地球上存在着各种不同且一般生物难以生长的极端环境，如高盐、高温、高酸、高碱等环境。这些极端环境中生存着种类丰富的极端微生物，它们为了适应极端环境条件，形成了其独特的细胞结构、生理机能和遗传特性^[1]。嗜盐嗜碱古菌在高盐和碱性条件下能良好生长，在盐浓度低于10% NaCl或中性环境中不生长^[2]。对于嗜盐嗜碱菌而言，它们虽然和极端嗜盐菌一样生长需要高盐浓度，细胞壁中没有真正的肽聚糖，细胞膜结构中的脂类只含有醚键不含脂键，但它们又具有既嗜盐又嗜碱、生长仅需低浓度镁离子、细胞膜中含有C20和C25类异二烯组分的甘油二醚、只有磷脂而无糖脂、G+C含量偏低等性质，因而嗜盐嗜碱菌不同于中性嗜盐菌^[3-4]。

嗜盐嗜碱菌作为一种新型的、极具应用前景的极端环境微生物资源，近年来受到人们的广泛关注^[5-7]。新疆地区气候干旱，全年的降水量远小于地表的水蒸腾量(1׃1 000) ，因而形成了许多内陆盐湖或碱性盐湖。依地球化学条件的差异，所形成盐湖的类型各有差别，有碳酸盐型，也有氯化盐型；所含碱金属也不同，有的是Na，有的是K或Mg或其它元素^[8]。嗜盐嗜碱古菌是嗜盐古菌的重要类群之一，对该类群的系统研究不仅为微生物生理、遗传和分类等相关内容的研究提供新的课题，也为生命起源及系统进化研究提供新材料^[9]。由于嗜盐嗜碱微生物长期生长在特殊环境下，其生物活性物质也具有独特的性质，是一类重要的资源微生物，同时也是研究生物进化和生物多样性的重要材料，寻找嗜盐嗜碱菌并分离各种嗜碱酶和新的活性物质已成为国际上微生物研究的一个热点^{[5, 10]}。目前，关于新疆尉犁县黑湖的极端微生物的研究极少，本文以新疆尉犁县黑湖分离的嗜盐嗜碱古菌为研究材料，针对其生理生化特性和系统发育多样性开展研究，为不同环境中嗜盐嗜碱菌资源的研究和合理开发利用提供菌种资源和参考。

1.1.1 采样：采样地点为新疆尉犁县黑湖(86°47′40″E、41°14′09″N至86°52′10.7″E、41°13′11.7″N)。以湖心为出发点，围绕湖心按不同距离东、南、西、北方向不同深层取表层下10、20、40、60 cm深度水样、土样和泥样，水样pH为5.26-6.90、湖心周边土样pH为6.5-6.9、泥样pH为6.0-6.9，盐度为25%-28%，样品点海拔高度为853-855 m。装入无菌试样袋密封，将取得的试样保存于4 ℃用于嗜盐嗜碱古菌筛选。

1.1.2 培养基：筛选培养基采用1号培养基(g/L)：Casamino acid 15.0，柠檬酸三钠3.0，谷氨酸2.5，氯化钾2.0，氯化钠250.0。固体培养基另加琼脂15-20 g，pH为8.5 (灭菌之前pH先用1% NaOH调到7.0-7.2，1×10⁵ Pa灭菌30 min，灭菌后再用5% Na₂CO₃调pH到8.5) 。

1.1.3 主要试剂和仪器：PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；DNA聚合酶、DNA Marker、细菌基因组提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，购于北京天根生化科技有限公司。专业型梯度PCR仪TPfofessional Standard型，德国Biometra公司；电泳仪Electrophoresis Power Supply EPS 301型，瑞典GE Healthcare公司；高速台式离心机Eppendorf 5424型，德国Eppendorf AG公司；紫外可见分光光度计UV-2810H型，尤尼柯(上海)仪器有限公司；凝胶成像仪Alphalmager EP型，美国Alpha Innotech公司。

1.2.1 菌株的富集和分离纯化：称取样品(土样或水样) 1 g或1 mL置于装液量50 mL筛选培养基的 250 mL三角瓶中，37 ℃、180 r/min摇床培养3-5 d，富集菌体，采用逐级稀释法将富集培养液涂布于固体平板。37 ℃倒置培养7-10 d长出单菌落，挑取单菌落重复划线至得到纯培养物。用斜面划线试管和-80 ℃甘油管两种方法保存。

1.2.2 菌落特征：将菌株划线接种于1号培养基，37 ℃培养7-10 d，观察单菌落的形状、大小、透明度、颜色、边缘和表面特征。

1.2.3 菌体特征：采用革兰氏染色法，通过光学显微镜对菌体形态进行观察，或用扫描电子显微镜观察。

1.2.4 生长条件检测：最佳生长盐浓度实验：在 1号液体培养基接种，培养3 d后，1%接种量接种于含0%、5%、10%、15%、20%、25%、30% (质量体积比) NaCl的1号液体培养基中，37 ℃、 180 r/min培养3 d，3个平行，测定菌悬液光吸收值(OD₅₉₀)，设置各盐浓度空白对照，检测25株嗜盐嗜碱菌的最适生长盐浓度。

最佳生长pH实验：在1号液体培养基接种，培养3 d后，1%接种量接种于pH分别为6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0和14.0的1号液体培养基中，培养基含有以下25 mmol/L缓冲体系：MES (pH 5.8-6.5) 、PIPES (pH 6.4-7.2) 、Tricine (PH 7.0-9.0) 、CAPSO (pH 8.9-10.3) 和CAPS (pH 9.7-11.1) 。37 ℃、180 r/min培养3 d，3个平行，测定菌悬液光吸收值(OD₅₉₀)，设置各pH值空白对照，检测 25株嗜盐嗜碱菌的最适生长pH值。

1.2.5 部分生理生化特征：依据《常见细菌系统鉴定手册》^[11]和《伯杰氏细菌鉴定手册(第9版)》^[12]进行常规生理生化鉴定。

1.2.6 16S rRNA基因序列扩增和系统发育分析：DNA提取方法参见文献^[13]。提取分离出的各菌株基因组DNA为模板，使用古菌通用引物21F (5′-TTCCGGTTGATCCTGCCGGA-3′)，1540R (5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCAG-3′)进行菌株16S rRNA基因PCR，PCR产物纯化后测序。将获得的序列提交至EzTaxon-e数据库进行相似度比较(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon)。

1.2.7 构建系统发育树：通过Clustal W2软件包进行多序列匹配排列(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/)。采用MEGA 6.0软件构建系统发育树。根据相关软件删除序列匹配排列中的插入和缺失，根据“Kimura双参数”方式，通过序列数据计算进化距离。选择邻近连接法(Neighbour-Joining)对系统进化树进行估算，通过1 000次取样确定。

通过对新疆尉犁县黑湖周边土壤和湖水样样品进行富集培养、分离纯化得到25株嗜盐嗜碱菌株。采样的30个样品中，从水样中分离了13株菌，泥样中分离了5株菌，土样中分离7株菌。

分离纯化得到的25株嗜盐嗜碱菌生长7 d后，菌落湿润或干燥，菌落呈乳白色(8株)、白色(7株)或红色(10株) 3种颜色，菌落较小、圆形、表面向上隆起、大部分不透明、边缘整齐。细胞为革兰氏阴性。细胞的形状大部分是球状(24株)，少数为杆状(1株)。

所得到的25株嗜盐嗜碱菌生理生化特征见 表 1。这些菌株生长的NaCl浓度范围为15%-30%，最适浓度为20%-25%，生长的pH范围为7.0-13.0，最适pH为9.0-10.0。各种水解酶类的分析表明，在分离的25株菌中产淀粉酶的菌有5株，产蛋白酶的菌有4株，产酯酶即水解吐温20的菌有15株，水解吐温40的有7株，水解吐温80的有4株，产过氧化氢酶的菌有53株。9株菌同时能产4种酶，2株菌同时能产3种酶，表明了嗜盐嗜碱菌产酶的多样性。19株菌硝酸盐还原为阳性。无汞离子抗性。其中DH-66的NaCl浓度范围为15%-30%、最适浓度为20%，生长pH范围为7.0-13.0、最适pH为9.0。能产蛋白酶，可水解吐温20，不产淀粉酶，不水解吐温40和80，不产过氧化氢酶，硝酸盐还原为阴性。

使用古菌通用引物对获得的25株嗜盐嗜碱菌的16S rRNA基因序列进行单向测序并获得有效序列，长度均大于700 bp，将获得的序列提交至EzTaxon-e数据库(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon)，调出相似性最高相关菌株的16S rRNA基因序列。通过TA克隆对其中最高相似性低于98%的16S rRNA基因序列进行了全长(1 500 bp)测序以增加比对的可靠性。结合16S rRNA基因序列系统发育分析和生理生化结果表明，所分离获得的 25株嗜盐嗜碱菌鉴定归属于嗜盐古菌Halorubrum、Haloarcula、Natrialba、Halohasta和Halopiger等 5个属，其中Halorubrum属(11株，占总菌株的44%)在新疆尉犁县黑湖可培养嗜盐嗜碱菌中的5个属中占优势，其次为Natrialba属(10株，40%)、Halohasta属(2株，8%)、其余菌株各1株，分属于Haloarcula和Halopiger属。从具体的系统发育分析来看(表 2和图 1)，这些菌株与Halorubrum lipolyticum、Halorubrum californiense、Halorubrum chaoviator、Halorubrum persicum、Haloarcula hispanica、Halohasta litorea、Natrialba hulunbeirensis、Natrialba chahannaoensis、Natrialba aegyptia和Halopiger aswanensis等10个不同的种的系统发育关系相近。其中菌株DH-66 (KU663028) 属于Halopiger属，与属中的模式菌株Halopiger aswanensis 56^T同源性最高，为95.75%，预示为嗜盐菌新种，以嗜盐嗜碱菌新种鉴定最小标准，进行实验分析和验证(数据未在本研究介绍)。

图 1　新疆勒尉犁县黑湖嗜盐嗜碱菌的16S rRNA基因序列的系统发育树 Figure 1　Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of haloalkalophilic isolates from the black lake of Yuli County in Xinjiang 注：括号内为菌株的16S rRNA基因序列在GenBank中的登录号；系统树分支点处的数字代表系统树的自举值(1 000次重复)；标尺长度代表遗传距离. Note: The numbers in parentheses represent the accession numbers in the GenBank for the 16S rRNA gene sequences of those reference strains and screened strains; The numbers on the branch points of the phylogentic tree represented bootstrap values of the tree (1 000 replicates); Scale length represented genetic distance.

图选项

为了解新疆尉犁县黑湖嗜盐嗜碱菌菌种资源特征，挖掘有用资源类群分离并获得嗜盐嗜碱菌菌种资源，对采集样品分离和纯化，共获得了25株嗜盐嗜碱菌。并对25株菌株的个体形态观察及生理生化特性检测，对16S rRNA基因序列进行分析并构建了系统进化树。所分离获得的25株嗜盐嗜碱菌鉴定分别归属于Natrialba、Halorubrum、Halohasta、Haloarcula以及Halopiger 5个属，这些菌分别与Halorubrum lipolyticum、Halorubrum californiense、Halorubrum chaoviator、Halorubrum persicum、Haloarcula hispanica、Halohasta litorea、Natrialba hulunbeirensis、Halopiger aswanensis、Natrialba chahannaoensis及Natrialba aegyptia等 10个种相似性较高。其中Halorubrum属在新疆尉犁县黑湖嗜盐嗜碱菌中的5个属中占优势。通过与已报道的新疆几大盐湖嗜盐菌数据的系统进化地位分析，尉犁县黑湖与艾比湖^[14]、艾丁湖^[15]、达坂城盐湖^[16]、罗布泊^[17]等4个盐湖中共有属是Halorubrum。与三大盐湖比(罗布泊除外)Haloarcula也是共有的，而艾比湖除外，共有属为Natrialba。与艾丁湖、达坂城盐湖、艾比湖、罗布泊四大盐湖相比尉犁县黑湖特有的属是Halopiger。从新疆尉犁县黑湖所分离的优势嗜盐嗜碱菌属以及特有属Halopiger有着自身的特殊性^[18]，同时也具有新疆各地区其他盐环境(盐湖、盐碱湿地以及盐矿场)共同的特征。

通过对新疆尉犁县黑湖嗜盐嗜碱菌的分离及系统发育学分析初步研究，充分证明了新疆尉犁县黑湖嗜盐嗜碱菌种群的多样性、丰富性、特殊性及潜在的新类群。目前各国对极端环境微生物资源的研究集中在资源多样性、活性物质多样性、基因多样性，从极端环境发现的新类群及活性物质越来越体现新的功能，因此开展资源挖掘与利用研究已深入到抗肿瘤活性物质筛选^[19]、生物修复^[20-21]、环境污染治理^[22]等多个领域，具有重要的应用价值。本研究对于今后进一步研究极端环境微生物资源具有重要的现实意义，为新疆嗜盐微生物资源的深入认识和进一步开发利用提供了菌种资源，也为研究生物进化和生物多样性提供了重要材料。寻找并分离嗜碱酶是目前研究的热点，嗜盐嗜碱微生物的产酶多样性和活性物质多样性及地区分布特性具有参考价值。本实验分离获得的嗜盐嗜碱菌资源展现了菌株产蛋白酶、酯酶、淀粉酶和过氧化氢酶的特点，为新型生物催化剂的研究提供了丰富多样的研究材料。目前，关于新疆尉犁县黑湖的极端微生物资源研究极少，本研究从该地区挖掘具有新功能和新机制的极端环境微生物资源及生物酶类，将为促进微生物产业实践化提供依据。