的rDNA ITS区全序列，结果表明，种内各菌株间ITS序列一致性高达99%以上，部分菌株间出现个别碱基的差异，并根据rDNA ITS区设计了一对高度特异引物(CorP1/CorP2)^[19]。王艳等将从三七根茎上分离出的两株菌株进行rDNA ITS序列分析并建立系统发育树，结果全rDNA ITS序列仅在第134位点上发生间或缺失突变，鉴定2株真菌均为长枝木霉Trichoderma longibrachiatum^[20]。张正光等对可以引起非洲菊典型的根腐病的菌株进行了rDNA ITS序列分析，结果与GenBank中隐地疫霉的rDNA ITS序列的相似性均为99.87%，仅有1个碱基的差异，确定为隐地疫霉(Phytophthora cryptogea)^[21]。王瑞虎等对番茄灰霉病菌进行序列测定，其18S rDNA以及rDNA ITS序列分别与葡萄孢菌一致性高达100%和99.94%，最终确定为葡萄孢菌(Botrytis cinerea)^[22]。淮稳霞等通过rDNA ITS序列分析并建立聚类分析树状图将供试的15株立枯丝核菌归入AG2-2和AG1-IA 2个融合群^[23]。

然而，并不是所有真菌都能通过rDNA ITS序列准确的得到种名。曲文文等对链格孢属的34株菌株进行了ITS、OPA2-1、POA1-3序列分析，发现这些序列对链格孢菌都有一定的区分性，但在种的水平上，基于形态分类的不同种常被归为系统发育树的同一分支，或者同一个种被区分在不同的分支等，认为链格孢菌存在明显遗传分化，其遗传分化机制尚需进一步研究^[24]。汪涯等通过ITS序列测定一株真菌R2，与枝孢属Cladosporium sp.中的尖孢枝孢菌Cladosporium oxysporum一致性高达99%，通过建立系统发育树最终确定为尖孢枝孢菌^[25]。陈璐等指出多主棒孢是一个高度变异的群体，不同寄主间差异较大，目前已有的通过ITS序列鉴定的方法都还有待验证，并设计出了特异性引物用以检测肌动蛋白(Actin)基因^[12]。McNeill等在国际藻类、真菌和植物命名法规(墨尔本法规)给真菌的有性型和无性型赋予了同样的优先权^[26]，这可能会引起真菌有性型和无性型名称的一些混乱，也会引起真菌种的概念的新的研究^[27]。因此，真菌属的名称和种的概念会随着真菌分类学家的研究进展而时有变化。将条形码技术作为一种新的性状来构建分类系统，实现生物自身的序列变异信息与现有形态分类学的结合，以此来加快对全球生物物种进行分类和鉴定的步伐^[3]。但无论真菌的属或种的名称随着研究进展怎样变化，在保证菌株信息和实物可靠以及菌株纯度的条件下，对于我国的大量真菌资源进行真菌DNA条形码rDNA ITS序列测定，在属的水平上初步确定真菌资源的分类地位，有利于真菌资源今后的准确鉴定和其他研究，是对我国大量真菌资源快速鉴定的相对简便的途径。

本研究通过对ACCC保藏的112株真菌进行rDNA ITS序列测定，得到80株菌在属的水平上是准确鉴定的，在此基础上会分批对这些菌株采用形态学和多基因序列分析进一步鉴定到种。国家级微生物菌种保藏管理中心保藏的大量微生物菌种，是我国重要的资源，每年花费国家大量的人力、物力、财力对这些国家资源进行保藏。以前菌株的名称多是通过形态学特征结合菌株功能进行鉴定，给出菌株的属名或种名；随着分子生物学技术的发展和普及，通过真菌DNA条形码rDNA ITS序列测定的方法，能在较短时间内辅助进行属的水平的鉴定。对于真菌资源来说，建议对于待入国家级菌库和已库藏的大量真菌资源，都进行rDNA ITS序列的测定，尽快整理出准确鉴定的利用价值高的菌株，利于这些资源的全社会研究和共享。

对于通过rDNA ITS序列测定的方法赋予的菌株的属或种名称与原名称不一致的应审慎处理，除了要做包括形态、多基因片段的序列分析等进一步验证外，原名称是因为其入库保藏时的功能等特征而鉴定的，原名称应至少作为菌株的一项特征予以保留，入库后依据不同时期不同文献或实验结果而做的名称变更，都应以“曾用名”予以记录保留其变更历史和原因，便于今后研究者进一步研究利用时参考。