自20世纪抗生素被发现以来，其在医疗及养殖等领域发挥了重要作用。然而近年来随着抗生素的大量使用，甚至滥用，已经导致抗生素耐药性的蔓延。在人类和动物致病菌中，人和动物的共生菌中都出现了抗生素耐药性，并由单一耐药性发展到多重耐药性。目前致病菌耐药性的增加和扩散已经成为全球疾病治疗所面临的一个巨大问题，加之新抗生素的研发速度持续下降，使得世界许多地区面对一些致命感染时“无药可用”^[1]。致病菌对抗生素产生耐药性的主要原因是其携带有各种抗生素抗性基因(Antibiotic resistance genes，ARGs)，而越来越多的证据显示，致病菌耐药性的扩散与环境中抗生素抗性微生物(Antibiotic resistance bacteria，ARB)和ARGs紧密相关^[2]。这些ARB和ARGs广泛分布在各个环境介质中，如土壤、表层水环境、沉积物、畜禽养殖场的污水池、畜禽粪便、污水处理厂、地下水、饮用水、甚至空气中。不同于传统化学污染物，ARGs因其固有的生物学特性，表现出独特的环境行为，如可复制性、传播性和环境持久性等特点。ARGs可通过基因水平转移(Horizontal gene transfer，HGT)等机制在各环境介质中的微生物之间传播，而环境中拥有这种内在机制的微生物成为一个巨大的ARGs储存库。一旦这些ARGs进入到人类或动物致病菌中，将会对人类的公共健康构成潜在的威胁。

目前对于环境中抗生素耐药性的污染现状缺少足够的信息，对环境介质中的ARB和ARGs进行高效检测显得尤为重要，但相关采样、检测分析方法尚未标准化，研究方法体系亟待优化和完善。因此本文综述了近年来国内外对不同环境介质中ARB和ARGs的检测方法，旨在为进一步研究环境中抗生素耐药性提供研究思路和技术支持。

1 样品的采集与预处理

对于水、污泥、土壤、粪便等样品，可以直接采集。对一些要求较高的样品，为避免外源污染可利用无菌装置来贮存。为保持样品新鲜，减少基因组DNA降解，采集的样品应尽快运回实验室，运输过程中可使用干冰等保持低温。样品在实验室以4 ℃保存，24 h内进行预处理。如不能及时处理，应在更低温度下(如-80 ℃)保存样品。对于水样的预处理，一般采取抽滤方式对微生物进行富集处理。例如抽取一定体积水样通过0.45 μm或0.22 μm滤膜，待滤膜堵塞后收集滤膜做进一步处理^[3]。而土壤、污泥等固体样品可冻干后，或者直接对新鲜样品提取DNA (如后期要对ARGs进 行定量，需测定新鲜样品的含水率，将结果换算成单位重量干物质中的基因拷贝数方便比较分析)^[4]。

由于空气中微生物生物量相对较低，且携带ARGs的微生物在空气中以气溶胶形式存在，因此对空气样品中ARB和ARGs的采集需要配备一些专业的采样器装置，采样方法主要借鉴生物气溶胶的采集方式，按原理可分为撞击式、离心式、气旋式及过滤式采样法等^[5]。目前较常见的是利用固体撞击式采样器(Andersen)^[6]和液体撞击式采样器(AGI-30)^[7]来采集空气中的抗性微生物。

2 检测方法

抗生素耐药性的研究主要包括ARB、ARGs以及基因水平转移机制的检测和表征。其研究方法大体可分为两类：传统微生物培养法和分子生物学方法。

2.1 传统微生物培养法

用于检测抗生素耐药性的传统培养法是基于微生物的纯培养，虽然环境中的大部分微生物不能在人工条件下培养，但这种传统培养法操作简单灵活、成本低、标准化程度高，因此在一些耐药性研究中(如识别微生物的耐药性模式，评估耐药性发生率)依然发挥作用。此外通过微生物筛选方法获得纯菌有助于更深入地研究ARB的耐药性机制，同时传统培养法也为研究ARB细胞的生理学及对ARGs进行常规分子生物学检测提供基础。

传统培养法可用于评估微生物对抗生素的敏感性(或耐受程度)，常见的药敏实验主要有纸片扩散法(K-B琼脂法)、稀释法(肉汤稀释法和琼脂稀释法)、抗生素浓度梯度法(E-test)及利用自动化仪器(如BD Phoenix、Vitek 2等全自动微生物分析仪)。例如K-B琼脂法是测量含抗生素纸片周围抑菌环的直径大小，稀释法可测量抗生素的最小抑菌浓度(MIC)。传统培养法可用于考察环境样品中可培养微生物的耐药率。在选择性培养基中添加适当含量的抗生素，能耐受此浓度的微生物可被视作ARB，根据ARB数量占总菌数(培养基中不加抗生素)的百分比可以估算微生物对一种或多种抗生素的耐药率。对于一些代表性菌属，如水环境中常见指标微生物大肠杆菌、肠球菌等，通过计算其耐药率，可以一定程度上快速了解抗生素耐药性在环境中的传播和归趋。例如Novo等^[8]通过检测污水处理厂进出水中的微生物(异养菌、肠杆菌和肠球菌)对阿莫西林、四环素和环丙沙星的耐药性，对污水厂中抗生素耐药性的负荷进行了评估。

常见的选择性培养基有LB培养基、M-H培养基、R2A/R3A培养基等。例如Gao等^[9]在对水产养殖系统的耐药性研究过程中，在营养肉汤培养基中加入不同浓度的四环素和磺胺甲恶唑，来统计不同抗生素浓度下ARB的存活数目，并利用LB培养基对ARB进行分离和富集培养，采用分子生物学技术检测其所携带的ARGs。Huang等^[10]采用添加有不同浓度四环素的M-H培养基对污水厂中的ARB进行药敏试验。Munir等^[11]利用添加一定浓度抗生素(四环素16 mg/L和磺酰胺50.4 mg/L)的R2A培养基对污水处理厂的进出水、生物固体样品中的四环素类和磺胺类ARB进行了筛选，利用异养菌平板计数法(HPC)对ARB的浓度(CFU/mL)和在总可培养菌中所占比例进行了考察。R2A培养基由于可以修复被氯离子损伤的细菌，使其能在培养基上正常生长，从而可纠正损伤细菌带来的结果偏差，因此对来自污水厂、医院等常用氯消毒的地方的样品，可考虑用R2A培养基。此外，由于环境样品中微生物组成复杂，可以在培养基中添加抗真菌剂(如放线菌酮)来防止真菌生长^[9]。

此外，传统培养法为鉴定ARB的种属类型，了解ARGs的宿主特征提供了基础，这有助于追踪抗生素耐药性的来源和传播途径。ARB的种属鉴定可以通过传统的生理生化法完成，如观察菌落形态结构和生长特性，进行生化实验鉴定等，也可借助自动化分析仪器(如Biolog)进行鉴定。目前常用的ARB种属鉴定方法是16S rRNA基因鉴定法，其将传统培养法与分子生物学技术相结合，即对微生物富集培养后，利用PCR对16S rRNA基因片段进行扩增后再测序，与NCBI库中已知序列进行BLAST比对，从而得到鉴定结果。

2.2 分子生物学方法

近年来发展迅速的分子生物学技术因其快速灵敏、特异性高的特点，已经成为检测环境样品中ARGs及ARB的主要方法。由于该技术不依赖于微生物的筛选培养过程，因此不只局限于可培养微生物耐药性的检测，还能直接对环境微生物中的主体——不可培养微生物的耐药性进行检测，使得到的结果更为全面可信^[12]。

2.2.1 简单及复合PCR方法：在多种分子生物学手段中，聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)方法是最为经典的用于环境样品及纯菌株中ARGs的检测方法。常见步骤为：(1) 样品DNA的抽提。可以利用直接溶解法手动提取DNA，即通过物理、化学或酶的作用来裂解细胞，获取样本DNA，如SDS法。此外还可利用各类试剂盒提取DNA，即先使核酸吸附于固相介质上，洗涤去除杂质后，再使DNA溶解到纯水或缓冲液中，常见的试剂盒如FastDNA、UltraClean等。(2) 目标基因的引物设计。(3) PCR扩增反应。(4) 凝胶电泳验证扩增产物。需要注意的是，由于PCR检测中可能会有假阳性结果出现，因此常常还需配合DNA测序的方法来识别特定的ARGs。

为节省更多时间和精力，一些研究采用复合PCR (Multiplex PCR)方法，即在同一个PCR反应体系内应用多对引物，扩增多个不同的ARGs片段。Hu等^[13]利用复合PCR方法检测了7种氨基糖苷类抗生素耐药基因。Koczura等^[14]利用该方法从来自污水处理厂、河流及临床样本中的大肠杆菌中分离出携带有整合子的抗性菌株。复合PCR被认为是 一种快速简捷的检测各种ARGs的方法，但这种方法也存在一些缺点，如可能出现假阴性结果，引物间配对而对反应造成干扰，导致特异性差等^[15]。

普通PCR技术不仅可以单独用于ARGs的定性分析，还可以与其他多种方法相结合用于ARGs及ARB的检测。例如与传统微生物培养法相结合，可检测纯菌株所携带的ARGs；与变性梯度凝胶电泳技术结合(PCR-DGGE)，可以对携带ARGs的微生物进行种属鉴定，追溯ARGs的来源，还可以考察抗生素胁迫下的微生物群落结构变化。此外PCR方法还为其他技术(如DNA 杂交和DNA微阵列技术，见2.2.3)成功用于环境样品中ARGs的检测提供了基础。

2.2.2 定量PCR方法：由于普通PCR只能对环境中ARGs进行定性检测，近年来，越来越多的研究采用实时荧光定量PCR (Real-time quantitative PCR)技术作为检测手段，从数量上更为直观地表征环境中ARGs的水平，有助于探寻其在环境介质中的迁移和传播等行为的规律。该技术将传统PCR与荧光能量传递技术相结合，借助荧光信号来检测PCR产物。荧光标记探针与扩增产物结合后，被激发的荧光强度与扩增产物的量成正比，从而实现精确定量。目前使用较多的是基于SYBR GreenⅠ荧光染料的定量PCR方法，其灵敏度高、使用简便且成本较低，已被用于多种环境介质中的ARGs的定量，如土壤、畜禽养粪便、地表水、沉积物、污水处理厂等^[16-19]。但SYBR GreenⅠ特异性较差，可与任何DNA双链结合，因此也可能与引物二聚体或非特异性产物结合，产生假阳性信号，必要时可配合凝胶电泳法来检验是否有此类干扰的产生。此外，基于Taqman荧光探针的定量PCR方法也是一种常见手段，如用于污水处理系统、自然水体、农业生态系统中的ARGs定量^[20-21]。

然而，传统的荧光定量PCR方法一般每次只能对几种或几十种ARGs进行定量分析，这在一定程度上限制了人们对环境中ARGs分布的更深入的认识。新近发展的高通量荧光定量PCR技术(High-throughput quantitative PCR)突破了这种局限性，可同时对多达上百种ARGs或多个样品进行定量分析，大大提高了效率。如Zhu等^[22]利用高通量荧光定量PCR技术对我国大型养猪场及周边地区的猪粪、猪粪堆肥和施用堆肥的土壤样品中可能存在的244种ARGs进行了检测和定量，共检测到 149种ARGs，基本涵盖了目前已知的主要ARGs类型，如表 1所示。Wang等^[23]也利用同样的技术，选取长期进行再生水浇灌的公园土壤为研究对象，同时对285种ARGs和9种转座子酶基因进行研究，共检测到147种ARGs。再生水浇灌土壤中的ARGs丰度明显高于空白对照样品(99.3-8 655.3倍)，其中氨基糖苷类和β-内酰胺类抗性基因在所有土样中所占的比例最多。

利用定量PCR方法对ARGs定量时，结果主要有以下几种表达方式：(1) 绝对丰度，即单位体积或重量的环境样品中所含ARGs的绝对拷贝数(ARGs copies/mg或ARGs copies/mL)。(2) 相对丰度，即样本中ARGs的绝对拷贝数与内参基因16S rRNA基因绝对拷贝数的比值(ARGs/16S rRNA)。由于16S rRNA基因在微生物中的表达量相对稳定，可用来指示环境样本中微生物数量，因此ARGs的相对丰度可以代表ARGs在样品微生物种群中的相对含量，也可表征抗生素对ARGs的诱导能力。相对丰度为不同采样点中ARGs数量的比较提供了方便，减少样品微生物数量不同所带来的偏差^[18]。(3) 富集倍数(Fold change)，即根据高通量荧光定量PCR法所检测的循环阈值C_t，计算出待测样品中目的基因相对于对照样品中目的基因的富集倍数^[23]。具体可依据研究目的及实验手段不同，选择合适的定量表达方法。

2.2.3 DNA杂交及DNA微阵列技术：DNA杂交技术通过所使用的探针对已知序列进行特异性的靶序列检测，其用于检测特定ARGs已有30多年历史，并且在探针设计和合成方面还在不断改善中。DNA杂交技术被用于区分同一家族不同种类的ARGs，来进行系统命名，或被用于识别特定环境中存在的ARB和ARGs^[15]。Agersø等^[24]利用该技术证实四环素类抗性基因和Class 1整合子可从土壤分离菌株中共转移到大肠杆菌和/或恶臭假单胞菌中。Shah等^[25]利用DNA杂交技术，配合PCR扩增与产物测序等方法从养鱼场的菌株中检测到四环素类、甲氧苄氨嘧啶类、β-内酰胺类、氨基糖苷类、氯霉素类、红霉素类等多种类型的ARGs和int1整合子。

DNA微阵列(DNA microarray)，也叫基因芯片，是新一代基因诊断技术，具有快速高效、高并行性、自动化等特点，它将大量已知序列探针固定在微小的芯片上，通过与样本中若干靶核苷酸序列进行杂交，从而可以同时快速检测出样本中大量基因的表达情况。目前DNA微阵列被广泛应用于临床医学上检测致病菌中的ARGs，但其用于检测环境样品中ARGs的报道较少，这主要是由于环境样品基质复杂，一些污染物的存在可能会干扰目标基因的检测，因此样品在检测前还需复杂的前处理过程^[26]。另外由于该技术的检测限较低，用于检测环境样品时往往还要配合PCR方法^[15]。Patterson等^[27]利用基因芯片从土壤和动物粪便样品提取的DNA中检测出23种四环素类抗性基因和10种红霉素抗性基因。

2.2.4 宏基因组学方法：宏基因组学方法(Metagenomics)是将环境样品中的DNA直接克隆到合适的载体并导入宿主细菌中，进而筛选目的基因及进行测序分析等。利用该方法可以检测环境微生物的抗生素抗性组学(Antibiotic resistome)，即微生物中所有ARGs的集合，如致病菌和抗生素产生菌所携带的ARGs，存在于细菌染色体上通常不表达或低表达的抗性基因(Cryptic embedded genes)，以及具有较低抗性或者与抗生素密切相关，有可能进化为ARGs的抗性基因前体(Precursor genes)^[28]。配合新一代测序技术，宏基因组方法可以发掘环境中新型的ARGs，而不局限于已知序列的ARGs。此外通过检测转移基因组(Mobilome)，宏基因组方法还能为研究微生物之间的ARGs水平转移提供技术支持^[29]。

图 1描述了宏基因组方法用于检测土壤环境中ARGs的大体流程^[30]：(1) 宏基因组DNA提取与纯化：直接法，对土样中微生物进行原位裂解，提取宏基因组DNA并纯化；间接法，先将微生物细胞从土样中分离出来再提取基因组DNA，可进一步通过标记和分类细菌细胞(如FISH或流式细胞仪方法)获取目标种群的基因组DNA，实现单细胞全基因组测序等目的。(2) 宏基因组文库的构建：将基因组DNA克隆到合适的载体中，将载体转化到宿主细菌，构建文库。(3) 宏基因组文库的筛选和分析：文库的筛选方案主要有功能驱动(生物活性)筛选、序列驱动筛选、化合物结构水平筛选以及底物诱导基因表达筛选；宏基因组DNA的测序，为完善ARGs公共数据库提供支持。此外，宏基因组方法还可与传统培养法或PCR方法相结合，直接对目标ARB或ARGs进行检测。

近年一些研究开始利用宏基因组方法探索受人类活动干扰环境中及远离人类干扰的自然环境中ARGs的分布、多样性及迁移转化过程^[31-33]。

Fang等^[34]利用该方法在鸡粪和长期施用鸡粪的土壤中检测到22类ARGs和32种人类致病菌及 46种由致病菌所携带的抗性基因。样品中四环素抗性基因和多重耐药基因的相对丰度较高，主要致病菌为炭疽芽孢杆菌、百日咳杆菌、结核分枝杆菌和溃疡分枝杆菌等，致病菌所携带的抗性基因主要为sul1和大环内酯类-林可胺类-链阳性菌素耐药基因。Su等^[29]利用功能基因组学的方法筛选了土壤样品中多种ARGs，同已知的ARGs相比，发现氨基酸水平上只有2%的ARGs的相似性在90%以上，而67%以上ARGs的相似性低于60%，这表明环境中还有很多尚未被认识的ARGs。

对宏基因组的测序分析，目前主要有Sanger/鸟枪法和高通量测序技术(High-throughput sequencing)。高通量测序技术又称第二代测序技术，可并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，具有高输出量、高解析度的特点，使测序时间与费用大大减少，该技术已逐渐取代传统Sanger法在大规模测序上的应用。目前主要代表平台有Roche 454焦磷酸测序(Pyrosequencing)、Illumina Solexa合成测序、ABI SOLiD连接法测序等。人们利用高通量测序技术可直接对环境样品的DNA进行测序，通过序列比对来鉴定ARGs。虽然该方法需依靠后期强大的生物信息学分析，并高度依赖于现有ARGs数据库的完善程度，但可帮助研究者跨过文库构建这一步骤，也在很大程度上避免了功能宏基因组方法在克隆偏好、异源表达方面的缺陷，同时可对多环境介质中ARGs及控制基因水平转移的可移动基因元件(Mobile genetic elements)的分布和多样性进行研究比较。近年来基于高通量测序技术的宏基因组方法逐渐成为环境中耐药性检测的有力工具。例如Staley等^[35]通过功能基因组学法和高通量测序对密西西比河上游提取的DNA进行检测，发现氨苄青霉素、头孢噻吩、卡那霉素及四环素类抗性基因的检出频率较低。Kristiansson等^[36]使用宏基因组学和焦磷酸测序法在抗生素生产废水受纳河流的沉积物中检测到高丰度的ARGs及可移动基因元件，其中包括两类新型的携带ARGs的质粒。Zhang等^[37]利用宏基因组技术与Illumina高通量测序对污水处理厂活性污泥的质粒基因组进行分析，发现高丰度、多样性的ARGs及大量可移动基因元件(包括整合子、转座子和质粒)的存在。

2.3 两类方法的比较与结合

这两类方法侧重点不同，各有优缺点^[38](表 2)，抗生素的培养基从环境中筛选ARB，利用药敏试验可确定该菌株的抗性谱，通过DNA提取、PCR扩增等分子生物学方法来检测该菌株中的ARGs及可移动基因元件^[24]。例如，Mokracka等^[39]结合筛菌和分子生物学技术，从城市污水厂中筛选了1 832株肠杆菌，其中221株携带有I型或Ⅱ型整合子，并在其中发现了多种抗药基因盒。Silveira等^[40]在不同来源的肠球菌中发现铜抗性基因与多种ARGs具有共转移的特点。虽然该路线在不可培养微生物方面有很大局限性，但可以直接获得特定菌株，特别是致病菌的耐药性信息。此外以筛选出的ARB作为供体，以对抗生素敏感的模式细菌如大肠杆菌等为受体，在一定条件下共同培养，利用分子生物学技术可以探究ARGs及可移动基因元件从供体向受体的转移概率，解析水平转移机制及影响因素^[41-42]。另一种思路是跳过菌株的分离培养，直接以环境总DNA基因组为研究对象，利用分子生物学手段对样本中ARGs进行定性定量分析，来获得环境样本的总体数据，并且结合系统发育树分析(克隆)、数据统计分析(如相关性分析)来探讨ARGs的来源、多样性、传播过程及影响因素^[18-22]。虽然该路线过去在识别ARGs的具体宿主方面有一定局限性，但随着宏基因组测序手段的不断成熟和普及，公共数据库的日益完善，可以基于功能基因或致病因子对ARB进行分类归属，帮助追溯ARGs的来源。例如Ju等^[43]利用宏基因组方法在市政污水处理厂污泥消化池中检测到323种ARGs及83种人类致病菌，并利用相关性统计方法绘制了一张ARGs与人类致病菌之间的共生关系网络图。不过单纯依赖分子生物学技术，不能像传统培养法直接对感兴趣的ARB进行辨识考察，也不能区分存活和灭活的ARB。

3 结语与展望

上述检测方法有各自的优点和缺陷，在某些应用方面存在重叠与竞争，因此在研究环境介质中抗生素耐药性时，应根据实验目的、样品性质等因素选择合适的检测方法。必要时可几种检测手段相结合，优势互补，从多个角度对ARB、ARGs及可移动基因元件进行检测和表征，使获得的结果更为全面和可靠。未来还应在以下几个方面加强研究：

(1) 提高检测技术的速度，增加灵敏度，降低检测限。例如空气样品，由于微生物生物量较低，对检测技术的灵敏度要求更高。在保证检测结果准确性的前提下，发展快速有效的技术方法，并降低实验成本，这对处理大批量、含有高多样性ARB和ARGs的样品具有重要意义。此外，面对复杂的环境介质时，如何获取完整、客观的抗生素耐药性的相关信息是未来值得关注的方向之一。

(2) 虽然以宏基因组、高通量荧光定量、高通量测序等为代表的先进分子生物学技术近年来迅速发展，但一些常规方法(如传统微生物培养法、普通PCR等)也不能完全摒弃。应该将多种技术相结合，为探究环境中ARGs的起源、分布和多样性，解析不同环境条件下ARGs的水平和垂直转移机制，挖掘环境中新型ARGs，更新和完善ARGs公共数据库等提供新的方法学支持。包括一些未在本文进行介绍的技术，如转录组学、蛋白质组学、代谢组学等，也可以作为宏基因组学等的补充研究方法，对耐药性产生的分子机制、生存环境、代谢产物等进行全面解析，帮助找出控制ARB产生和阻断ARGs传播的方法。

(3) 进一步建立和完善不同环境介质中ARB、ARGs及可移动基因元件的研究方法体系，对采样、样品处理、检测与表征、数据分析与结果表达等各个步骤进行参数优化、标准化，方便在不同方法、不同实验室条件下所获结果之间进行比较。为全球水平上抗生素耐药性的研究，控制抗生素耐药性发展，合理使用抗生素及制定相关政策，研发新型抗耐药菌药物等提供科学依据。