苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)产生的几丁质酶(Chitinase)可以水解几丁质，具有抑制真菌生长和明显的杀虫增效作用；而几丁质水解产生的几丁单糖(GlcNAc)以及分子大小不等的几丁寡糖[(GlcNAc)_n]，广泛参与细菌碳源和氮源的代谢。

多种微生物在进化过程中形成了严格而复杂的几丁质酶表达调控机制，但对其基因的表达调控机制知之甚少。本实验室分离得到的Bti75具有chiA和chiB两种几丁质酶基因，且它们的表达产物都是典型的诱导酶；而在Bti75培养基中加入葡萄糖后，其几丁质酶活性显著降低。因此，我们推测几丁质酶基因的表达调控中可能涉及分解代谢物阻遏(CCR)效应。

CcpA属于LacI-GalR转录因子家族^[1]，含PTS系统的低GC含量革兰氏阳性菌大部分以CcpA依赖的CCR效应进行碳源次序代谢的调控，且这些CcpA蛋白具有较高的保守性^[2]。CcpA的结合位点为cre，枯草芽胞杆菌中cre序列为TGWAARCGYTWNCW，与其他微生物中的cre序列相似^[3]。后续相关研究表明，在大多数情况下CcpA与cre位点的结合需要共阻遏蛋白HPr-(Ser)-P的参与^{[4, 5]}。Hpr (histidine-phosphoryl protein)是约10 kD的小分子量蛋白^[6]，有组氨酸残基和丝氨酸残基两个磷酸化位点，该蛋白的组氨酸残基在负责葡萄糖转运的PTS系统中EI的催化下进行磷酸化，并将磷传递给PTS系统，丝氨酸残基随后在Hpr激酶/磷酸酯酶HPrK/P (Hpr kinase/phosphoesterase)^[7]的催化下被磷酸化形成HPr-(Ser)-P，与转录调控因子CcpA形成复合体，参与CCR效应^{[8, 9]}。本研究拟通过EMSA验证Bti75中几丁质酶是否也受CcpA调控以及HPr-(Ser)-P是否参与这一调控，并通过qRT-PCR、Western blot检测ccpA敲除株和野生株在速效碳源-葡萄糖存在下chiA和chiB表达量的变化，来初步探究CcpA对几丁质酶基因的调控作用。

苏云金芽胞杆菌科以色列亚种75 (Bacillus thuringensis subsp. israelensis，简称Bti75)，本实验室保藏。Escherichia coli BL21(DE3)、E. coli DH5α、pET28a和pKSV7载体均由本实验室保藏；pHT315来自法国巴斯德所。

PCR扩增试剂(Taq plus DNA聚合酶，dNTPs)购自生工生物工程(上海)股份有限公司；PCR产物纯化、DNA胶回收纯化试剂盒、柱式质粒提取试剂盒及total DNA提取试剂盒、增强型HRP-DAB底物显色试剂盒以及标准DNA分子Marker Ⅱ、Marker Ⅲ、Marker Ⅳ、Marker Ⅶ及蛋白Marker均购自天根生物公司；限制性内切酶、T4连接酶、RNA提取及反转录所用试剂、Real-Time PCR试剂：SYBR Premix ExTaq (Perfect Real Time)均购自TaKaRa (大连)公司；生物素标记显色试剂盒购自Thermo fisher公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列见表 1。

LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 10.0，pH 7.2-7.4；基本检测培养基S (g/L)：(NH₄)₂SO₄ 2.0，K₂HPO₄ 18.2，KH₂PO₄ 6.0，Na-citrate 1.0，MgSO₄ 0.2，酵母浸粉5.0，pH 7.4；葡萄糖培养基(G)：在S中加入1%葡萄糖。Bti菌株于30 ℃培养，E. coli于37 ℃培养。

提取Bti75菌株的总DNA，将ccpA (CcpA-F/R)、chiA (ChiA-F/R)、chiB (ChiB-F/R)、hpr (Hpr-F/R)和hprK (Hprk-F/R)基因全长进行PCR扩增，通过酶切位点插入pET28α质粒中，转化感受态E. coli BL21(DE3)，挑取阳性单克隆菌落扩大培养，PCR及双酶切鉴定后，阳性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

重组蛋白利用蛋白C端的His标签与Ni柱亲和性，纯化CcpA、ChiA、ChiB、Hpr及HprK蛋白，诱导条件为：IPTG 终浓度为1.0 mmol/L，25 ℃、120 r/min诱导培养6 h。纯化条件为：分别用20、40、60、80、500 mmol/L洗脱液进行目的蛋白的洗脱，测定蛋白浓度，12% SDS-PAGE电泳分析。

纯化后的ChiA和ChiB蛋白送去北京华大蛋白有限公司制备兔抗多克隆抗体。

将20 μmmol/L的Hpr和1 μmmol/L的HprK一同加入反应体系中，反应液中含有10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.0)，50 mmol/L NaCl，1 mmol/L MgCl₂，0.5 mmol/L二硫苏糖醇，5%甘油，2 mmol/L ATP，20 mmol/L果糖-1,6-二磷酸(FBP)，37 ℃反应30 min后，于70 ℃孵育5 min终止反应。

EMSA (Electrophoretic mobility shift assay)实验首先以Bti75菌株总DNA为模板PCR扩增270 bp的chiA启动子区域DNA片段PchiA [以PchiA-F、PchiA-R或PchiA-R(B)为引物]。引物Pcre_chiB-F和Pcre_chiB-R [或Pcre_chiB-R(B)]退火获得包含chiB启动子区潜在cre位点的40 bpDNA片段Pcre_chiB，分别与CcpA蛋白一同加入至反应体系中，反应液中含有10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.0)，50 mmol/L NaCl，1 mmol/L MgCl₂，0.5 mmol/L二硫苏糖醇，0.5 mmol/L EDTA，5%甘油，如需要再分别加入Hpr或Hpr-Ser₄₅-P，混合后37 ℃反应30 min，凝胶电泳后紫外成像。在CcpA与生物素标记的启动子区域片段的特异性竞争结合实验中，再分别加入鲑鱼精DNA (非特异性竞争)和100倍、200倍的未用生物素标记的启动子区域片段（特异性竞争)，凝胶电泳后转至尼龙膜，利用生物素标记显色试剂盒显色。

设计引物erm-F/R，以pHT315质粒为模板PCR扩增包括启动子和终止子的红霉素抗性基因表达框，获得erm基因片段。以Bacillus thuringiensis HD789基因组(Genbank：CP003763.1)为模板设计引物ccpAup-F/R、ccpAdown-F/R，以Bti75总DNA为模板PCR扩增ccpA基因上、下游各1 kb左右DNA片段，将纯化后的PCR片段与pKSV7空载体通过酶切、酶连反应构建成erm基因在中间，ccpA基因上下游DNA片段位于两边的重组质粒。将重组质粒转入E. coli DH5α感受态，筛选阳性克隆，提质粒进行双酶切及测序鉴定，鉴定正确的质粒命名为pKSV-ued。

通过电转化将重组质粒pKSV-ued转入Bti75菌株中，利用同源重组原理将ccpA基因替换为红霉素抗性基因，再利用pKSV7质粒温度敏感的特点，42 ℃消除质粒，最终在红霉素抗性下生长而在含氯霉素的培养基中不生长的即为疑似ΔccpA敲除株，PCR及酶切鉴定敲除株。初步鉴定正确后送上海生工有限公司测序以进一步明确。

Trizol法分别提取Bti75和Bti75ΔccpA细菌的总RNA，以其为模板，Oligo dT为引物，逆转录制备Bti75和Bti75ΔccpA的cDNA。反应条件为：37 ℃ 15 min，85 ℃5 s。利用所制备的cDNA为模板，以16S rRNA基因作为内参，实时定量荧光PCR分别检测chiA、chiB的表达量。所使用引物序列见表 1。反应条件：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，共40个循环。

活化后的Bti75、Bti75ΔccpA菌株按1%分别接种至50 mL S和G培养基中，于30 ℃、200 r/min培养9 h，离心收集菌体，破碎细胞，收集上清，经12% SDS-PAGE分离后，转移至PVDF膜上，于含5%脱脂奶粉的PBST室温封闭2 h；加入兔抗ChiA一抗(1:2 000稀释)，4 ℃孵育过夜；0.05% PBST洗膜4次，每次15 min；加入HRP标记的羊抗兔二抗(1:5 000稀释)，37 ℃孵育45 min；0.05% PBST洗膜4次，每次15 min；利用增强型HRP-DAB底物显色试剂盒显色分析；ChiB蛋白的检测同上。

前期研究表明，Bti75菌株chiA和chiB的基因及启动子区域与Bacillus thuringiensis HD789菌株中的完全一致^{[10, 11]}。据此，利用Fujita^[12]所收集的枯草芽胞杆菌的中的cre位点，通过PREDetector软件^[13]预测发现Bti75菌株几丁质酶基因chiB上游启动子区存在一个潜在的cre位点cre_chiB (5′-TGTAAACGCTTTAT-3′)，与枯草芽胞杆菌中cre一致序列TGWAARCGYTWNCW^[3]高度类似，如图 1所示。同时并未在chiA上游启动子区发现类似的cre位点。因此，我们推测chiB可能受到CcpA的调控，而chiA并不受到CcpA的调控。

图 1　chiB上游启动子区域序列 Figure 1　Sequence of the chiB upstream region 注：下划线标注的为核心启动子；矩形框内为-10区和-35区；粗体表示cre位点；转录起始位点以圆点标记；起始密码子标记粗下划线. Note: The minimal promoter region is underlined with fine lines; Bounding box represent the -10 box and -35 box; The cre sequence is marked by bold; The transcription start site is in dot; The start codon is underlined with bold lines.

图选项

通过EMSA非特异性竞争结合实验和特异性竞争结合实验来检测CcpA能否特异性结合于PchiA和Pcre_chiB。CcpA (0.5 μmol/L)与生物素标记的Pcre_chiB (0.1 μmol/L)的反应中分别加入0.5 mg/L鲑鱼精DNA (非特异性竞争，图 2A)和100倍、200倍的未用生物素标记的Pcre_chiB (特异性竞争，图 2B)。如图 2A所示，鲑鱼精DNA可以完全的解除掉CcpA单独(泳道3)以及加入Hpr后(泳道5)与Pcre_chiB的结合；而加入了Hpr-Ser₄₅-P的反应中CcpA仍然有明显的阻滞条带(泳道4)。在特异性竞争过程中(图 2B)，当加入200倍未标记的Pcre_chiB时，加入Hpr-Ser₄₅-P的反应中的阻滞条带消失(泳道6)，而加入了Hpr的CcpA与Pcre_chiB的反应中仍有较为明显的阻滞条带(泳道3、4)。结果表明CcpA自身可以非特异性的与Pcre_chiB结合，且在Hpr-Ser₄₅-P的辅助下CcpA可以特异性的与Pcre_chiB发生结合。

图 2　EMSA验证CcpA与chiA和chiB启动子片段的结合 Figure 2　EMSA to determine the specific binding of CcpA with cre 注：A和B：CcpA (0.5 μmol/L)与PcrechiB (0.1 μmol/L)的非特异性竞争结合和特异性竞争结合. A：1：PcrechiB (Bio)；2：PcrechiB (Bio)+CcpA；3：PcrechiB(Bio)+CcpA+0.5 mg/L鲑精DNA；4及5：PcrechiB (Bio)+CcpA+0.5 mg/L鲑精DNA+ 2 μmol/L Hpr-Ser45-P或2 μmol/L Hpr. B：1：PcrechiB (Bio)；2：PcrechiB (Bio)+CcpA；3及4：PcrechiB (Bio)+CcpA+Hpr+100倍或200倍未标记PcrechiB，5及6：PcrechiB (Bio)+CcpA+ Hpr-Ser45-P+100倍或200倍未标记PcrechiB. C：CcpA (0.5 μmol/L)和PchiA (0.1 μmol/L)的非特异性竞争结合；1：PchiA (Bio)；2：PchiA (Bio)+CcpA；3：PchiA (Bio)+CcpA+0.5 mg/L鲑精DNA；4和5：PchiA (Bio)+CcpA+0.5 mg/L鲑精DNA+2 μmol/L Hpr-Ser45-P或 2 μmol/L Hpr；箭头所示为阻滞带. Note: A and B: Non-specific and specific competition assays of CcpA (0.5 μmol/L) with PcrechiB (0.1 μmol/L). A: 1: PcrechiB (Bio); 2: PcrechiB (Bio) and CcpA; 3: PcrechiB (Bio), CcpA, and 0.5 mg/L Salmon-sperm-DNA; 4 and 5: PcrechiB (Bio), CcpA, and 0.5 mg/L Salmon-sperm-DNA plus 2 μmol/L Hpr-Ser45-P and 2 μmol/L Hpr respectively. B: 1: PcrechiB (Bio); 2: PcrechiB (Bio) and CcpA; 3 and 4: PcrechiB (Bio), CcpA and Hpr plus 100- and 200-fold excess unlabled PcrechiB respectively; 5 and 6: PcrechiB (Bio), CcpA and Hpr-Ser45-P plus 100- and 200-fold excess unlabeled PcrechiB respectively. C: Non-specific competition assays of CcpA (0.5 μmol/L) with PchiA (0.1 μmol/L); 1: PchiA (Bio); 2: PchiA (Bio) and CcpA; 3: PchiA (Bio), CcpA, and 0.5 mg/L Salmon-sperm-DNA; 4 and 5: PchiA (Bio), CcpA, and 0.5 mg/L Salmon-sperm-DNA plus 2 μmol/L Hpr-Ser45-P and 2 μmol/L Hpr respectively. The arrows indicate retarded bands.

图选项

如图 2C所示，反应中加入了0.5 mg/L鲑鱼精DNA，结果发现在CcpA与PchiA的反应中无论是CcpA (泳道3)自身还是加入了Hpr-Ser₄₅-P (泳道4)或Hpr (泳道5)，鲑鱼精DNA都可以竞争掉CcpA与PchiA的结合，从而证明CcpA与PchiA之间的反应为非特异性反应。

qRT-PCR结果如图 3所示，无论是在基本培养基(S)还是在葡萄糖培养基(G)中，chiA基因的mRNA表达量在野生株Bti75中和敲除株ΔccpA中均无显著差异(图 3A)。如图 3B显示，就chiB的mRNA水平而言，基本培养基(S)中的野生株Bti75、敲除株ΔccpA以及葡萄糖培养基(G)中的敲除株ΔccpA这三者均无显著差异；而葡萄糖培养基(G)中Bti75 chiB的mRNA水平显著低于其余三者。

图 3　Bti75和Bti75ΔccpA中chiA (A)和chiB (B)的mRNA表达量 Figure 3　qRT-PCR analysis of the relative transcript level of gene chiA (A) and chiB (B) of Bti75 and Bti75ΔccpA strains in different mediums

图选项

如图 4A显示，Bti75和Bti75ΔccpA在S和G培养基中，ChiA蛋白的表达量都相差不明显。如图 4B所示，Bti75菌株在G培养基中，ChiB蛋白的表达量极少，ccpA基因敲除后，ChiB的量明显上升，与在S基本培养基中基本一致。Western blot结果与qRT-PCR结果基本一致，都显示CcpA对chiB基因的负调控。

图 4　Western blot检测ChiA和ChiB的含量 Figure 4　Western blotting to show the expression level of chiA and chiB in Bti75 and Bti75∆ccpA 注：M: Marker. A：Bti75和Bti75∆ccpA在S和G培养基中ChiA的含量；1和2：Bti75∆ccpA和Bti75分别在S培养基中；3和4：Bti75∆ccpA和Bti75分别在G培养基中. B：Bti75和Bti75∆ccpA在S和G培养基中ChiB的含量；1和2：Bti75∆ccpA和Bti75分别在S培养基中；3：Bti75ΔccpA在G培养基中；4：Bti75在G培养基中. Note: M: Marker. A: The expression level of the chiA of Bti75 and Bti75ΔccpA in the S medium and G medium; 1 and 2: Bti75∆ccpAand Bti75 in the S medium repectively; 3 and 4: Bti75ΔccpAand Bti75 in the G medium repectively. B: The expression level of the chiB of Bti75 and Bti75∆ccpA in the S medium and G medium; 1 and 2: Bti75∆ccpAand Bti75 in the S medium repectively; 3: Bti75ΔccpA in the G medium; 4: Bti75 in the G medium.

图选项

Heravi等推测短小芽胞杆菌中几丁质酶基因是受碳分解代谢物阻遏的控制^[14]，一般来说，在低GC含量的革兰氏阳性菌，如枯草芽胞杆菌中，发挥CCR作用的关键调节蛋白是CcpA。以往学者发现，CcpA与调控基因的启动子序列结合的保守序列为cre序列^[15]，并且在大多数情况下，CcpA与cre位点的结合需要共阻遏蛋白Hpr-(Ser)-p的参与^{[4, 5]}。后续研究表明，当葡萄糖等速效碳源存在时，胞内ATP及FBP水平的升高激活HprK/P的激酶活性，将HPr丝氨酸残基磷酸化，HPr-(Ser)-P与CcpA形成复合物，与非速效碳源代谢基因的cre位点结合，抑制其转录^{[5, 16]}。但具体在苏云金芽胞杆菌中的CCR效应，目前尚无研究报道。

本研究结果显示，转录因子CcpA蛋白确实能与chiB基因上游启动子序列发生特异性的结合，且Hpr-Ser₄₅-P起到辅助作用，这说明CcpA可能对苏云金芽胞杆菌chiB基因具有调控作用。进一步的研究证实了这一点：我们将ccpA基因敲除后，在葡萄糖存在的情况下，chiB基因的mRNA表达显著升高，ChiB蛋白表达量也显著提高，解除了葡萄糖的CCR效应。这些结果证实了CcpA对chiB合成的负调控作用，CcpA通过与chiB基因座启动子区cre位点结合，抑制chiB基因的转录，从而使ChiB的合成量降低。对于chiA而言，研究结果显示其基因座启动子区不存在cre位点，CcpA蛋白与chiA的启动子区结合为非特异性结合，Hammar等提出转录因子特异性结合其靶序列是通过在序列上可滑动地非特异结合在其特异性的位点^[17]，这可以在某些方面解释CcpA与chiA启动子区的非特异性结合。后续通过qRT-PCR和Western blot实验更进一步证实chiA基因不受CcpA蛋白的调控。

我们实验室前期研究发现，苏云金芽胞杆菌Bti75中ChiA分子量大约36 kD，为外切几丁质酶；ChiB分子量达70 kD，为内切几丁质酶；而且，ChiA和ChiB的表达均受YvoA蛋白的抑制，而几丁质的降解产物可以解除YvoA的抑制作用^{[18, 19, 20]}。在环境中没有几丁质诱导的情况下，受YvoA的抑制，chiA和chiB基因都不表达。如果同时存在几丁质和葡萄糖，YvoA的抑制被解除，而大分子量的ChiB蛋白表达仍被CcpA抑制，小分子量的ChiA蛋白基因被诱导激活，产生的ChiA可发挥其外切酶活性切割几丁质为氨基糖，可参与氮源代谢、合成细胞壁等。一旦葡萄糖缺乏时，CcpA解除对chiB的抑制作用，大量合成ChiB，与ChiA共同作用，大量、高效地切割环境中的几丁质为各种几丁寡糖。这样，在环境中速效碳源不足时，有利于苏云金芽胞杆菌迅速利用几丁质，在营养竞争中处于优势地位。我们认为CcpA对chiB具有抑制作用，而不调控chiA的表达使得Bti75更能适应复杂多变的自然环境。

本研究从计算机预测(in silico)、EMSA的离体(in vitro)实验和基因敲除后对活体(in vivo)的影响(qRT-PCR和western blot检测)三方面探索了CcpA蛋白对苏云金芽胞杆菌几丁质酶基因chiA和chiB的调控作用，有助于苏云金芽胞杆菌几丁质酶基因表达调节机理的阐明，为充分利用苏云金芽胞杆菌中的功能蛋白提供新的依据。