2016, Vol. 43扩展功能
文章信息
- 尹淑丽, 孙劲冲, 刘倩倩, 董杰, 刘洪伟, 张丽萍
- YIN Shu-Li, SUN Jin-Chong, LIU Qian-Qian, DONG Jie, LIU Hong-Wei, ZHANG Li-Ping
- 枯草芽孢杆菌BSD-2对黄瓜叶际微生物数量及菌群结构的影响
- Effects of Bacillus subtilis BSD-on cucumber phyllosphere microorganism community
- 微生物学通报, 2016, 43(12): 2635-2643
- Microbiology China, 2016, 43(12): 2635-2643
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.160008
-
文章历史
- 收稿日期: 2016-01-05
- 接受日期: 2016-06-13
- 优先数字出版日期(www.cnki.net): 2016-07-19
枯草芽孢杆菌防治蔬菜真菌病害的历史已有多年，因其抗逆性孢子及代谢产物的抑菌谱广、抑菌效果好且兼具促进植物生长的功能，因而成为一种理想的生防菌[1]。植物叶际是一个复杂的生态系统，附着丰富多样的微生物[2]，可抵御病害微生物、改变植物表面特性[3, 4, 5]等；了解叶际微生物数量及菌群变化利于发挥叶际微生态对病原菌的抵抗作用[6, 7, 8]。叶面喷施TiO2可使黄瓜叶围微生物多样性显著降低[9]；喷施多粘类芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌，对叶际菌群数量和种类均有所影响[10-11]；喷施苏云金芽孢杆菌可改变叶际微生物的群体结构[12]。采用DGGE技术可以发现微生物在数量及种类上的复杂，目前针对枯草芽孢杆菌不同施入形式对黄瓜叶际微生物数量及菌群结构的影响方面缺少系统的研究。
枯草芽孢杆菌BSD-2是一株由本实验室分离并保存的植物内生菌，对黄瓜灰霉病、叶霉病等多种植物病原真菌有较强的抑制作用，对寄主植物亲和性好，能够诱导植物抗病，而且其分泌的抗菌素抑菌谱广、热稳定性、酸碱稳定性、光稳定性及储藏稳定性好[13]，可用于防治叶面真菌病害。目前研究主要集中在生防菌对于根际的抑菌机理研究及微生物群落的影响[14-15]，但对叶际微生物群落结构影响的相关研究较少。因此研究枯草芽孢杆菌BSD-2抗菌素、芽孢及发酵液施用后叶际微生物数量及菌群的变化，利于阐述生防菌株的微生态作用机制，为其高效生防应用提供理论基础及依据。
1 材料与方法 1.1 实验时间、地点、条件及供试作物2012-2013年，于河北省科学院生物研究所采用Conviron公司的Controlled environment TGLtd进行作物培养；试验条件为温度24 ℃，湿度80%，光照时间为12L:12D。
1.2 供试材料1.2.1 供试实验材料：黄瓜，品种为津春4号(天津科润农业科技股份有限公司研制)。
1.2.2 供试微生物：(1) 植物病原菌：黄瓜灰霉病菌为实验室分离保存。
(2) 益生微生物：枯草芽孢杆菌BSD-2菌株为植物内生细菌，由本实验室分离、鉴定、保存。
1.2.3 培养基：(1) PB培养基(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉膏5.0，氯化钠5.0，琼脂12.0，pH 7.0。
(2) 高氏1号培养基(g/L)：可溶性淀粉20.00，硝酸钾1.00，磷酸氢二钾0.50，硫酸镁0.50，氯化钠0.50，硫酸亚铁0.01，琼脂12.00，pH 7.40-7.60。
(3) PDA培养基(g/L)：马铃薯200.0，葡萄糖20.0，琼脂12.0，pH自然。
1.2.4 主要试剂和仪器：丙烯酰胺、Formamide Deionized、过硫酸铵、TEMED、甲酰胺、尿素，美国Bio-Rad公司；Mag-Bind Soil DNA Kit、MiniBest Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver、PMD19-T Simple Vector，宝生物工程有限公司；真菌、细菌的通用引物，生工生物工程有限公司；基因组提取采用DNA Kit，美国OMEGA公司。SD3300HP超声波清洗器，北京中晟科技有限公司；1-14型高速离心机，德国Sigma公司；PTC240 PCR仪、DcodeTM System for DGGE电泳仪，美国Bio-Rad公司；SW-CJ-2FD超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；SPX-250B-2生化培养箱，上海博讯实业有限公司；XW-80A微型漩涡混合仪，上海沪西分析仪器厂有限公司。
1.2.5 枯草芽孢杆菌发酵液、芽孢及抗菌素准备：枯草芽孢杆菌BSD-2经PB培养基发酵培养，发酵液离心后上清除菌过滤即为抗菌素，沉淀即为芽孢。以防病效果相当的抗菌素、发酵液及芽孢进行相关处理，其中抗菌素的施用浓度为20倍稀释；发酵液的施用浓度为50倍稀释，其中芽孢数量为1×106 CFU/mL；芽孢的施用数量为1×108 CFU/mL。
1.2.6 黄瓜灰霉病孢子悬液制备：将黄瓜灰霉病病原菌于PDA培养基上进行培养，用无菌水将平板上的灰霉病原菌孢子洗入三角瓶中摇匀，配制成黄瓜灰霉病菌孢子含量为1×106 CFU/mL的孢子悬液，待用。
1.3 试验设计试验设计PA、PG、PF、TA、TG、TF、无菌水空白对照和灰霉菌对照共8个处理，PA为施用抗菌素48 h以后接种灰霉孢子；PG为施用芽孢 48 h后接种灰霉孢子；PF为施用发酵液48 h后接种灰霉孢子；TA为接种灰霉孢子3 d后(发病后)施用抗菌素；TG为接种灰霉孢子3 d后(发病后)施用芽孢；TF为接种灰霉孢子3 d后(发病后)施用发酵液；CK0为无菌水处理；CK1为接种1×106 CFU/mL的灰霉孢子悬液处理；每个处理24盆，设置3个重复。待黄瓜长出5片真叶时进行试验处理。
1.4 样品采集实验处理72 h后采集第3、4叶位的黄瓜叶片20 g，将采集的样品分别装入灭菌纸袋，用于叶际微生物数量的统计及叶际微生物菌群结构的测定。
1.5 可培养叶际微生物数量统计采用传统稀释平板法统计可培养微生物的数量，称取20 g混匀叶片置于100 mL (0.1 mol/mL)磷酸盐缓冲液中，室温200 r/min振荡30 min，然后超声波处理5 min[16]，制得菌悬液，依次倍比稀释后涂平板，统计可培养细菌、放线菌、真菌的数量。细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基，真菌采用PDA培养基，放线菌采用高氏1号培养基。
1.6 DGGE方法分析叶际微生物的菌群变化1.6.1 叶际微生物总DNA提取：将叶际菌悬液收集于离心管中，4 ℃、12 000 r/min离心20 min，收集沉淀。
1.6.2 细菌、真菌目的片段的PCR扩增：细菌16S rRNA基因V3区的PCR扩增，引物采用357F-GC/518R[17]，由生工生物公司合成，PCR产物长约230 bp。PCR反应体系为50 μL，包括2×Taq PCR Master Mix 25 μL，1×10-5 mol/L的引物各 1 μL，0.008 g/L的模板5 μL，补足ddH2O至50 μL。采用touchdown-PCR，程序为94 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min，62 ℃ 30 s，每个循环温度降低0.5 ℃，共20个循环；94 ℃ 1 min，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共10个循环；72 ℃ 5 min。
真菌18S-5.8S rRNA序列的PCR扩增，采用巢式PCR方法，引物NS7 (5′-ATAACAGGTCTGT GATGC-3′)/NS8 (5′-GCAGGTTCACCTACGGA-3′)对真菌18S rRNA基因进行PCR反应，并以此为模板，用ITG1/ITG2-GC[18]对真菌18S rRNA基因与5.8S rRNA基因之前的间隔序列进行PCR扩增，PCR产物长约370 bp。NS7/NS8引物的PCR反应程序为：94 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min，49 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 5 min。ITG1/ITG2-GC引物的PCR反应程序同上，退火温度为56 ℃。
1.6.3 扩增产物的DGGE电泳：采用Bio-Rad公司的DcodeTM System进行样品的DGGE分析，聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%，电泳缓冲液为1×TAE，缓冲液温度为60 ℃，上样量为20 μL，细菌V3区的PCR产物电泳所用的凝胶变性梯度为40%-60%，130 V电泳30 min后，换为200 V电泳240 min；真菌18S-5.8S rRNA基因的间隔序列PCR产物电泳所用的凝胶变性梯度为35%-55%，130 V电泳30 min后，换为200 V电泳210 min。电泳结束后采用银染法进行染色[19]。将电泳图用Quantity One分析软件对各样品的条带数量和灰度进行定量分析，并对各条带以UPGMA法进行聚类分析，分析其相似性，并采用Shannon-Wiener指数、pielou均匀度指数和丰富度等指数比较各个处理的菌落多样性[20]。
1.6.4 DGGE条带回收及测序分析：用灭菌的手术刀片对DGGE条带进行切割，无菌ddH2O清洗 2次，加入20 μL TE缓冲液37 ℃浸泡过夜，取3 μL上清为模板进行PCR扩增，细菌16S rRNA基因的条带回收产物用357F/518R为引物；真菌18S rRNA基因的条带回收产物用ITS1/ITS2为引物进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化后与PMD19-T Simple Vector连接，16 ℃反应 30 min使目的片段与载体连接，连接后将10 μL载体转入100 μL的大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑选白斑，送生工生物有限公司进行序列测定。测序结果采用NCBI的Blast程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行同源性分析，采用Sequence match程序(Ribosomal Database Project Ⅱ-Release 9 website)进行分类分析。
2 结果与分析 2.1 黄瓜叶际可培养细菌、真菌和放线菌的数量黄瓜叶际可培养微生物数量的测定结果由图 1可见，与无菌水处理CK0相比，其他7个处理在P=0.05水平上均可显著提高黄瓜叶际可培养细菌、放线菌和真菌的数量。
|
| 图 1 黄瓜叶际可培养微生物的数量 Figure 1 Culturable microbial population of cucumber phyllosphere 注：细菌数量(107 CFU/g)；真菌数量(105 CFU/g)；放线菌数量(107 CFU/g). Note: Bacterial population (107 CFU/g); Fungi population (105 CFU/g); Actinomyces population (107 CFU/g). |
|
|
2.1.1 黄瓜叶际可培养细菌的数量：采用PB培养基测定黄瓜叶际可培养细菌数量的统计结果显示，接种灰霉病原菌可使黄瓜叶际细菌数量增加；PG、PF、TG、TF处理黄瓜叶际可培养细菌的数量显著高于灰霉病原菌处理CK1，PA和TA处理黄瓜叶际可培养细菌的数量显著低于灰霉病原菌处理CK1；其中喷施发酵液PF、TF处理黄瓜叶际可培养细菌的数量显著低于喷施芽孢PG、TG处理；PG和TG处理黄瓜叶际可培养细菌的数量与灰霉病原菌处理相比可分别提高63.51%和204.58%，其中TG处理叶际可培养细菌的数量最多。
2.1.2 黄瓜叶际可培养真菌的数量：采用PDA培养基测定黄瓜叶际可培养真菌数量的统计结果显示，接种灰霉病原菌可使黄瓜叶际真菌的数量增加；PA、PG、PF、TA、TG、TF处理与灰霉病原菌处理CK1相比，均可显著降低黄瓜叶际可培养真菌的数量，在接种灰霉病原菌之前喷施的各处理PA、PG、PF对黄瓜叶际可培养真菌降低的效果最好，降低率分别为35.47%、34.85%、61.24%，其中喷施发酵液处理PF对黄瓜叶际可培养真菌的抑制效果最佳。
2.1.3 黄瓜叶际可培养放线菌的数量：采用高氏 1号培养基测定黄瓜叶际可培养放线菌数量的统计结果显示，PA、PG、PF、TG处理黄瓜叶际可培养放线菌的数量高于灰霉病原菌处理CK1；TA和TF处理黄瓜叶际可培养放线菌数量低于灰霉病原菌处理CK1；其中接种病原菌前喷施各处理黄瓜叶际可培养放线菌的数量均高于接种病原菌后喷施各处理。喷施芽孢处理PG对黄瓜叶际可培养放线菌数量的影响最大，与灰霉病原菌处理CK1相比增高率达832.61%。
2.2 叶际微生物全基因组及PCR分析从叶际样品中提取的微生物全基因组经0.7%的琼脂糖凝胶电泳检测，通过条带位置参照Marker判断其大小为1.5 kb。不同处理样品细菌16S rRNA基因的V3区PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测为大小约230 bp的DNA片段；巢式PCR方法扩增真菌18S-5.8S rRNA基因的产物，经琼脂糖凝胶电泳检测为大小约350 bp的DNA片段。
2.3 细菌DGGE图谱、聚类及测序分析2.3.1 细菌DGGE图谱分析：将不同处理样品细菌的16S rRNA基因的V3区PCR产物经变性梯度凝胶电泳获得黄瓜叶际细菌DGGE图谱(图 2)，不同处理的条带数从10到17条不等，挑选部分峰密度较强的条带，标记为1-12号。接种灰霉病原菌处理CK1和无菌水对照处理CK0相比，共有条带1、2、12的峰密度均减弱，增加了特有条带7。PA、PG、PF、TA、TG、TF各处理与接种灰霉病原菌处理CK1相比，1、2、9、10、11、12号条带的峰密度有不同程度的减弱甚至消失。在接种病原菌前喷施处理PA的DGGE图谱中，条带1的峰密度有所减弱；PG和PF处理DGGE图谱中，条带5、6、9、10、11峰密度有明显增强。在接种病原菌后喷施处理TA的DGGE图谱中，条带1、2减弱，增加了特有条带4；TG处理DGGE图谱中，条带1、2明显减弱；TF处理DGGE图谱中，条带2减弱，增加了特有条带8。
|
| 图 2 不同处理的黄瓜叶际细菌群落DGGE图谱 Figure 2 The different treatment of bacterial community in cucumber phyllosphere by DGGE 注：图中的数字代表不同处理的差异条带. Note: Numbers in the figure represent differential band of different treatment. |
|
|
2.3.2 细菌DGGE图谱的聚类分析：细菌群落DGGE图谱聚类分析结果显示(图 3)：无菌水处理CK0、灰霉病病原菌处理CK1和抗菌素喷施处理PA黄瓜叶际细菌群落相似度为70%；其中灰霉病病原菌处理CK1与处理PA相似度为79%。无菌水处理CK0与PG、PF、TA、TF处理叶际细菌种类的相似度为40%，与TG处理叶际细菌种类的差异最为显著，相似度为35%。可见，接种灰霉病原菌前各喷施处理对黄瓜叶际细菌的种类影响小，且抗菌素喷施处理PA对黄瓜叶际细菌种类的影响最小。
|
| 图 3 细菌DGGE指纹图谱的UPGMA聚类分析 Figure 3 The dendrogram of bacterial DGGE fingerprint using UPGMA 注：图中的数字代表不同处理微生物种类相似度. Note: Numbers in the figure represent different microbial species similarity. |
|
|
2.3.3 凝胶条带回收及序列分析：将叶际细菌凝胶中的1-12号条带进行回收测序，序列于GenBank数据库中比对的结果见表 1，3号条带未测出，条带1、2、7、12号与不可培养的Bacterium有较近的亲源关系，4号条带与Bacillus amyloliquefaciens strain的相似度达99%，5、6号条带与Bacillus属序列相近，相似度均大于或等于99%，9、11号条带与Bacillus subtilis strain BSD-2相似度达99%。 8号条带与Pseudomonassp. S-2有较近的亲缘关系，10号条带与Acinetobacter有较近的亲源关系。
| 条带编号 Band No. | 最相似菌株 Closest relative | 相似度 Percentage similarity (%) | 亲缘关系 Phylogenetic affiliation | GenBank登录号 GenBank accession No. |
| 1 | Uncultured soil bacterium clone A149 (JX489934.1) | 100 | Bacterium | KF031438 |
| 2 | Uncultured bacterium clone 30-1-M13F(-47) (GQ866159.1) | 100 | Bacterium | KF006350 |
| 4 | Bacillus amyloliquefaciens strain zj01 (HQ910433.1) | 99 | Bacillus | KF006363 |
| 5 | Bacillus subtilis strain PV7 (JQ812055.1) | 99 | Bacillus | KF006364 |
| 6 | Bacillus subtilis strain BS-00 (KC660144.1) | 100 | Bacillus | KF006365 |
| 7 | Uncultured bacterium clone amj-25-s-22 (FJ832152.1) | 98 | Bacterium | KF031439 |
| 8 | Pseudomonas sp. S-2 (KC207087.1) | 100 | Pseudomonas | KF006366 |
| 9 | Bacillus subtilis strain BSD-2 (EF523474.1) | 99 | Bacillus | KF031435 |
| 10 | Acinetobacter lwoffii strain W1109-B7 (JQ815204.1) | 100 | Acinetobacter | KF031436 |
| 11 | Bacillus subtilis strain BSD-2 (EF523474.1) | 99 | Bacillus | KF031437 |
| 12 | Uncultured bacterium, clone DGGE gel A12-2 (HE860554.1) | 99 | Bacterium | KF031440 |
2.4.1 真菌DGGE图谱分析：在真菌群落图谱中(图 4)，接种灰霉病原菌前后喷施各处理与无菌水处理CK0、灰霉病原菌处理CK1相比，条带数明显减弱、甚至消失；标记特异性条带为13-15号。接种灰霉病原菌的处理CK1和无菌水对照处理CK0相比，增加了14、15号条带。接种病原菌前后喷施各处理与接种灰霉病原菌的处理CK1相比，条带14、15号条带基本消失；接种灰霉病原菌后喷施各处理中13、14、15号条带有不同程度减弱。
|
| 图 4 不同处理的黄瓜叶际真菌群落DGGE图谱 Figure 4 The different treatment of fungal community in cucumber phyllosphere by DGGE 注：图中的数字代表不同处理的差异条带. Note: Numbers in the figure represent differential band of different treatment. |
|
|
2.4.2 真菌DGGE图谱的聚类分析：真菌群落DGGE图谱聚类分析(图 5)结果显示，无菌水对照处理CK0与接种灰霉病原菌的处理CK1黄瓜叶际真菌群落的差异显著，位于两大聚类主分支，相似度为60%；接种灰霉病原菌的处理CK1与处理PG、PA、PF黄瓜叶际真菌群落结构相似度均为60%；接种灰霉病原菌的处理CK1与处理TA相似度为81%，与处理TF、TG相似度为78%。PF处理叶际真菌菌群结构与无菌水处理CK0的相似度高达85%。
|
| 图 5 真菌DGGE指纹图谱的UPGMA聚类分析 Figure 5 The dendrogram of fungal DGGE fingerprint using UPGMA 注：图中的数字代表不同处理微生物种类相似度. Note: Numbers in the figure represent different microbial species similarity. |
|
|
2.4.3 凝胶条带回收及序列分析：将叶际真菌凝胶中的13-15号条带进行回收测序，序列于GenBank数据库中比对的结果见表 2，13号条带与不可培养真菌有较近的亲源关系，14、15号条带与Botryotinia fuckeliana相似度达99%。
| 条带编号 Band no. | 最相似菌株 Closest relative | 相似度 Percentage similarity (%) | 亲缘关系 Phylogenetic affiliation |
| 13 | Uncultured fungus clone 60-6 (DQ834795.1) | 98 | Fungus |
| 14 | Botryotinia fuckeliana isolate UASWS0744 (HQ166517.1) | 99 | Botryotinia fuckeliana |
| 15 | Botryotinia fuckeliana isolate LGM002 (KC683713.1) | 99 | Botryotinia fuckeliana |
依据DGGE图谱条带峰密度分析微生物丰富度、多样性和均匀度的结果见表 3，无菌水处理CK0黄瓜叶际微生物的多样性指数和均匀度指数高于其他处理，接种灰霉病原菌的处理CK1黄瓜叶际微生物的丰富度指数和多样性指数均低于接种灰霉病原菌前后各喷施处理；接种灰霉病原菌前喷施各处理黄瓜叶际微生物丰富度指数、多样性指数和均匀度指数均优于接种灰霉病原菌后喷施各处理，且抗菌素喷施处理黄瓜叶际微生物丰富度指数、多样性指数和均匀度指数优于其他两个处理。
| 处理 Treatment | 丰富度指数 Richness index | Shannon-Wiener多样性指数 Shannon-Wiener index | Pielou均匀度指数 Pielou index |
| CK0 | 21.00 | 3.09 | 0.94 |
| CK1 | 20.00 | 2.79 | 0.92 |
| PA | 23.00 | 2.88 | 0.93 |
| PG | 23.00 | 2.88 | 0.91 |
| PF | 21.00 | 2.93 | 0.91 |
| TA | 22.00 | 2.84 | 0.92 |
| TG | 22.00 | 2.82 | 0.91 |
| TF | 21.00 | 2.76 | 0.91 |
外源物质的引入会使黄瓜叶际的微生物数量发生改变，提高叶际可培养细菌、放线菌和真菌的数量，与宿燕明[10]、冉淦侨等[11]的研究结果相同。枯草芽孢杆菌芽孢的喷施可显著提高叶际可培养细菌的数量，也可提高可培养放线菌的数量，且两者表现出正的相关性。枯草芽孢杆菌发酵液的喷施，可提高可培养细菌的数量，但对叶际可培养放线菌数量的影响较小。枯草芽孢杆菌抗菌素的喷施，对叶际可培养细菌和放线菌数量的影响最小。枯草芽孢杆菌芽孢、发酵液、抗菌素的喷施均可降低黄瓜叶际可培养真菌的数量，不同于Russell等[21]喷施苏云金芽孢杆菌(Bt)对甘蓝叶际可培养真菌数量没有影响的结果；其中接种灰霉病原菌之前喷施发酵液对可培养真菌的抑制效果最佳。
3.2 对黄瓜叶际微生物菌群结构的影响外源物质的引入可使微生物的菌群结构发生变化，相同于Grosch等[22]植物病原菌的引入对微生物群落产生显著影响的结果。枯草芽孢杆菌芽孢、发酵液和抗菌素的喷施，可增加叶际微生物的丰富度指数、Shannon-Wiener多样性指数及Pielou均匀度指数；灰霉病原菌的喷施，可降低叶际微生物的丰富度指数、Shannon-Wiener多样性指数及Pielou均匀度指数。
接种灰霉病原菌后喷施各处理与灰霉病原菌处理相比，增加了两条特异条带；抗菌素喷施处理增加了解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens的相似条带，解淀粉芽孢杆菌菌株在生长过程中可产生一系列次生代谢产物[23]，包括抗菌蛋白、脂肽类物质或多肽等活性物质，能够抑制多种植物病原真菌和细菌[24]；发酵液喷施处理增加了假单胞菌Pseudomonas sp. 的相似条带，假单胞菌是重要的生防细菌，其中荧光假单胞菌最为典型[25]。接种灰霉病原菌前喷施各处理与灰霉病原菌处理叶际微生物DGGE条带结构相似；其抗菌素喷施对叶际细菌菌群结构的影响最小，具有良好的生态保持功效。
灰霉病原菌的的引入使叶际真菌的DGGE条带中增加了两条特异性条带，均为富氏葡萄孢盘菌Botryotinia fuckeliana的相似条带。接种后喷施各处理可有效抑制病原菌导致条带减弱。接种前喷施各处理均可抑菌该病原菌的生长而使条带消失；使Uncultured fungus clone的相似条带消失；抗菌素喷施对叶际真菌的种类影响最小。异于Russell等[21]喷施苏云金芽孢杆菌(Bt)对甘蓝叶际可培养真菌的多样性没有影响的结果。
4 结论枯草芽孢杆菌芽孢、发酵液和抗菌素的喷施可对黄瓜叶际微生物数量及微生物菌群结构产生不同的影响，但接种灰霉病原菌前的喷施各处理在对可培养真菌数量及菌群结构及多样性方面优于接种灰霉病原菌后喷施各处理。发酵液处理可在破坏菌群结构较小的基础上有效抑制病原真菌的数量；芽孢处理可有效提高叶际可培养细菌和放线菌的数量，但抑制可培养真菌数量的效果差于发酵液处理；喷施抗菌素可抑制可培养真菌的数量，对细菌、真菌的菌群结构的影响较小，利于保持微生物的丰富度及均匀度。可见，同一株生防菌株不同的施入形式会对植株叶际的生态环境产生相应的影响，可因不同目的而采用不同施入方式，其作用机制需要进一步研究。
| [1] | Liu X, Mu CQ, Jiang XL, et al. Research progress of the metabolic substances produced by Bacillus subtilis and their application on biocontrol of plant disease[J]. Chinese Journal of Biological Control 2006, 22(S1) : 179–184. (in Chinese) 刘雪, 穆常青, 蒋细良, 等. 枯草芽孢杆菌代谢物质的研究进展及其在植病生防中的应用[J]. 中国生物防治 2006, 22(S1) : 179–184. |
| [2] | Lindow SE, Brandl MT. Microbiology of the phyllosphere[J]. Applied and Environmental Microbiology 2003, 69(4) : 1875–1883. DOI:10.1128/AEM.69.4.1875-1883.2003 |
| [3] | Krimm U, Abanda-Nkpwatt D, Schwab W, et al. Epiphytic microorganisms on strawberry plants (Fragaria ananassa cv. Elsanta): identification of bacterial isolates and analysis of their interaction with leaf surfaces[J]. FEMS Microbiology Ecology 2005, 53(3) : 483–492. DOI:10.1016/j.femsec.2005.02.004 |
| [4] | Leveau JHJ, Lindow SE. Appetite of an epiphyte: quantitative monitoring of bacterial sugar consumption in the phyllosphere[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2001, 98(6) : 3446–3453. DOI:10.1073/pnas.061629598 |
| [5] | Sandhu A, Halverson LJ, Beattie GA. Bacterial degradation of airborne phenol in the phyllosphere[J]. Environmental Microbiology 2007, 9(2) : 383–392. DOI:10.1111/emi.2007.9.issue-2 |
| [6] | Pan JG, Hu Q, Qi HY, et al. Advance in the research of phyllospheric microorganism[J]. Acta Ecologica Sinica 2011, 31(2) : 583–592. (in Chinese) 潘建刚, 呼庆, 齐鸿雁, 等. 叶际微生物研究进展[J]. 生态学报 2011, 31(2) : 583–592. |
| [7] | Zhang BG, Zhang HX, Jin B, et al. Effect of cypermethrin insecticide on the microbial community in cucumber phyllosphere[J]. Journal of Environmental Sciences 2008, 20(11) : 1356–1362. DOI:10.1016/S1001-0742(08)62233-0 |
| [8] | Yang CH, Crowley DE, Borneman J, et al. Microbial phyllosphere populations are more complex than previously realized[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2001, 98(7) : 3889–3894. DOI:10.1073/pnas.051633898 |
| [9] | Chang LY, Wang Q, Mei RH. Effect of Nano-TiO2 on the bacterial community of the cucumber phyllosphere[J]. Journal of Agricultural Biotechnology 2009, 17(1) : 159–163. (in Chinese) 常立艳, 王琦, 梅汝鸿. 纳米TiO2对黄瓜叶围细菌群落的影响[J]. 农业生物技术学报 2009, 17(1) : 159–163. |
| [10] | Su YM. Effects of Paenibacillus polymyxa on quality of Rape and the microbial community in Rape phyllosphere and rhizosphere[D]. Beijing: Master's Thesis of Beijing Forestry University, 2011 (in Chinese) 宿燕明. 多粘类芽孢杆菌对油菜品质及其叶际、根际微生物群落的影响[D]. 北京: 北京林业大学硕士学位论文, 2011 |
| [11] | Ran CQ, Wang N, Dai JK, et al. Colonization of Bacillus subtilis BS24 on the apple leaf surface and their effects on the leaf microbial flora[J]. Biotechnology Bulletin 2013(10) : 131–136. (in Chinese) 冉淦侨, 王楠, 戴佳锟, 等. 枯草芽孢杆菌BS24在苹果叶面的定殖及其对叶面菌群的影响[J]. 生物技术通报 2013(10) : 131–136. |
| [12] | Zhang BG, Bai ZH, Hoefel D, et al. Assessing the impact of the biological control agent Bacillus thuringiensis on the indigenous microbial community within the pepper plant phyllosphere[J]. FEMS Microbiology Letters 2008, 284(1) : 102–108. DOI:10.1111/fml.2008.284.issue-1 |
| [13] | Zhang D. Screening, identification and characterization of the antifungal substance of antagonistic endophytic bacteria againstVerticillium dahilae[D]. Shijiazhuang: Master's Thesis of Hebei Normal University, 2008 (in Chinese) 张铎. 棉花黄萎病拮抗内生细菌的筛选鉴定及其抗菌物质研究[D]. 石家庄: 河北师范大学硕士学位论文, 2008 |
| [14] | Scherwinski K, Grosch R, Berg G. Effect of bacterial antagonists on lettuce: active biocontrol of Rhizoctonia solani and negligible, short-term effects on nontarget microorganisms[J]. FEMS Microbiology Ecology 2008, 64(1) : 106–116. DOI:10.1111/fem.2008.64.issue-1 |
| [15] | Yang W, Jiang ZQ, Guo YH, et al. Biocontrol efficacy and impact on the rhizosphere community structure of Bacillus cereus CH2 against verticillium wilt on eggplant in the field condition[J]. Microbiology China 2011, 38(5) : 715–721. (in Chinese) 杨威, 蒋志强, 郭亚辉, 等. Bacillus cereus CH2对茄子黄萎病的田间防治效果研究以及对根围微生态群落结构的影响[J]. 微生物学通报 2011, 38(5) : 715–721. |
| [16] | Zhang BG, Tang L, Li ZM, et al. Effect of abamectin insecticide on the microbial community in broccoli phyllosphere[J]. Environmental Science 2009, 30(5) : 1292–1297. (in Chinese) 张保国, 唐玲, 李祖明, 等. 阿维菌素杀虫剂对甘蓝叶际微生物群落结构的影响[J]. 环境科学 2009, 30(5) : 1292–1297. |
| [17] | Muyzer G, Waal EC, Uitierlinden AG. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA[J]. Applied and Environmental Microbiology 1993, 59(3) : 695–700. |
| [18] | Hamelin RC, Bérubé P, Gignac M, et al. Identification of root rot fungi in nursery seedlings by nested multiplex PCR[J]. Applied and Environmental Microbiology 1996, 62(11) : 4026–4031. |
| [19] | Lang JJ, Jiang H, Ran W, et al. Control of cotton Verticillium wilt and fungal diversity of rhizosphere soils by bio-organic fertilizer[J]. Biology and Fertility of Soils 2012, 48(2) : 191–203. DOI:10.1007/s00374-011-0617-6 |
| [20] | Luo HF, Qi HY, Zhang HX. Assessment of the bacterial diversity in fenvalerate-treated soil[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology 2004, 20(5) : 509–515. DOI:10.1023/B:WIBI.0000040401.46606.a4 |
| [21] | Russell D, Chard J, McKinlay R. Effect of Bacillus thuringiensis and a pyrethroid insecticide on the leaf microflora of Brassica oleracea[J]. Letters in Applied Microbiology 1999, 28(5) : 359–362. DOI:10.1046/j.1365-2672.1999.00548.x |
| [22] | Grosch R, Scherwinski K, Lottmann J, et al. Fungal antagonists of the plant pathogen Rhizoctonia solani: selection, control efficacy and influence on the indigenous microbial community[J]. Mycological Research 2006, 110(12) : 1464–1474. DOI:10.1016/j.mycres.2006.09.014 |
| [23] | Scholz R, Vater J, Budiharjo A, et al. Amylocyclicin a novel circular bacteriocin produced by Bacillus amyloliquefaciens FZB42[J]. Journal of Bacteriology 2014, 196(10) : 1842–1852. DOI:10.1128/JB.01474-14 |
| [24] | Wang YG, Wang JH, Quan CS, et al. Purification and antifungal characterization of an antifungal substance from Bacillus amyloliquifaciens[J]. China Biotechnology 2007, 27(12) : 41–45. (in Chinese) 王英国, 王军华, 权春善, 等. 解淀粉芽孢杆菌抗菌活性物质的分离纯化及抑菌活性研究[J]. 中国生物工程杂志 2007, 27(12) : 41–45. |
| [25] | Xiao H. The research situation of Pseudomonas spp. and Bacillus spp. against plant disease[J]. World Pesticides 2014, 36(2) : 23–26. (in Chinese) 筱禾. 两类生防细菌对植物病害的防治研究[J]. 世界农药 2014, 36(2) : 23–26. |