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文章信息
- 高金伟, 梁利国, 王亚冰, 谢骏
- GAO Jin-Wei, LIANG Li-Guo, WANG Ya-Bing, XIE Jun
- 鳜源致病性维氏气单胞菌的鉴定及药敏试验
- Identification and susceptibility test of pathogenic Aeromonas veronii isolated from Siniperca chuatsi
- 微生物学通报, 2016, 43(12): 2686-2692
- Microbiology China, 2016, 43(12): 2686-2692
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.160029
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文章历史
- 收稿日期: 2016-01-09
- 接受日期: 2016-03-31
- 优先数字出版日期(www.cnki.net): 2016-04-18
2. 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 农业部淡水渔业和种质资源利用重点实验室 江苏 无锡 214081 ;
3. 南京农业大学无锡渔业学院 江苏 无锡 214081
2. Key Laboratory of Freshwater Fisheries and Germplasm Resources Utilization, Ministry of Agriculture, Freshwater Fisheries Research Center, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuxi, Jiangsu 214081, China ;
3. Wuxi Fisheries College, Nanjing Agricultural University, Wuxi, Jiangsu 214081, China
鳜(Siniperca chuatsi)隶属于硬骨鱼纲(Osteichthyes)、鲈形目(Perciformes)、鮨科(Serranidae)、鳜属(Siniperca),又名桂花鱼、季花鱼,是我国特有的淡水名贵经济鱼类。鳜肉质丰腴细嫩、营养丰富,深受消费者的青睐,因其外形与石斑鱼相似,素有“淡水石斑”的美誉,已成为国内极为重要的水产养殖品种[1-2]。
近年来,由于极大的市场需求和良好的经济前景的刺激,鳜的养殖面积和养殖密度逐渐增加,加之近亲繁殖严重等原因,导致鳜抗病力下降,疾病暴发越来越严重,主要有病毒病、细菌病、真菌病和寄生虫病,极大地影响了鳜养殖业的健康发展。病毒病流行快、发病率高,主要为传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)引起的暴发性流行病,目前尚无有效的控制措施,给鳜鱼养殖业带来严重经济损失[3-4]。细菌病常见的有白皮病、细菌性烂鳃病、细菌性败血病等,如细菌性烂鳃病的病原体为柱状曲桡杆菌(Flavobacterium cloumnare)[5],细菌性出血病的病原体为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)[6]。研究发现,水生动物细菌性疾病的暴发常常是多种细菌混合感染所致,目前关于鳜中致病性维氏气单胞菌的分离纯化尚未被报道,本研究有利于明确病因,具有一定的研究意义。真菌病主要为水霉病,其病原体为水霉菌(Saprolegnia sp.)[7]。寄生虫病的病原体主要有河鲈锚首虫(Ancyrocephalus mogurndae)、微山尾孢虫(Henneguya weishanensis)、车轮虫(Trichodina)、小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis)等[7-8]。
2014年6月江苏省常州市横山镇某养殖场养殖的鳜出现死亡,病鱼的主要症状为体表出血、肛门红肿,剖检见淡黄色的腹水,主要脏器有不同程度的病变。通过光学显微镜检测排除真菌及寄生虫感染。本研究从濒死鳜体内分离得到优势菌株,采用常规的细菌表型特征及生理、生化特性的测定方法,并结合分子生物学16S rRNA基因序列的系统发育学分析等方法对分离菌进行鉴定,同时对病原菌进行耐药性试验,旨在分析该菌的分类地位、致病因素并筛选敏感药物,为鳜病原多样性研究及进一步查清其发病机理、传播途径和探索有效防治措施提供依据。
1 材料与方法 1.1 实验样品及主要试剂濒死鳜样品取自横山镇某发病塘口,规格为120±5 g。营养肉汤、胰酪胨大豆肉汤培养基(TSB)、大豆酪蛋白琼脂培养基(TSA)、生化微量鉴定管和药敏试纸均购自杭州滨河微生物试剂有限公司;气单胞菌培养基(RS)、营养琼脂购自北京陆桥生物技术有限责任公司;LB肉汤购自广东环凯微生物科技有限公司;5%绵羊血琼脂培养平板购自美国BD公司;Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
1.2 细菌分离与纯培养分别无菌操作取患病鳜肝胰脏的新鲜断面、腹腔积液,接种于TSA培养基,28 ℃、180 r/min培养18 h后,挑取优势单菌落划线培养,从而获得纯培养的菌株,转接至TSA斜面,置于4 ℃保存备用。共获得5株形态、大小完全一致的单克隆菌,依次编号为WJ2014-1-WJ2014-5。选取WJ2014-1进行检测。
1.3 人工感染试验将分离株WJ2014-1接种于普通营养肉汤中,28 ℃、180 r/min培养18 h,制成菌悬液。并分别稀释至5×108、5×107、5×106、5×105、5×104 cfu/mL。选择体表无伤痕、活力强、质量为50±5 g左右的鳜作试验鱼。将暂养7 d的健康鳜随机分组,每稀释度菌液接种10尾鱼,每尾0.1 mL;对照组注射 0.1 mL同批次无菌营养肉汤。试验组和对照组均设2个重复,每个重复放10尾鱼。试验鱼均隔离养殖于试验水族箱中,记录试验鱼的发病和死亡情况,同时对人工感染发病濒死的鳜进行病原菌的重分离,以引起试验鳜发病死亡并能重新分离到原感染菌作为分离菌致病性的判定标准。
1.4 细菌形态特征观察和理化特性检查取纯培养菌WJ2014-1进行革兰氏染色镜检形态。同时将供试菌株接种于LB、RS、血平板等培养基中,置于28 ℃培养18 h观察生长情况。将供试菌株无菌操作接种于细菌生化鉴定管中,按照常规方法进行硝酸盐还原、糖(醇、苷)类代谢等较系统的理化特性测定,具体方法参照《常见细菌系统鉴定手册》[9]。
1.5 细菌的分子鉴定1.5.1 DNA模板的制备:按照生工生物工程(上海)股份有限公司Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒所述方法提取供试菌株WJ2014-1基因组DNA,并保存于-20 ℃备用。
1.5.2 16S rRNA基因序列的扩增及测序:16S rRNA基因序列的扩增体系参照梁利国等[10]的方法进行。PCR扩增产物送于生工生物工程(上海)股份有限公司进行基因序列测定。
1.5.3 系统发育树的构建:利用NCBI的BLASTn检索系统(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对分离菌株的16S rRNA基因序列与GenBank中的相关亲近物种进行相似性检索,并使用ClusterX 1.83软件与从GenBank数据库中获得的核酸序列相似性较高的菌株序列进行多序列比对,再用MEGA 5.0软件包中的Neighbour-Joining法构建系统进化树,采用Kimura 2-parameter作为校正模型,自举1 000次(Bootstrap)进行置信度检测。
1.6 药物敏感试验采用琼脂扩散法(K-B)对菌株WJ2014-1进行 39种常用抗生素的敏感性检测。于28 ℃培养24 h后观察并记录抑菌环的直径(包括药敏片),以抑菌圈直径大小作为判定细菌对药物敏感性的标准[11]。
2 结果与分析 2.1 病原菌菌落和形态观察及其培养特性分离菌经过革兰氏染色呈阴性,为单个或2个并排排列、两端钝圆的杆状细菌。28 ℃培养18 h,TSA平板上的菌落形态为:表面光滑、中央向上隆起、边缘整齐、灰白色较不透明的菌落。纯培养菌在RS培养基上的菌落特征与在LB琼脂培养基上的形态基本一致,橙黄色。在血平板上生长良好,呈β-溶血。在普通营养肉汤的液体培养基中呈均匀混浊生长。
2.2 回归感染试验结果健康鳜在人工感染菌株WJ2014-1后,不同接种菌液梯度出现不同程度的死亡情况,而对照组鳜在试验期间均未出现死亡。接种18 h后,试验鱼开始游动缓慢,胸鳍基部出现充血点;24 h后开始出现死亡,3 d后试验组鳜死亡率为100%,症状与自然发病症状基本一致。从感染死亡的鱼体内脏器官及血中再次分离纯化到感染菌,经细菌学特征鉴定,其性状与原菌株一致。
2.3 病原菌生理生化特性检测菌株WJ2014-1的生理理化特性如表 1所示。
鉴定项目 Characteristics | 分离株 WJ2014-1 | 标准株 ATCC35624 |
葡萄糖Glucose | + | + |
乳糖Lactose | + | - |
麦芽糖Maltose | + | + |
甘露醇Mannitol | + | + |
蔗糖Saccharose | + | + |
山梨醇Sorbitol | + | - |
卫茅醇Dulcitol | - | - |
鼠李糖Rhamnose | + | - |
肌醇Inositol | - | - |
硫化氢Hydrothion | + | - |
乙酰胺Acetamide | - | · |
水杨素Salicin | - | - |
尿素Urea | - | - |
丙二酸盐Malonate | - | - |
西蒙氏构橼酸盐Simmons citrate | - | + |
苯丙氨酸Phenylalanine | - | + |
蜜二糖Melibiose | + | - |
蛋白胨水(靛基质试验用) Peptone water | + | + |
鸟氨酸脱羧酶Ornithine decarboxylase | - | - |
赖氨酸脱羧酶Lysine decarboxylase | + | + |
精氨酸脱羧酶Arginine decarboxylase | + | + |
氨基酸脱羧酶对照Amino acid decarboxylase control | - | - |
精氨酸双水解酶Arginine dihydrolase | + | + |
精氨酸双水解酶对照Arginine dihydrolase control | - | - |
硝酸盐(还原) Nitrate (reduction) | + | + |
注:+:阳性;-:阴性;·:未记录. | ||
Note: +: Positive; -: Negative; ·: Not record. |
结合菌落与菌体特征,参照文献[9]和[12],初步判定菌株WJ2014-1为维氏气单胞菌。
2.4 16S rRNA基因序列分析分离菌(WJ2014-1)所扩增的16S rRNA基因序列长度为1 451 bp,GenBank登录号为KF413415。将其通过NCBI的BLASTn检索系统进行序列同源性分析,WJ2014-1菌株与维氏气单胞菌(KJ650080、FJ940798、KF358430)等聚为一支,相似性最近为99% (图 1)。
综合供试菌株的表型特征、理化特性及16S rRNA基因序列的系统发育分析结果,判定分离菌为气单胞菌属(Aeromonas)的维氏气单胞菌(A. veronii)。
2.5 药敏试验分离菌对39种抗菌药物的药敏试验结果如表 2所示。该菌株对供试的复方新诺明、强力霉素、罗红霉素、头孢噻肟、哌拉西林等21种抗生素敏感,对阿米卡星、新霉素、四环素、林可霉素、氧氟沙星等9种抗生素中度敏感,对氯霉素、诺氟沙星、萘啶酸等9种抗生素有耐药性。
抗菌药物 Antibacterials | 抑菌圈直径 Inhibition zone (mm) | 敏感性 sensitivity |
阿米卡星Amikacin | 19±0.01 | I |
庆大霉素Gentamicin | 13±0.03 | R |
妥布霉素Tobramycin | 12±0.21 | R |
新霉素Neomycin | 17±0.06 | I |
新生霉素Novobiocin | 19±0.26 | I |
四环素Tetracycline | 16±0.08 | I |
氯霉素Chloramphenicol | 7±0.15 | R |
红霉素Erythrocin | 16±0.23 | I |
麦迪霉素Medemycin | 16±0.31 | I |
林可霉素Lincomycin | 18±0.18 | I |
复方新诺明Sulfamethoxazole | 28±0.43 | S |
呋喃唑酮Furazolidone | 27±0.39 | S |
万古霉素Vancomycin | 10±0.27 | R |
头孢噻吩Cefalotin | 12±0.24 | R |
依诺沙星Enoxacin | 26±0.35 | S |
罗红霉素Roxithromycin | 21±0.26 | S |
恩诺沙星Enrofloxacin | 27±0.26 | S |
替考拉宁Teicoplanin | 27±0.35 | S |
头孢噻肟Cefotaxime | 28±0.19 | S |
哌拉西林Piperacillin | 26±0.28 | S |
强力霉素Doxycycline | 25±0.31 | S |
诺氟沙星Norfloxacin | 7±0.05 | R |
萘啶酸Nalidixic acid | 7±0.10 | R |
乙酰螺旋霉素Acetylspiramycin | 7±0.09 | R |
大观霉素Spectinomycin | 7±0.02 | R |
头孢拉定Cefradine | 15±0.21 | I |
氧氟沙星Ofloxacin | 17±0.18 | I |
环丙沙星Ciprofloxacin | 26±0.38 | S |
米诺环素Minocyline | 25±0.24 | S |
洛美沙星Lomefloxacin | 27±0.19 | S |
氨曲南Aztreonam | 31±0.46 | S |
氟罗沙星Fleroxacin | 30±0.39 | S |
头孢哌酮Cefoperazone | 29±0.28 | S |
克拉霉素Clarithromycin | 21±0.20 | S |
左氟沙星Levofloxacin | 27±0.25 | S |
头孢氨苄Cefalexin | 28±0.32 | S |
磷霉素Fosfomycin | 38±0.40 | S |
头孢孟多Cefamandole | 31±0.37 | S |
多粘霉素Polymyxin | 28±0.28 | S |
注:S:敏感(d≥20);I:中度敏感(14<d<20);R:耐药(0≤d≤14). | ||
Note: S: denotes high sensitivity (d≥20); I: denotes moderate sensitivity (14<d<20); R: denotes low or no sensitivity (0≤d≤14). |
维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)隶属于气单胞菌科(Aeromonadaceae)气单胞菌属(Aeromonas),广泛存在于淡水、海水、污水和土壤等环境中[13],最早于1987年被确定为气单胞菌属的一个新种[14],对人和多种水产动物具有较强的感染性和致病力,是一种新型的人-兽-鱼共患致病菌,对水产养殖业的发展和人类的健康逐渐构成了严重的威胁,已经被部分国家列为食品安全和水体检测的对象。近年来,有关维氏气单胞菌引起水生动物患病的报道日益增多,如斑点叉尾鮰[15]、西伯利亚鲟[16]、框镜 鲤[17]、黄颡鱼[18]、异育银鲫[19]等。
目前,细菌的鉴定主要有表型鉴定和分子遗传学鉴定,细菌常规表型鉴定是最经典、最常用的分类鉴定指标[20],但存在工作量大、耗时长、敏感度低等缺点。根据《常见细菌系统鉴定手册》[9]和Garrity等[12]编写的《伯杰氏细菌鉴定手册》可知维氏气单胞菌区别于其他气单胞菌的主要特征为赖氨酸脱羧酶阳性和精氨酸双水解酶阳性,这与本实验的结果一致。近年来,随着分子生物学和分子遗传学的飞速发展,16S rRNA基因检测技术因其快速简便、特异性较高等优点,被广泛用于细菌的种属鉴定,但是对于亲缘关系较近的细菌,其分辨率不高。因此,鱼类细菌的分类鉴定除了常规表型鉴定外,还需要借助分子生物学和系统发育学的方法,两者相互辅证、互为补充,使鉴定结果更为准确可靠[21-22]。通过较系统地对病原菌A. veronii的鉴定,丰富了该菌在形态特征、理化特性等表型生物学及16S rRNA基因序列与系统发育学方面的内容,为该菌的有效检验提供了参考依据。
抗生素敏感试验结果显示,维氏气单胞菌对环丙沙星、头孢噻肟、哌拉西林等21种抗生素敏感,仅对氯霉素、诺氟沙星、萘啶酸等9种药物有耐药性。本实验结果与杨求华等[23]、康元环等[24]、蒋礼平等[25]及徐晓丽等[26]的结果不一致,这可能与不同菌株之间耐药特性不同及地域分布有关。此外,本试验选取的药物并非均可用于生产,其中氯霉素、呋喃类、环丙沙星、万古霉素和头孢类等抗生素已被农业部列为禁药,只有在国家允许的药物使用标准下,这些药物才能为由该菌引起的疾病防治提供参考依据。水产养殖业中抗生素的使用是保证疾病防治和动物生产的重要措施,然而我国目前水产上可用的抗生素并不多,渔药市场混乱无序,产品质量良莠不齐,产品有效含量不足,加之水产养殖从业者专业素质普遍偏低,使得抗生素类药物使用不科学、不规范,导致药物残留、环境污染及细菌耐药性等问题的出现,给水产养殖业的健康发展带来了极大的挑战。因此在选用药物时,应结合药敏试验结果,严格遵守水产用药的相关规定,对症下药,同时应注意药物的浓度和合理轮换,降低药物残留,尽量避免耐药性的产生。另外,在加强对渔用抗菌药物及细菌耐药性研究的基础上,应开发安全绿色的中草药及稳定高效的生物制剂,或者寻求广谱抗生素,以减少化学药物的使用,防止或延缓细菌耐药性的产生,从而确保水产养殖业的可持续发展。
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