耐辐射微生物是一类十分重要的极端环境微生物资源，对于电离辐射、UV射线、化学诱变剂、强氧化剂和干燥剂具有很强的抗性，目前在细菌、古菌和真核生物中都有报道^{[1, 2, 3, 4, 5]}。大多数耐辐射细菌是革兰氏阳性菌，包括Deinococcus、Rubrobacter、Kocuria、Lactobacillus、Enterococcus、Kineococcu和Serratia等属的菌株^{[3, 4, 6]}。只有少数耐辐射细菌是革兰氏阴性菌，例如Methylobacterium^[7]和Chroococcidiopsis^[8]等属的菌株。在所有耐辐射微生物中，耐辐射奇异球菌(D. radiodurans)是迄今发现的辐射抗性最强的菌株^{[1, 3]}，与它同属的细菌也大多具有较强的辐射抗性。在芽胞杆菌辐射抗性研究方面，目前大多数研究集中在芽胞抗性方面，对生长期细胞辐射抗性的研究不是十分深入。目前已报道从含盐土壤或热泉中分离得到γ-射线耐受菌株Bacillus sp. HKG112^[9]和巨大芽胞杆菌WHO^{[10, 11]}。Shivaji等报道阿氏芽胞杆菌B8W22生长期细胞具有较强的UV抗性^[12]。陈晓明等观察了枯草芽孢杆菌黑色变种营养体细胞对中子、脉冲X光和紫外线的耐受性^[13]。研究耐辐射芽胞杆菌的辐射抗性，不仅可以促进人们对生物体辐射抗性机理的了解，还有助于揭示辐射相关的抗氧化保护机制。

西藏自治区位于青藏高原的西南部，平均海拔在4 000 m以上，高寒、缺氧、降水少、日照长、辐射强。其独特的自然地理环境，使之蕴含着丰富的生物资源宝藏。在2010-2011年间，本课题组先后两次赴西藏采集了大量土壤样品，并已报道一株耐辐射革兰氏阴性菌株Belnapia sp. F-4的分离和鉴定^[14]。本研究对另一个耐辐射菌株Bacillus aryabhattai T61进行了分离鉴定和UV辐射抗性分析。

菌株T61分离于西藏冈巴拉山土样，由本实验室分离保存。对照菌株耐辐射奇异球菌(Deinococcus radiodurans，CGMCC1.633)和枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis，CGMCC1.1391)购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心。大肠杆菌(Escherichia coli K12)由中国农业科学院张维研究员馈赠。巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium，ACCC10245)由中国农业微生物菌种保藏管理中心张晓霞副研究员馈赠。Bacillus aryabhattai DSM21047购自德国微生物菌种保藏中心DSMZ。T61、Bacillus aryabhattai DSM21047、Bacillus megaterium和Deinococcus radiodurans用TGY培养基(g/L，胰蛋白胨5、酵母提取物3、葡萄糖1，pH 7.0) 30 ℃培养。Escherichia coli用LB (Luria- Bertani)培养基(g/L，蛋白胨10、酵母粉5、NaCl 10，pH 7.0) 37 ℃培养。Bacillus subtilis用BPY (Beef-Protein-Yeast)培养基(g/L，牛肉膏5、蛋白胨10、酵母粉5、葡萄糖5、NaCl 5，pH 7.0) 37 ℃培养。

取1 g土样加入5 mL 0.1 mol/L磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中，充分振荡30 min，混匀静置20 min后，取100 μL上清液涂布于TGY固体培养基，30 ℃培养。挑取单菌落在TGY培养基上划线纯化，获得纯培养菌株。

将菌株培养至对数早期(OD₆₀₀=0.3-0.4)，分别吸取20 mL菌液，5 000 r/min离心5 min，收集菌体沉淀。用0.1 mol/L磷酸钾缓冲液洗涤两次并等体积悬浮。之后分别吸取1.5 mL悬液加入直径30 mm的无菌培养皿中，放入灭菌磁针，开盖置于电动旋转平台上(转速20-30 r/min)，进行紫外线辐照，辐照剂量为400 J/m²。UV处理后，将菌液用0.1 mol/L磷酸钾缓冲液适当稀释，取100 μL稀释液涂布TGY固体培养基。每个处理重复3次。以对数早期D. radiodurans和E. coli K12为对照，计算辐射存活率，选取辐射生存率较高的菌株进行下一步实验。

采用Leica-DMRE显微镜(德国莱卡公司)和Hitachi SU8010冷场发射扫描电子显微镜(日本日立公司)观察菌株形态特征。革兰氏染色采用标准的革兰氏染色方法^[15]。采用API 20E、API ZYM和API 50CHB/E试剂条(BioMérieux inc.)测定菌株的生理生化特点，按照厂家说明书进行操作。生长温度测定：采用TGY固体培养基在4、20、30、37和50 ℃培养5 d，观察生长情况。生长pH测定：采用TGY液体培养基在pH 5.0-10.0范围内(间隔1.0) 30 ℃、200 r/min培养24 h，观察生长情况。抗生素抗性分析：采用药敏纸片(杭州微生物试剂有限公司)，终浓度为(mg/L)：氨苄青霉素(Amp) 10、氯霉素(Cm) 30、卡那霉素(Km) 30、四环素(Tc) 30、链霉素(Sm) 10、红霉素(Erm) 15、壮观霉素(Spc) 100、利福平(Rif) 5。具体方法是：挑取T61单菌落于5 mL TGY液体培养基中，30 ℃、200 r/min培养2-8 h。用灭菌棉拭子蘸取菌液，涂布整个TGY培养基表面。待平板上的水分被琼脂完全吸收后贴药敏纸片。经30 ℃温箱培养18-24 h后，观察菌落生长情况。

菌株基因组DNA提取采用CTAB法^[16]。以菌株基因组DNA为模板，以细菌16S rRNA基因通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′)和1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR扩增。反应体系(50 μL)：ddH₂O 37.75 μL，27F和1492R (10 μmol/L)各1 μL，10×缓冲液(40 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl₂，pH 8.3) 5 μL，dNTPs 2 mmol/L 4 μL，模板1 g/L 1 μL，Taq酶5 U/μL 0.25 μL。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 90 s，72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃ 10 min。LYPCR产物克隆到pEASY-T3 (TransGen Biotech)载体上，转化Trans1-T1感受态细胞(TransGen Biotech)中，筛选正确的阳性克隆在生工生物工程(上海)有限公司进行测序。测序结果在EzTaxon网站与细菌模式菌株的16S rRNA基因序列进行比对。用MEGA 5.0对16S rRNA基因相似度高的菌株进行系统发育分析。

由中国科学院微生物研究所对菌株进行脂肪酸成分分析，所用仪器是美国MIDI (Microbial Identification)公司Sherlock全自动细菌鉴定系统。深圳华大基因科技有限公司利用Illumina Hiseq 2000对菌株T61进行了全基因组测序，并根据基因组DNA的G、C碱基数目的比例，确定G+C含量^[9]。

DNA-DNA杂交由中国工业微生物菌种保藏管理中心进行鉴定。所用仪器为Beckman Coulter DU800 UV/VIS Spectrophotometer (德国贝克曼公司)。将实验菌株T61分别与巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium DSM32)和阿氏芽胞杆菌(Bacillus aryabhattai DSM21047)进行DNA杂交。

为避免芽胞对UV辐射抗性测定的影响，将芽胞杆菌T61新鲜液体培养过夜物按1:3 000的比例接入TGY液体培养基，30 ℃、200 r/min培养至对数早期(OD₆₀₀约为0.3-0.4)，另外两种对照菌B. megaterium和B. subtilis也按以上方法处理，在Leica-DMRE显微镜下镜检，没有观察到芽胞。之后按照1.2的方法，5 000 r/min离心5 min收集菌体，用0.1 mol/L的磷酸钾缓冲液(pH 7.0)洗涤并悬浮。取l.5 mL细胞悬液加入直径30 mm无菌培养皿中，置于电动旋转平台上进行UV辐照，辐射波长254 nm，辐照剂量为0、200和400 J/m²。UV处理后，用0.1 mol/L磷酸钾缓冲液适当稀释菌液，取100 μL稀释液涂布于TGY固体培养基上，每个处理重复3次。以对数早期D. radiodurans、E. coli K12、B. megaterium和B. subtilis为对照，计算辐射存活率并绘制生存曲线。

从400 J/m² UV辐射后的西藏土壤样品中得到一株具有较强辐射抗性的菌株T61。在TGY固体培养基30 ℃培养14 h后，菌落为圆形，微黄色，表面平坦湿润，菌落内部呈黏液状，直径大约2-5 mm。菌株T61革兰氏反应阳性，能运动，可以产生内生孢子。在扫描电子显微镜下，T61菌株的细胞形态为杆状，长度约为2 μm，直径约为1 μm (图 1)。生理生化实验显示，T61与阿氏芽胞杆菌模式株DSM21047一致，氧化酶、磷酸酶、酯酶、半乳糖苷酶等阳性，胰蛋白酶、芳胺酶等阴性；可以利用甘油、L-阿拉伯糖、核糖、D-木糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、海藻糖等产酸；可以利用丙酮酸、葡萄糖、甘露醇、蔗糖、蜜二糖等碳源，但不能利用山梨醇、鼠李糖等。T61菌株在10-37 ℃、pH 6.0-10.0条件下可以生长，最适温度30 ℃，最适pH 7.0。抗生素试验显示，T61对氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、四环素、链霉素、红霉素、壮观霉素、利福平敏感，不具抗性，有利于细菌的遗传操作。

图 1　菌株T61的扫描电子显微镜图片(液体TGY饱和培养物) Figure 1　The scanning electron microscopic photographs T61 cells grown to saturation in TGY medium

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将T61的16S rRNA基因序列与EzTaxon细菌模式菌株的16S rRNA基因序列进行比较，结果表明，T61与阿氏芽胞杆菌B8W22^T (Bacillus aryabhattai B8W22^T=DSM21047)相似度最高，达到99.93%，与巨大芽胞杆菌IAM13418^T (Bacillus megaterium IAM13418^T=DSM32)相似度为99.53%。基于16S rRNA基因序列构建了T61与亲缘关系相近种的系统发育树(图 2)。系统发育树表明菌株T61与阿氏芽胞杆菌和巨大芽胞杆菌的进化距离非常近，是Bacillus属的一个菌株，暂定名为Bacillus sp. T61。

图 2　根据16S rRNA基因序列构建的T61与亲缘关系相近菌种的系统发育树 Figure 2　Phylogenetic dendrogram obtained by distance-matrix analysis of 16S rRNA gene sequences indicating the position of strain T61 among its phylogenetic neighbors 注: 括号里的数字为GenBank登录号；节点上的数字为Bootstrap值(1 000次重复抽样的百分比)；比例尺代表每100个核苷酸中有0.5个核苷酸发生替代. Note: Numbers in parentheses are GenBank accession numbers; Bootstrap values (expressed as percentages of 1 000 replications) are given at nodes; The scale bar represents 0.5 substitutions per 100 nucleotide positions.

图选项

脂肪酸组成测定表明T61含有C14:0 iso、C14:0、C15:0 iso、C15:0 anteiso、C16:0 iso、C16:1 w11c、C16:0和C17:0-anteiso (表 1)。与阿氏芽胞杆菌和巨大芽胞杆菌模式株相比，菌株T61的脂肪酸组成更接近于阿氏芽胞杆菌B8W22^T。

T61基因组DNA的G+C含量为38.02%，与阿氏芽胞杆菌模式菌株B8W22^T一致^[12]。DNA-DNA杂交结果显示，在全基因组水平上，T61与阿氏芽胞杆菌B8W22^T的相似度为81.4%，而与巨大芽胞杆菌IAM13418^T的相似度只有50.3%。根据以上结果，确定T61为阿氏芽胞杆菌的一个菌株，命名为Bacillus aryabhattai T61。

将菌株T61和对照株分别培养到对数生长早期(OD₆₀₀约为0.3-0.4)，取细胞悬液接受不同剂量的UV 辐射，绘制生存曲线，结果见图 3。可以看出，B. aryabhattai T61菌株的辐射抗性显著高于辐射敏感的E. coli K12 、B. megaterium和B. subtilis，而与耐辐射菌株D. radiodurans相接近。在辐照剂量达100 J/m²时，E. coli K12 的存活率已降至0.001%以下，而B. aryabhattai T61的存活率仅下降1个数量级(D₁₀=100 J/m²)。随着辐射剂量的增加，T61依然保持较高的存活率，而对照菌株B. megaterium和B. subtilis在辐照剂量超过200 J/m²时，存活率都下降至0.01%以下。

图 3　菌株T61 UV辐射生存曲线 Figure 3　Survival curves of T61 after exposure to UV radiation

图选项

本研究从来自西藏冈巴拉山的土样中分离了一株耐辐射芽胞杆菌T61。系统进化树分析表明，T61与阿氏芽胞杆菌B8W22^T和巨大芽胞杆菌IAM13418^T的相似度最高，16S rRNA基因的相似度分别达到99.93%和99.53%。但DNA-DNA杂交分析表明，在全基因组范围内，T61与阿氏芽胞杆菌B8W22^T的相似度为81.4%，而与巨大芽胞杆菌IAM13418^T的相似度只有50.3%。结合形态和生理生化分析，确定T61为阿氏芽胞杆菌的一个菌株，命名为Bacillus aryabhattai T61。T61对UVC辐射具有较强抗性，对数期细胞D₁₀为100 J/m²。

目前在芽胞杆菌辐射抗性研究方面，大多数研究集中在芽胞的辐射抗性方面，常用的实验系统有枯草芽胞杆菌和短小芽胞杆菌等^{[17, 18, 19]}。近年来，一些研究报道芽胞杆菌生长期细胞具有较强的辐射抗性。Gupta等从含盐土壤中分离得到Bacillus sp. HKG112，在γ-射线辐射下，该菌株的对数期细胞(OD₆₆₀=0.3) D₁₀达到12.5 kGy^[9]。Yazdani等报道Bacillus megaterium WHO的对数期细胞也表现出较强的γ-射线辐射抗性，D₁₀约为10 kGy^{[10, 11]}。Shivaji等对阿氏芽胞杆菌B8W22对数生长后期细胞(OD₆₆₀=1.0)进行UV抗性测定，在UV剂量为0.1 J/cm²时的存活率为20%^[12]。陈晓明等将枯草芽孢杆菌黑

色变种37 ℃、200 r/min培养12 h获得营养体细胞，并测定了细胞对中子、X光和紫外线的辐射抗性，其中对UVC的D₁₀达到16.68 J/cm^2[13]。本研究以辐射敏感和抗性菌株为对照，表明阿氏芽胞杆菌T61对数期细胞(OD₆₆₀约为0.3-0.4)对UVC具有较强的辐射抗性，并且前期工作证实该菌株对γ射线也具有较强的抗性，D₁₀值为4 kGy^[20]。需指出的是，由于各研究组所用辐射设备和辐射条件不同，受试菌株的生长期不一致，因此难以对各菌株的辐射抗性强弱进行比较。

目前对芽胞杆菌的辐射抗性及其调控机理还所知甚少。在未来的工作中，将以阿氏芽胞杆菌T61为实验系统，进一步克隆和分析辐射抗性相关基因，研究辐射抗性的转录调控机制，以期拓宽对细菌辐射抗性机理的认识。同时，利用耐辐射芽胞杆菌抗逆性很强的特点构建的工程菌，将在污染环境的生物修复、饲料、肥料加工业等方面具有广阔的应用前景。