VITEK2 Compact全自动微生物分析系统是目前国内应用较多的全自动细菌分析系统，具有自动化程度高、鉴定速度快的特点，在医院中应用较为普遍。在兽医研究领域的应用也有报道^[1-2]。作为一种实用技术，人们重点关注其鉴定的准确率和稳定性。目前已有部分鉴定结果准确性的报道，例如，VITEK2 Compact全自动微生物分析系统在鉴定屎肠球菌^[3]、猪链球菌时准确性较高，并且可以区分1型和2型猪链球菌^[4]。在鉴定纹带棒状杆菌方面也有较好效果，而用于鉴定其他棒状杆菌方面需进一步研究^[5]。可以鉴定鲍曼不动杆菌，但无法对复合群进行进一步区分^[6]。VITEK2 Compact系统对临床少见疑难细菌的鉴定也有一定局限性^[7]。

乳房炎是奶牛的常见病和多发病，金黄色葡萄球菌属于凝固酶阳性葡萄球菌，是奶牛乳房炎主要致病菌之一；凝固酶阴性葡萄球菌是目前公认的一类条件致病菌，近年来由于该菌容易获得并传递耐药性，逐渐受到人们的关注。王原等以API Staph系统为参照，用VITEK2 Compact全自动微生物分析系统鉴定金黄色葡萄球菌，符合率为100%，凝固酶阴性葡萄球菌的符合率为90.5%^[8]。本实验室在应用该技术鉴定牛乳中分离的葡萄球菌属细菌时，发现其准确率低于文献报道。为了明确VITEK2 Compact全自动微生物分析系统是否适用于牛乳中葡萄球菌的鉴定，本试验以16S rRNA基因序列分析方法为参考，结合常规葡萄球菌鉴定项目，研究VITEK2 Compact全自动微生物分析系统对牛乳中葡萄球菌属细菌鉴定的准确性和稳定性，探讨该系统在奶牛乳房炎病原菌快速检测的应用前景。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 试剂: 血平板、营养肉汤，广东环凯微生物科技有限公司；革兰氏染液，南京建成科技有限公司；Bacterial DNA Kit，OMEGA Bio-Tek公司；16S rRNA gene Bacterial Identification PCR Kit，TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司；细菌微量生化鉴定管(兔血浆)，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；革兰氏阳性细菌鉴定卡，梅里埃诊断产品有限公司。

1.1.2 仪器: VITEK2 Compact Systems Version 06.01；麦氏比浊仪(DensiCHEK^TM Plus)，生物梅里埃中国有限公司；PCR仪(Applied Biosystems)，赛默飞世尔科技中国有限公司。

1.1.3 乳样来源: 乳样来自西宁、白银和西安3个大型奶牛养殖场，共计265份(表 1)。 1.2 方法

1.2.1 细菌初步鉴定: 采用间断划线法，对采集的乳样进行细菌分离，对分离的菌株进行革兰氏染色、镜检以及触酶试验，对葡萄串状排列的革兰氏阳性球菌且触酶试验为阳性者，则初步判断为疑似葡萄球菌菌株，再进行后续鉴定。

1.2.2 VITEK2 Compact系统鉴定: 疑似葡萄球菌菌株菌液浓度调整至0.50−0.63麦氏浓度，按照革兰氏阳性细菌鉴定卡的操作说明进行VITEK2 Compact全自动微生物分析系统分析。

1.2.3 16S rRNA基因序列分析: 按照试剂盒操作说明提取疑似葡萄球菌菌株DNA，以该DNA为模板，按照Bacterial identification PCR kit操作说明扩增16S rRNA基因片段，扩增片段送北京六合华大基因股份有限公司测序，测序结果通过(http://ncbi.nlm.nih.gov/)在线BLAST系统进行序列比对，以确定细菌种属。将16S rRNA基因序列分析结果与VITEK2 Compact鉴定结果进行比较。

1.2.4 系统稳定性检测: 随机选择VITEK2 Compact鉴定结果与16S rRNA基因序列分析结果一致的凝固酶阴性葡萄球菌(XA143溶血葡萄球菌)和凝固酶阳性葡萄球菌(BY89-4金黄色葡萄球菌)各1株，分别配制0.51麦氏、0.57麦氏、0.63麦氏浓度菌液，每个浓度设置3个平行，检测系统的稳定性。 2 结果与分析 2.1 鉴定结果符合率

根据16S rRNA基因序列分析结果，52株分离菌株为葡萄球菌。其中凝固酶阴性葡萄球菌菌株42份，凝固酶阳性葡萄球菌菌株10份，具体鉴定结果见表 2。由16S rRNA基因序列分析鉴定的细菌，其生化特性与血浆凝固酶试验结果符合率为100%；由VITEK2 Compact全自动微生物分析系统鉴定的细菌，其生化特性与血浆凝固酶试验结果符合率分别为：血浆凝固酶阴性92.86%，血浆凝固酶阳性50%。

VITEK2 Compact全自动微生物分析系统在使用过程中部分鉴定卡会出现不能鉴定、低分辨等情况：一次性鉴定得到结果的有42株(80.77%)；经过2次鉴定得到结果的有9株(17.31%)，其中凝固酶阴性葡萄球菌5株，凝固酶阳性葡萄球菌4株；另有1株凝固酶阴性葡萄球菌经3次鉴定得到结果。系统对鉴定结果评价中，“Excellent”有26株(50.00%)，其中13株成功符合(50.00%)；“Very Good”有9株(17.31%)，其中3株成功符合(33.33%)；“Good”有9株(17.31%)，其中4株成功符合(44.44%)；“Acceptable”有8株(15.38%)，其中3株成符合(37.50%)。

VITEK2 Compact全自动微生物分析系统对于葡萄球菌在“属”水平的鉴定结果符合率达到96.15%，但对具体种类鉴定时，结果符合率仅为44.23%，其中凝固酶阴性菌“种”水平鉴定符合率为38.78%，凝固酶阳性菌“种”水平鉴定结果为40%。乳样中常见的凝固酶阴性葡萄球菌主要为产色葡萄球菌、溶血葡萄球菌和表皮葡萄球菌；常见的凝固酶阳性葡萄球菌为金黄色葡萄球菌，主要葡萄球菌鉴定符合率见表 3。

2.2 系统稳定性结果

凝固酶阳性葡萄球菌BY89-4，在3种麦氏浓度下鉴定结果相同，均为金黄色葡萄球菌，与原鉴定结果一致，鉴定结果可靠性基本不随菌液浓度变化而变化(图 1A)。凝固酶阴性葡萄球菌XA143，在3种麦氏浓度下鉴定结果相同，均为溶血葡萄球菌，与原鉴定结果一致，鉴定结果可靠性随菌液浓度升高略有上升(图 1B)。

3 讨论

目前实验室对细菌的鉴定主要依赖于菌落形态、染色特性、显微镜下形态特征、生化反应以及选择性培养基等，但这种传统的鉴定方法繁琐、耗时长，同时也会受到培养时间以及实验人员经验等一些人为因素的影响。而目前应用较多的16S rRNA基因序列分析是目前细菌种属鉴定和分类的标准方法，具有准确率高的特点，但其鉴定成本较高。而VITEK2 Compact全自动微生物分析系统依据传统生化鉴定原理，结合现代自动化技术，实现细菌鉴定的快速化和自动化，相对于16S rRNA基因序列分析方法有成本较低、操作简便、效率高的优势。目前，VITEK2 Compact全自动微生物分析系统的应用已较为广泛，涉及医疗卫生领域、食品安全领域、动物疾病诊断领域等^[9-12]。

金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属中致病性最强的种，有人认为对金黄色葡萄球菌的鉴定能力是评价一个鉴定系统能否胜任临床工作的重要指标之一。在“种”水平的鉴定中，王原以API Staph系统为参照，用VITEK2 Compact全自动微生物分析系统鉴定金黄色葡萄球菌，其鉴定符合率高达100%。而在本研究中，以16S rRNA基因序列分析为参考，利用该系统鉴定金黄色葡萄球菌，鉴定符合率仅为40%，推测原因可能有以下几点：(1)

来源不同的金黄色葡萄球菌，在生化特性或反应能力上可能存在一定差异^[13]；(2)细菌生长状态和所处时期不同，其生化反应能力不同，本试验中来源于青海的6株金黄色葡萄球菌经过4个月冻存后复苏，再次鉴定，经过冻存和多次传代后，细菌状态和生化特性可能不同^[14]。另外，试验中部分细菌需通过两次测定才能得到结果，可能与细菌状态不同有关；(3)自动细菌分析仪一般只要是检测到的生化反应组合模式与数据库中某种细菌编码吻合就会终止鉴定，这可能导致生化特性相似的葡萄球菌属细菌，在“种”水平上的鉴定出现错误，从葡萄球菌属鉴定符合率为96.15%，而精确到种的鉴定符合率仅为44.23%，可以支持该推测；(4)细菌培养条件不同，鉴定结果会有不同，如Lowe等发现VITEK2 Compact系统鉴定不同平板培养的类鼻疽伯克氏菌时，准确率存在差异^[15]。另外，在王原的研究中，VITEK2 Compact系统鉴定对凝固酶阴性葡萄球菌鉴定符合率为90.5%，而在本研究中，该系统对凝固酶阴性葡萄球菌鉴定符合率仅为38.78%，可能也与上述原因有关。

稳定性试验结果符合率均为100%，表明该系统稳定性良好，这与乔宁等^[16]的研究结果一致。鉴定结果可靠性均在90%以上，基本不随菌液浓度变化，或变化幅度极小，从而进一步证明，鉴定中出现需多次鉴定的情况，不是由于菌液浓度差异或者系统本身不稳定造成，而是细菌本身原因所致，因此建议严格按照操作说明，使用处于对数生长期细菌进行检测。

在对系统鉴定结果可靠性评价分析时，发现系统评价水平由高到低依次分为E、VG、G、A，但其对应的鉴定结果符合率却依次为50%、33.33%、44.44%、37.50%，并不依次对应，且符合率均较低，可见系统中给出的鉴定水平评价与鉴定结果准确性之间并无直接的相关性。

本次试验中还发现，有68.75%的溶血葡萄球菌被误鉴定为沃氏葡萄球菌，革兰氏阳性细菌鉴定卡说明书中显示，当鉴定结果为沃氏葡萄球菌，若产黄色素可能为巴斯德葡萄球菌，但未明确列出区分溶血葡萄球菌和沃氏葡萄球菌的补充试验。笔者认为使用说明中需对此项目进行补充说明。

总体来看，VITEK2 Compact全自动微生物分析系统鉴定牛乳中分离得到的葡萄球菌，在“种”的水平，鉴定结果准确性不高，但在“属”的水平鉴定准确率很高，其中对凝固酶阴性菌鉴定结果准确率比凝固酶阳性菌的高，该结果不因“正常乳样”和“乳房炎乳样”有所区别，因此VITEK2 Compact全自动微生物分析系统可以用于牛乳中葡萄球菌在“属”水平的鉴定。