吩嗪是一类含氮杂环化合物，由两个苯环和一个吡嗪环形成对称的稠环结构。吩嗪类化合物是含有吩嗪结构的一类化合物的总称，以吩嗪环为核心，经过羟基、羧基、甲基等不同的功能基团修饰，形成具有抗菌、抗肿瘤、抗疟疾以及抗寄生虫等不同生物活性的吩嗪衍生物^[1]。

天然吩嗪类化合物主要由假单胞菌、链霉菌以及部分海洋菌属等合成。已报道的由假单胞菌产生的吩嗪类化合物主要有吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid，PCA)、1-羟基吩嗪(1-hydroxy-phenazine，1-OH-Phz)、吩嗪-1-甲酰胺(phenazine-1-carboxamide，PCN)、绿脓菌素(pyocyanin)等^[2]。与假单胞菌相比，链霉菌不仅能够产生一些结构比较简单的吩嗪类化合物，如PCA、吩嗪-1,6-二羧酸(phenazine-1,6-dicarboxylic acid，PDC)等^[3]，还能合成一些结构更为复杂的，如吩嗪环上含有酯基、醛基、氨基、硫醚基等取代基的吩嗪类化合物^[4]。

研究表明，假单胞菌中的吩嗪类化合物生物合成的前体是PCA，而链霉菌除了PCA，还可以PDC为前体生物合成不同的吩嗪类化合物^[5]。PCA和PDC主要来源于莽草酸途径，其生物合成一般是由7个基因——phzABCDEFG组成的核心基因簇完成的^[6]，该核心基因簇在假单胞菌和链霉菌中都有发现。前体合成之后，通过不同的侧链修饰途径形成不同的吩嗪类化合物。假单胞菌中的修饰途径研究的比较多，如在铜绿色假单胞菌PAO1 (Pseudomonas aeruginosa PAO1)中，甲基转移酶PhzM催化PCA生成5-甲基吩嗪-1-羧酸甜菜碱(5-methylphenazine-1-carboxylic acid betaine)，水杨酸羟化酶PhzS单独作用时可催化PCA转化为1-OH-Phz，天冬酰胺合成酶PhzH催化PCA转化为PCN^[7]。关于链霉菌中吩嗪类化合物生物合成的修饰基因和修饰途径的研究还很少。

洛蒙真菌素是由洛蒙德链霉菌(Streptomyces lomondensis)合成的一种吩嗪类次级代谢产物，由美国Upjohn公司的Bergy博士等分离得到。洛蒙真菌素呈橄榄黄色，其化学结构为6-醛基-4,7,9-三羟基-吩嗪-1-甲酸酯，能够抑制多种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌生长，还具有抑制真菌的特性，是一种广谱抗生素^[8]。

洛蒙德链霉菌S015 (S. lomondensis S015)是本实验室从土壤中分离得到的，我们在该菌株的发酵产物中纯化鉴定到了洛蒙真菌素^[9]。通过对S015的全基因组测序分析，在其基因组中找到了由phzGFEDCB组成的吩嗪类化合物生物合成核心基因簇，并在此基因簇附近，发现了一个甲基转移酶基因——lomo3 (NCBI：KP721214.1)，如图 1所示^[10]。根据洛蒙真菌素的侧链结构，我们推测此基因可能参与了其C-1位的甲酯化反应。本文通过无痕敲除的方法，研究了该基因对洛蒙真菌素生物合成的影响。

1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 工具酶：DNA聚合酶rTaq (生化试剂)，Xba I、Hind III、Bgl II、Nde I限制性内切酶(生化试剂)，Solution I DNA连接酶试剂盒，均购自日本Takara公司；KOD-201高保真酶(生化试剂)，购自上海硕盟有限公司。

1.1.2 培养基：LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，固体加琼脂15；MS培养基(g/L)：黄豆饼粉30，加水煮沸后过滤，加甘露醇20，琼脂20；2×YT培养基(g/L)：酵母提取物10，胰蛋白胨10，氯化钠5；1.0×10⁵ Pa，20 min高温灭菌。YEME培养基(g/L)：葡萄糖4，麦芽提取物10，酵母提取物4；0.68×10⁵ Pa高温灭菌20 min。

1.1.3 菌株和质粒：所用菌株及质粒信息见表 1。

1.1.4 引物：所用引物及具体信息见表 2。

1.2 实验方法 1.2.1 菌株培养：洛蒙德链霉菌S015及其突变株的培养条件为28 °C、180 r/min。MS培养基用于产孢培养和固体种子培养；YEME培养基用于液体种子培养和发酵培养。具体培养方法参考王华盛等^[9]。所有的Escherichia coli都采用LB培养基，培养温度为37 °C，具体培养方法参考Zhang等^[10]。

1.2.2 同源重组质粒pKC1139-lomo3构建：用引物lomo3 left-F、lomo3 left-R和lomo3 right-F、lomo3 right-R分别扩增lomo3基因左、右同源臂序列。扩增程序：94 °C 2 min；94 °C 15 s，60 °C 30 s，68 °C 100 s，35个循环；72 °C 7 min。纯化后加A尾：纯化的PCR产物(20 mg/L) 42.5 μL，10×PCR buffer 5 μL，dNTPs (2.5 mmol/L) 2 μL，rTaq酶(5 U/μL) 0.5 μL，72 °C水浴30 min后割胶回收。用连接酶solution I将回收片段连接到pMD19-T载体(氨苄霉素抗性，100 mg/L)上，转化至DH5α感受态中，分别得到lomo3左、右同源臂连接在pMD19-T的重组载体pCC701和pCC702。将pCC701和pCC702用Bgl II和Xba I双酶切，将酶切后的pCC702同源臂片段连接到酶切后的pCC701载体上，构建重组载体pCC703，PCR验证。将pCC703与pKC1139载体(阿伯拉霉素抗性，50 mg/L)用Hind III和Xba I双酶切后连接，构建重组载体pKC1139-lomo3。

1.2.3 基因缺失突变株的构建和筛选：将pKC1139-lomo3载体转化到大肠杆菌ET12567 (双抗性：卡那霉素50 mg/L和氯霉素25 mg/L)中，与S015进行接合转移，接合18 h后用1 mL含有萘啶酮酸(1 g/L)和阿伯拉霉素(Apr，2 g/L)的ddH₂O覆盖，28 °C培养4 d；挑取接合子于Apr抗性平板上，28 °C培养4 d。从平板中挑菌至YEME液体培养基中，37 °C、180 r/min培养，传代5次，涂布于无抗MS平板上产孢，收集孢子后稀释至10⁻⁶，涂布于无抗MS平板上，28 °C培养4 d。利用突变株失去Apr抗性的特性，通过无抗和有抗平板影印，筛选出基因缺失突变株S015Δlomo3。

1.2.4 回补质粒pIB139-lomo3的构建：回补质粒pIB139-lomo3的构建方法同1.2.2。用引物lomo3-F、lomo3-R扩增lomo3完整的基因片段，连接到pMD19-T载体上，获得pCC704重组载体。将pCC704与pKC1139载体用Nde I和Xba I双酶切后连接，构建整合载体pIB139-lomo3。

1.2.5 回补菌株的构建及筛选：将回补质粒pIB139-lomo3转化到ET12567 (pUZ8002)中，接合转移至S015Δlomo3中。由于重组质粒pIB139-lomo3带有阿伯拉霉素抗性，因此挑取接合子于28 °C阿伯拉抗性平板培养，筛选回补菌株S015Δlomo3::lomo3。

1.2.6 产物分析：发酵液的预处理^[14]：取培养4 d的发酵液2 mL，12 000×g离心3 min，取上清液1 ml，用6 mol/L HCL调节pH到2.0，加入等体积丁酮，振荡萃取3−5 min后，12 000×g离心5 min。取上层有机相，于33 °C真空旋转干燥仪旋转蒸干后，溶于1:1 (体积比)的乙腈和0.1%甲酸水溶液中，12 000×g离心2 min，用有机相滤头过滤，用于产物的HPLC分析。

1.2.7 产物的HPLC分析^[15]：流动相为乙腈:0.1%的甲酸水溶液，梯度为：0−4 min，2:8；4−20 min，4:6；20−30 min，2:8；流速为1 mL/min，检测波长270 nm；采用Agilent Technologies 1260 Infinity高效液相色谱仪，250 mm×4.6 mm的Agilent 5 μm Eclipse Plus C₁₈色谱柱。

2 结果与分析 2.1 lomo3基因敲除和回补 2.1.1 基因缺失菌株S015Δlomo3的构建：甲基转移酶基因lomo3全长819 bp，设计的左、右同源臂长度分别为1.9 kb和2.0 kb，包含了lomo3基因左端的58 bp和右端的188 bp，预期敲除长度为lomo3中间的573 bp序列。扩增lomo3基因左、右同源臂，结果如图 2A所示。用lomo3 left-F和lomo3 right-R引物验证重组载体pKC1139-lomo3的构建结果，产物大小为左、右同源臂的总长3.9 kb，如图 2B所示，说明构建成功。用引物lomo3 left-F和lomo3 right-R检验基因缺失菌株S015Δlomo3是否构建成功：野生株的PCR产物长度为4.5 kb，由于lomo3基因的敲除长度为573 bp，突变株的的PCR产物长度应为3.9 kb，从图 2C可以看出，产物长度与预期相符，说明基因缺失菌株S015Δlomo3构建成功。

2.1.2 回补株S015Δlomo3::lomo3的构建：用引物lomo3-F、lomo3-R扩增lomo3完整的基因片段，构建整合载体pIB139-lomo3并导入S015Δlomo3中。用引物pIB-F和pIB-R验证回补菌株S015Δlomo3::lomo3的筛选结果。从图 3可以看出，菌株S015Δlomo3::lomo3的PCR产物长度为1.3 kb，与预期结果符合，而基因缺失菌株中则没有该条带，说明基因lomo3回补菌株构建成功。

2.2 lomo3基因对菌株的影响 2.2.1 平板生长形态：将野生株S015、lomo3缺失株S015Δlomo3和lomo3回补株S015Δlomo3::lomo3划线在MS平板上，于28 °C培养6 d。从图 4A可以看出，基因lomo3对孢子和菌丝的表型没有明显的影响；但从图 4B可以看出，该基因对产物合成有显著影响：S015有明显的黄色产物，而基因lomo3的缺失导致该黄色产物消失，基因回补后又有少量的黄色产物出现。

2.2.2 发酵产物：将S015、S015Δlomo3和S015Δlomo3::lomo3分别接种至YEME发酵培养基中培养4 d，对其发酵产物进行HPLC检测。图 5A中野生株S015在17.3 min出现的发酵产物为洛蒙真菌素；图 5B显示lomo3基因缺失株S015Δlomo3的发酵产物中没有洛蒙真菌素，同时也没有检测到其它的产物；从图 5C可以看出，lomo3基因回补后，菌株S015Δlomo3::lomo3的发酵产物中又检测到了洛蒙真菌素。这一结果说明，本文研究的甲基转移酶基因lomo3对洛蒙德链霉菌S015中洛蒙真菌素的生物合成有重要的影响。

3 讨论

本文通过无痕敲除的方法，研究了洛蒙德链霉菌S015中的一个甲基转移酶基因lomo3对洛蒙真菌素生物合成的影响。

甲基转移酶在很多微生物的次级代谢产物合成中起着重要的作用^[16]。在铜绿色假单胞菌PAO1 (Pseudomonas aeruginosa PAO1)中，甲基转移酶PhzM负责PCA吩嗪环上5位的甲基转移，生成5-甲基吩嗪-1-羧酸甜菜碱^[7]。Streptomyces spheroides的新生霉素合成基因簇中，有一种S-腺苷甲硫氨酸依赖的氧位甲基转移酶NovP，负责诺维糖C-4位上羟基的甲基化^[17]。Streptomyces iakyrus在合成放线菌素G的过程中，将编码一种甲基转移酶的基因acmG5′ 敲除后，会导致该菌株不再合成放线菌素G^[18]。本研究中，甲基转移酶基因lomo3的敲除导致S015不能合成洛蒙真菌素；通过lomo3基因回补，菌株S015Δlomo3::lomo3恢复了洛蒙真菌素的合成。说明这个甲基转移酶基因lomo3在洛蒙真菌素的生物合成过程中起着重要的作用。

Buckland等^[19]利用¹⁴C标记的方法，确定了PDC是洛蒙真菌素合成的前体；而PDC来源于莽草酸途径中产生的分支酸(chorismic acid)^[5]。Zhang等的研究表明，在洛蒙真菌素的生物合成中，单加氧酶基因lomo2的功能是在其C-7位的羟基转移^[10]。我们根据洛蒙真菌素的侧链结构，推测脱氢酶基因lomo1参与C-6位的羧基还原成醛基，lomo3参与了C-1位的甲酯化，lomo6可能作用于C-4和C-9位的羟基修饰，并据此推测出洛蒙真菌素的生物合成途径(图 6)。我们没有在lomo3基因缺失株S015Δlomo3中检测到其他吩嗪类产物，还不能确定该甲基转移酶作用的底物及相应的反应产物。这可能是因为Lomo3的底物是由一个或多个可逆反应合成的：当lomo3基因存在时，反应向着合成洛蒙真菌素的方向进行；而当该基因敲除以后，反应则逆向进行导致在基因缺失菌株中检测不到吩嗪类产物。目前还不能确定1位的甲酯反应、6位的脱氢反应，以及4、9位的两个羟基转移反应的先后顺序。我们正在进行lomo1、lomo6的基因敲除和功能的研究，同时还在进行Lomo3的体外酶学研究，希望通过这些研究，能够确定这些基因尤其是lomo3的功能，阐明洛蒙真菌素的生物合成途径。