有丝分裂真菌中，蜡蚧菌Lecanicillium W. Gams&Zare (又称蜡蚧轮枝菌、蜡蚧霉)是已经被商品化的虫生真菌^[1]。蜡蚧菌最早被Zimmermann命名为蜡蚧头孢霉Cephalosporium lecanii Zimm.；而后Viegas将其并入轮枝孢属Verticillium Nees。形式属轮枝孢属的寄主范围很广，包括节肢动物、线虫、植物和真菌^[2]。Zare和Gams^[3]于2001年通过形态学和基于ITS1-5.8S-ITS2的rDNA分析重新对该形式属进行了定位，将该属中所有昆虫病原菌放在了新属蜡蚧菌属Lecanicillium W. Gams&Zare中^[4]。其中包括Lecanicillium attenuatum Zare&W. Gams、L. lecanii (Zimm.) Zare&W. Gams、L. longisporum (Petch) Zare&W. Gams、L. muscarium (Petch) Zare&W. Gams、L. nodulosum (Petch) Zare&W. Gams，而这些种在之前被统一称为蜡蚧轮枝菌Verticillium lecanii Zimm.^{[2, 4]}。对这样的分类系统而言，先前有关蜡蚧轮枝菌的研究可能会包括蜡蚧菌属的一些种，Goettel等在对相关文献研究之后发现一些学者只是单纯地用Lecanicillium取代了Verticillium，并没有提供必要的证据信息，从而增加了蜡蚧菌属的混乱程度^[5-6]。

基于蜡蚧菌开发的或正在研发的商品化制剂至少有15种，有些制剂的菌种名称不够准确。但是有些制剂是基于早期的蜡蚧轮枝菌而开发，包含了蜡蚧菌属中多个种。对原始菌株的界定不清晰使得这些商品制剂的成分往往不同，甚至有些商品根本不含有注册的菌株^[2]。

渐狭蜡蚧菌Lecanicillium attenuatum是蜡蚧菌属Lecanicillium W. Gams&Zare中的一个重要的种。该菌寄主广泛，已经确证的有从波兰的一种毛虫、美国的一株枯枝^[2]、朝鲜的蚜虫^[7]和黑龙江的大豆胞囊线虫^[8]上成功分离得到，但从茶小绿叶蝉上分离得到渐狭蜡蚧菌尚未见报道。渐狭蜡蚧菌可以有效寄生线虫的卵^[4]、桃蚜^[9]、棉蚜^[10]等农业害虫，具有重要的生防潜力。茶小绿叶蝉 Empoasca flavescens (Fab.)是危害贵州省茶叶的主要害虫之一，郑姗姗等^[11]报道了蜡蚧轮枝菌对茶假眼小绿叶蝉具有一定的防治效果。本文从茶小绿叶蝉上分离得到渐狭蜡蚧菌，这对于防治茶小绿叶蝉具有潜在的应用价值。

1 材料与方法 1.1 培养基

PDA培养基参照文献^[12]。基础培养基(g/L)：葡萄糖20.0，硝酸钠2.0，氯化钾0.5，磷酸氢二钾1.0，七水硫酸镁0.5，七水硫酸亚铁0.01，琼脂15.0，蒸馏水1 000 mL^[13]。

1.2 菌株分离及培养

标本来自贵州省遵义市凤冈县仙人岭茶园，为罹病茶小绿叶蝉。用火焰灭菌后的接种针小心地挑取标本表面的菌丝，接种在无菌、含有抗生素的PDA平板上，待目标真菌长出后及时转接至新的PDA平板上进行纯化培养。25 Gzuifrlun-1404，现保存于贵州大学真菌资源研究所菌种保藏中心(GZAC)。

1.3 DNA的提取及ITS序列扩增

从PDA平板上挑取菌丝体，根据Tigano-Milani等的方法提取总DNA^[14]。提取的DNA置于−20 保存，选用通用引物ITS5 (5′-GGTGAGAGATTTCTGTG-3′)和ITS4 (5′-TCC TCCGCTTATTGATATGC-3′)扩增ITS区的nrDNA。反应体系(25 μL)：ddH2O 8.5 μL，模板(10−100 mg/L) 2 μL，引物ITS4和ITS5均为 (0.4 μmol/L) 1 μL，Master mix为12.5 μL。PCR反应条件：94 5 min；94 40 s，49 40 s，72 60 s，35个循环；72 10 min。PCR产物送上海Invitrogen公司纯化测序。

1.4 系统发育分析

测序结果经手工比对校正后提交GenBank，登录号为KT345700。用NCBI的BLAST程序进行比对，下载相似度大于90%的核酸序列以及其他相关的部分真菌序列。表 1为本研究用于系统发育学分析的所有序列。用MEGA 5.2对序列进行对齐剪切后构建系统发育树，运行条件为邻接法(Neighbor-Joining)，运算次数(Replications)1 000次^[15]。用Rotiferophthora minutispora 作为外群^[5]。

1.5 产孢条件筛选

1.5.1 单因子实验：在基础培养基的基础上，分别改变碳源、氮源、生长因子，每l 000 mL 培养基中，(1) 碳源：对照组、蔗糖、海藻糖、麦芽糖、乳糖、甘油、淀粉各30 g；(2) 氮源：对照组、蛋白胨、酵母浸出汁、尿素、硫酸铵、硝酸钾各10 g；(3) 改变添加物：对照组、马铃薯汁200 mL、土壤浸出液200 mL、蚕蛹粉浸出液 200 mL^[16]。接种活化过的Lecanicillium attenuatum (菌块大小为1.5 mm×1.5 mm×0.5 mm)，用食品袋封住培养皿，放入培养箱中，培养温度为25 连续观察菌落的生长情况，培养至第2天开始采用十字交叉法测量菌落生长直径，每隔2 d观测1次，直至第12天。用刀片将培养12 d的菌落移入灭菌的带有玻璃珠的20 mL吐温水中，涡旋振荡1 min，用血球计数板计数。

1.5.2 正交试验：选定最佳碳源、氮源，添加物和培养温度作为考察因素，每个因素各取3个水平，采用L9(3⁴)正交表进行正交试验，获得最优配比及培养基条件。

1.6 数据统计与分析

数据采用DPS软件和Excel软件进行统计和分析。

2 结果与分析 2.1 渐狭蜡蚧菌 已知种 图 1 Lecanicillium attenuatum Zare&W. Gams Figure 1

寄主昆虫体长约4 mm，菌丝布满虫体表面，菌丝白色。菌落在PDA培养基中生长较快，25 −μm×(0.9−1.8) μm；气生孢子形成孢子团4.5−7.2 μm，用无菌水或棉兰染色液处理之后孢子逐渐散开成柱状，(2.7−7.2) μm×(0.9−1.8) μm。

研究标本：Gzuifrlun-1404，采集人：周叶鸣，2014年4月，罹病小绿叶蝉，标本采自贵州省遵义市凤冈县仙人岭茶庄。现保存于贵州大学真菌资源研究所。

地理分布：波兰、美国、朝鲜、中国都有分布。

从菌株Gzuifrlun-1404中扩增出来的ITS序列与GenBank中已有核酸序列BLAST结果表明，菌株Gzuifrlun-1404的rDNA-ITS序列与L. attenuatum的相应序列相似性为100%。通过系统发育树分析显示，菌株Gzuifrlun-1404与L. attenuatum属同种(图 2)。

2.2 产孢条件筛选

2.2.1 不同碳源筛选：由表 2可知，不同碳源对Lecanicillium attenuatum的产孢影响不一样，经DPS单因素方差检验，碳源以麦芽糖最佳，其产孢量最大为10.450×106个/mL，且麦芽糖与其他碳源的差异显著(P<0.05)。

2.2.2 不同氮源筛选：由表 3可知，经DPS单因素方差检验，氮源以蛋白胨最佳，其产孢量最大为30.167×106个/mL。蛋白胨除与酵母浸出汁没有显著差异外，与其他氮源的差异显著(P<0.05)。

2.2.3 不同添加因子筛选：由表 4可知，经DPS单因素方差检验，添加因子以蚕蛹粉最佳，其产孢量最大为38.067×106个/mL，蚕蛹粉与其他添加因子的差异显著(P<0.05)。

2.2.4 正交试验：根据单因素筛选的结果，选取影响Lecanicillium attenuatum的产孢量的各因素中有意义的水平进行正交试验，以确定最佳配比。采用L9(3⁴)正交表，以蛋白胨(A)、麦芽糖(B)、蚕蛹粉(C)、温度(D)作为4个考察因素，选取3个水平进行实验。按表 5的正交因素水平设计L₉(3⁴)正交试验，结果见表 6。

以每个培养皿为指标进行直观分析(表 6)和方差分析(表 7)，经过方差分析结果表明4个因素都对L. attenuatum产孢有显著影响。使用DPS软件分别对4个因素进行各水平比较，并进行多重比较(LSD法)，各个处理间的差异性检验结果被列在了表 5中。综合单因素筛选的结论，最佳配比为A2B1C2D3，即最适配比和培养条件为(质量体积比)：蛋白胨2%，麦芽糖1%，蚕蛹粉1%，氯化钾0.05%，磷酸氢二钾0.1%，七水硫酸镁0.05%，琼脂1.5%，蒸馏水1 000 mL，25 °C。

3 讨论

蜡蚧菌属真菌除了被开发成生物杀虫剂用来防治昆虫危害之外，还常表现出对植物病原线虫和植物病原真菌的控制效果^[10]。因此，这类真菌的开发利用将为防治农业病虫害提供了广阔的应用前景。渐狭蜡蚧菌虽已被应用到农业的害虫防治上，但未见对茶小绿叶蝉的防治有相关的报道。

寄主昆虫的种类在昆虫病原真菌种的界定上是重要的鉴别特征之一^[17]。在寄主范围较广的一类真菌中，同一种真菌的不同菌株对寄主的偏好性也常表现出差异。本文从茶小绿叶蝉虫尸上成功分离得到蜡蚧菌菌株Gzuifrlun-1404，明确了该菌株的分类地位。对该菌株的产孢条件优化也为该菌株的应用提供了重要的基础。菌株Gzuifrlun-1404为小绿叶蝉的潜在生防菌株，该菌株的获得也丰富了小绿叶蝉的真菌寄主。

肉座菌科/麦角菌科共同祖先早先寄生于植物及其残体。随后的进化使得其能够寄生于特异的动物和真菌^[18]。渐狭蜡蚧菌曾被报道从枯枝^[2]和土壤^[13]中分离得到，也被报道从线虫^[8]和刺吸式口器的昆虫^[7]中分离得到。从菌株Gzuifrlun-1404生长因子的筛选结果来看，该菌株的营养源偏好动物。线虫生活于土壤-植物从土壤中吸收营养-昆虫取食植物，真菌寄主是否存在这样的一个跃迁模型？这是一个有趣的生物学问题。