乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)及其代谢产物因具有良好的抗菌活性和安全性，已成为一种新型的生物保鲜剂，并广泛地应用于乳制品、肉制品、果蔬和水产品等领域^{[1, 2]}。目前应用于食品保鲜的乳酸菌主要有乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、肉食杆菌属(Carnobacterium)、肠杆菌属(Enterococcus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)等，而乳杆菌属研究的最多^[3]。乳酸菌作为生物保鲜剂，主要应用于抑制食品致病菌和腐败菌^[4]。Matamoros等^[5]研究了利用乳酸菌抑制熟虾中的单核李斯特菌，结果发现Lc. piscium EU2241和Leuc. gelidum EU2247能抑制单核李斯特菌的生长。Matijašić等^[6]通过在半硬质奶酪中加入Lactobacillus gasseri K7 (Rifr)来抑制梭状芽孢杆菌(Clostridia)。

海鲈鱼不仅肉质细腻鲜美、少有鱼骨，且具有丰富的营养价值^[7]。随着海鲈鱼市场需求的增加，海鲈鱼的保鲜研究显得尤为重要，然而目前的相关研究还尚少^[8]。Kostaki等^[9]研究含有2种不同气体的气调包装和百里香精油对海鲈鱼的联合作用，在冷藏条件下，气调包装和百里香精油能有效延长海鲈鱼片的货架期。刘坤等^[10]研究了鱼类的涂膜保鲜技术，利用复合鱼类保鲜剂PF (以天然提取物和植物发酵成分为主要原料)浸渍处理新鲜海鲈鱼，再用海藻酸钠和氯化钠涂膜处理，在4 °C冷藏条件下能延长保鲜期2倍以上，16 d后依旧保持二级鲜度。优势腐败菌(specific spoilage organism，SSO)的生长繁殖是鱼肉腐败变质的主要原因，即使在冷藏过程中，鱼体上的SSO依旧主导着鱼肉腐败变质的程度^{[11, 12]}。本文通过筛选对冷藏海鲈鱼优势腐败菌具有较强抑制效果的单一乳酸菌进行复合，以冷藏海鲈鱼的2株优势腐败菌草莓假单胞菌(Pseudomonas fragi)和腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefacens)作为研究对象，研究复合乳酸菌对冷藏海鲈鱼优势腐败菌的抑制效果，并将复合乳酸菌应用于海鲈鱼块的冷藏中，研究复合乳酸菌对冷藏海鲈鱼块的保鲜效果。

1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 菌株：干酪乳杆菌LC1 (Lactobacillus casei LC1)、保加利亚乳杆菌LB1 (Lactobacillus bulgaricus LB1)，由实验室于食品中分离鉴定并保存；植物乳杆菌LP1 (Lactobacillus plantarum LP1)、乳酸菌L11 (lactic acid bacteria L11)、乳酸菌L14 (lactic acid bacteria L14)，由实验室保存；乳酸菌L2 (Lactic acid bacteria L2)、乳酸菌L3 (lactic acid bacteria L3)、草莓假单胞菌(Pseudomonas fragi)、腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefacens)，由实验室于腐败冷藏海鲈鱼中分离，其中草莓假单胞菌和腐败希瓦氏菌经鉴定为冷藏海鲈鱼的优势腐败菌。

1.1.2 主要试剂及仪器：营养肉汤、氧化镁(AR)、硼酸(AR)、盐酸(AR)，购于国药集团化学试剂有限公司；MRS肉汤、MRS琼脂培养基、假单胞菌选择性CFC琼脂培养基、铁琼脂培养基，购于山东青岛海博生物技术有限公司。

牛津杯，内径0.60 cm，外径0.78 cm，高1.00 cm。Kjeltec2300凯氏定氮仪，丹麦FOSS公司。

1.2 试验方法 1.2.1 菌悬液的制备：将各菌株活化后保存于斜面。各乳酸菌分别接取一环于5 mL无菌MRS肉汤中，37 °C、120 r/min培养12 h，制备成各乳酸菌菌悬液，经预实验涂平板确定各乳酸菌菌悬液浓度为10⁶−10⁷ CFU/mL；将各乳酸菌菌悬液进行等比例混合，制备成复合乳酸菌菌悬液；将草莓假单胞菌和腐败希瓦氏菌分别接取一环于5 mL无菌营养肉汤中，30 °C、120 r/min培养至对数期，6 000 r/min离心10 min后弃上清液收集菌体，在菌体中加入5 mL无菌新鲜营养肉汤后混合均匀，制备成冷藏海鲈鱼优势腐败菌菌液；将2株优势腐败菌的菌液进行等比例混合，制备成混合冷藏海鲈鱼优势腐败菌菌液。

1.2.2 筛选对冷藏海鲈鱼优势腐败菌具有抑制效果的单一乳酸菌：采用牛津杯法^[13]测定乳酸菌对冷藏海鲈鱼优势腐败菌的抑菌效果，通过抑菌圈直径大小判定。具体方法为，在制备好的无菌培养基平板上滴加0.1 mL腐败菌菌悬液(草莓假单胞菌使用假单胞菌选择性CFC琼脂培养基，腐败希瓦氏菌使用铁琼脂培养基)，用无菌涂布棒将菌液涂布均匀；将无菌牛津杯放置于培养基上，在杯中加入制备好的乳酸菌菌悬液200 μL，将平板正置于30 °C条件下培养8 h，用游标卡尺测定抑菌圈直径大小；做空白对照，重复3次。

1.2.3 筛选对冷藏海鲈鱼优势腐败菌抑制效果最优的复合乳酸菌：将筛选到的对冷藏海鲈鱼优势腐败菌具有较好抑制效果的单一乳酸菌进行等比例复合，采用牛津杯法测定复合乳酸菌对冷藏海鲈鱼优势腐败菌的抑菌效果，方法同1.2.2，筛选出对冷藏海鲈鱼优势腐败菌抑制效果最强的复合乳酸菌，重复3次。

1.2.4 复合乳酸菌对冷藏海鲈鱼块保鲜效果的测定：将腐败菌混合菌悬液与1.2.3筛选出的最优复合乳酸菌菌悬液按照比例1:2混合制成混合菌悬液，将无菌海鲈鱼块浸入混合菌悬液中10 s后取出，置于无菌培养皿中，于4 °C冷藏，分别在0、2、4、6、8 d后进行感官评定，挥发性盐基氮(TVB-N值)的测定和优势腐败菌的计数，做空白对照。

(1) 海鲈鱼块的制备。鲜活海鲈鱼去鳞、去内脏、清洗干净后，于无菌条件下用无菌水冲洗，用75%酒精擦拭鱼体，用无菌解剖刀切取背脊部内部无污染鱼肉，保持鱼块大小厚度基本一致，每块鱼块为5 g左右^{[14, 15]}；经检测确定鱼块的初始菌落总数为2.10±0.03 logCFU/g，假单胞菌数1.33±0.03 logCFU/g，腐败希瓦氏菌数为0.74±0.01 logCFU/g。

(2) 感官评定。选择5名经培训的感官评定员，对鱼块进行感官评价，感官评定标准如表 1所示^{[16, 17]}。

(3) 挥发性盐基氮(TVB-N值)的测定。使用Kjeltec2300凯氏定氮仪进行测定，40 g/L硼酸为吸收液，0.1 mol/L盐酸滴定，精确称取5 g左右碾碎样品到750 mL的蒸馏管中，加入1 g MgO和少许去离子水，连接到定氮仪进行测定^[18]，做3组平行实验。

(4) 优势腐败菌的计数。草莓假单胞菌的计数使用假单胞菌选择性CFC琼脂培养基，30 °C培养24−48 h后数菌落，做3组平行实验；腐败希瓦氏菌的计数使用铁琼脂培养基，30 °C培养24−48 h，计黑色菌落数，做3组平行实验。

2 结果与分析 2.1 筛选对冷藏海鲈鱼优势腐败菌具有抑制效果的单一乳酸菌

采用牛津杯法测定乳酸菌对冷藏海鲈鱼优势腐败菌的抑菌效果，结果见表 2。

由表 2可知，干酪乳杆菌LC1、保加利亚乳杆菌LB1、植物乳杆菌LP1、乳酸菌L2、乳酸菌L3对草莓假单胞菌和腐败希瓦氏菌均有抑制作用，乳酸菌L14仅对草莓假单胞菌有抑制作用，而乳酸菌L11对2株冷藏海鲈鱼优势腐败菌均无抑制作用。比较各抑菌圈直径大小发现，各乳酸菌对草莓假单胞菌的抑菌圈直径大小依次为乳酸菌L3>干酪乳杆菌LC1>植物乳杆菌LB1>乳酸菌L14>保加利亚乳杆菌LP1>乳酸菌L2>乳酸菌L11；各乳酸菌对腐败希瓦氏菌的抑菌圈直径大小依次为干酪乳杆菌LC1>植物乳杆菌LP1>乳酸菌L3>保加利亚乳杆菌LB1>乳酸菌L2>乳酸菌L11和乳酸菌L14，因此干酪乳杆菌LC1、植物乳杆菌LP1和乳酸菌L3这3株单一乳酸菌对2株冷藏海鲈鱼优势腐败菌的抑制效果较好。

2.2 筛选对冷藏海鲈鱼优势腐败菌抑制效果最优的复合乳酸菌

采用牛津杯法测定复合乳酸菌对冷藏海鲈鱼优势腐败菌的抑菌效果，结果见表 3。

由表 3可知，比较各抑菌圈直径大小发现，各复合乳酸菌对草莓假单胞菌的抑菌圈直径大小依次为干酪乳杆菌LC1+植物乳杆菌LP1+乳酸菌L3>植物乳杆菌LP1+乳酸菌L3>干酪乳杆菌LC1+乳酸菌L3>干酪乳杆菌LC1+植物乳杆菌LP1；各复合乳酸菌对腐败希瓦氏菌的抑菌圈直径大小依次为干酪乳杆菌LC1+植物乳杆菌LP1+乳酸菌L3>干酪乳杆菌LC1+植物乳杆菌LP1>干酪乳杆菌LC1+乳酸菌L3>植物乳杆菌LP1+乳酸菌L3，其中复合乳酸菌干酪乳杆菌LC1+植物乳杆菌LP1+乳酸菌L3对2株优势腐败菌的抑制效果最好。与单一乳酸菌的抑制效果相比，干酪乳杆菌LC1+植物乳杆菌LP1+乳酸菌L3的复合乳酸菌的抑制效果最强，因此干酪乳杆菌LC1、植物乳杆菌LP1和乳酸菌L3的复合乳酸菌对2株冷藏海鲈鱼优势腐败菌的抑制效果最好。

2.3 复合乳酸菌对冷藏海鲈鱼块保鲜效果的测定 2.3.1 复合乳酸菌对冷藏海鲈鱼块感官评定的影响：由图 1可知，比较对照组和添加复合乳酸菌的鱼块，随着时间的变化，添加了复合乳酸菌的鱼块的感官评定分值始终比对照组高，虽然两组的分值都随着时间在逐渐下降，但添加了复合乳酸菌的鱼块的感官改变不大，在8 d时依旧保持较好的感官状态，始终新鲜；而对照组的鱼块在2 d时依旧新鲜，6 d后不新鲜，粘液稍显浑浊、鱼块的色泽暗淡。比较添加了2株优势腐败菌和同时添加2株优势腐败菌和复合乳酸菌的鱼块，随着时间的变化，同时添加2株优势腐败菌和复合乳酸菌鱼块的感官评定分值始终高于添加了2株优势腐败菌的鱼块，同时添加2株优势腐败菌和复合乳酸菌的鱼块在8 d时为不新鲜的状态；而添加了2株优势腐败菌的鱼块在2 d时已经濒于不新鲜，4 d后逐渐腐败。结果分析，说明2株优势腐败菌对冷藏海鲈鱼块感官评定有很大影响，而复合乳酸菌能延缓冷藏海鲈鱼块感官的改变，使其延长6 d。

2.3.2 复合乳酸菌对冷藏海鲈鱼块TVB-N值的影响：根据鲜海水鱼国家推荐标准规定^[19]，鲜海水鱼的TVB-N值≤15 mg N/100 g为一级品，TVB-N值≤20 mg N/100 g为二级品，TVB-N值≤30 mg N/100 g为三级品。由图 2可知，比较对照组和添加复合乳酸菌的鱼块，随着时间的变化，添加了复合乳酸菌的鱼块和对照组的TVB-N值变化不大，且添加了复合乳酸菌鱼块的TVB-N值基本不变，8 d前都为一级品，8 d后为二极品；而对照组于6 d时为二极品，8 d时TVB-N值接近三级品。比较添加了2株优势腐败菌和同时添加2株优势腐败菌和复合乳酸菌的鱼块，随着时间的变化，同时添加2株优势腐败菌和复合乳酸菌鱼块的TVB-N值始终低于添加了2株优势腐败菌的鱼块，添加了2株优势腐败菌的鱼块在2 d时为二极品，4 d时为三级品；而同时添加2株优势腐败菌和复合乳酸菌鱼块的TVB-N值于4 d时为二极品，而6 d时为三级品。经分析，说明2株优势腐败菌对冷藏海鲈鱼块TVB-N值变化有很大影响，而复合乳酸菌能有效抑制其变化，使冷藏海鲈鱼块TVB-N值的变化延缓2 d。

2.3.3 复合乳酸菌对冷藏海鲈鱼块优势腐败菌的影响：由图 3可知，比较对照组和添加复合乳酸菌的鱼块，随着时间的变化，添加了复合乳酸菌的鱼块的假单胞菌数始终比对照组低，两组的假单胞菌数随时间逐渐升高，都在第6天时达到最高点，分别为6.59 logCFU/g和9.39 logCFU/g。比较添加了2株优势腐败菌和同时添加2株优势腐败菌和复合乳酸菌的鱼块，随着时间的变化，同时添加2株优势腐败菌和复合乳酸菌鱼块的假单胞菌数始终低于添加了2株优势腐败菌的鱼块，两组的假单胞菌数都在第4天时达到最高点，之后逐渐降低。经对比，证明复合乳酸菌具有抑制冷藏海鲈鱼块中假单胞菌生长繁殖的作用。

由图 4可知，比较对照组和添加复合乳酸菌的鱼块，添加了复合乳酸菌的鱼块的腐败希瓦氏菌数随着时间的变化始终极显著(P<0.01)比对照组低，两组的腐败希瓦氏菌数随时间逐渐升高，对照组在第6天时达到最高后逐渐降低，添加了复合乳酸菌的鱼块的腐败希瓦氏菌数在4 d后依旧不断增长，但增幅较小。比较另外两组鱼块，同时添加2株优势腐败菌和复合乳酸菌鱼块的腐败希瓦氏菌数随着时间的变化始终极显著(P<0.01)低于添加了2株优势腐败菌的鱼块。分析结果，说明复合乳酸菌具有抑制冷藏海鲈鱼块中腐败希瓦氏菌生长繁殖的作用。

3 结论与讨论

通过研究7株单一乳酸菌对2株冷藏海鲈鱼优势腐败菌的抑制效果，结果表明，干酪乳杆菌LC1、植物乳杆菌LP1和乳酸菌L3，这3株单一乳酸菌的抑制效果较好。对优选出的3株乳酸菌进行复合，研究其抑制效果，结果发现，干酪乳杆菌LC1+植物乳杆菌LP1+乳酸菌L3的复合乳酸菌较其他复合乳酸菌和单一乳酸菌的抑制效果最强。将复合乳酸菌添加到海鲈鱼块上，在4 °C条件下冷藏，从感官评定、TVB-N值和优势腐败菌的计数指标分析，复合乳酸菌能使海鲈鱼块感官的改变延缓6 d，使TVB-N值的变化延缓2 d，并能抑制其中优势腐败菌的生长。综合分析，复合乳酸菌能延长冷藏海鲈鱼块2 d时间的货架期。这可能是由于复合乳酸菌抑制了海鲈鱼块中优势腐败菌的生长繁殖，从而维持了海鲈鱼块的感官和鲜度，延长冷藏海鲈鱼块的货架期。因此，可得出结论，复合乳酸菌对冷藏海鲈鱼块具有良好的保鲜效果，能使其货架期延长2 d。

新鲜鱼类的菌相容易受到地理条件、季节气候、水域环境、运输条件等因素的影响，会随着环境的变化而改变，因此为了实验的代表性，本研究对样品海鲈鱼块进行相对无污染处理后，针对优势腐败菌进行抑菌研究，相对降低了各种外界因素对试验结果的影响，但此研究与未处理的样品尚有一定差异。此外，若将乳酸菌应用于鱼类的保鲜中，只适用于海鲈鱼块和海鲈鱼片的保鲜，对整鱼的保鲜效果还需进一步验证。另外，此种保鲜方法的应用需相应的乳酸菌制剂制造业随之发展，显然就目前的市场，此保鲜方法不便于广泛应用。在后继研究中，可以研究乳酸菌对未处理的海鲈鱼的保鲜效果；研究乳酸菌对其他鱼类的保鲜效果；并研究新型保鲜剂和其在鱼类保鲜的应用。