在世界各地，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是造成医院感染和社区感染的最常见病原菌之一，能够引起各种感染，从轻微的皮肤损伤到严重威胁人类生命的疾病，如坏死性肺炎、骨髓炎、心内膜炎和败血症等强致死性疾病^[1]。有效的抗生素治疗是目前对抗金黄色葡萄球菌感染的主要手段。但随着抗生素的广泛使用，耐药性问题就会越来越严重。迄今为止，人类面临的最大的耐药性问题当属感染几乎遍及全世界的“超级细菌”--耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)^[2]。目前普遍将糖肽类抗生素万古霉素(Vancomycin)作为治疗MRSA感染的一线用药^[3]。随着MRSA感染病例的增加和万古霉素的广泛使用，临床上已经出现了万古霉素治疗失败的病例^[4]，随后对万古霉素敏感性降低的金黄色葡萄球菌在世界各国均有报道，在世界范围内引起了极大关注。

完全耐药金黄色葡萄球菌的耐药性是从耐万古霉素肠球菌(vancomycin-resistant enterococci，VRE)中获得耐药基因vanA等形成^[5]。中介耐药金黄色葡萄球菌的形成与许多调节基因的突变有关，基因的突变能引起细菌的代谢和转录水平发生变化，但耐药性发展过程非常复杂，确切的耐药性产生机制尚未被阐明^[6]。近年的研究普遍认为中介耐药金黄色葡萄球菌是由敏感菌经过一系列突变后转变而来。本研究通过前期体外诱导获得中介耐万古霉素金黄色葡萄球菌，PCR扩增与万古霉素耐药性密切相关的4个重要基因rpoB、graR、graS和vraS，并测序分析。比较诱导前后不同菌株的基因序列，探讨金黄色葡萄球菌在万古霉素的选择压力下耐药性的产生机制，具有重要的理论意义，也可为研究新的控制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的策略提供重要的实验依据。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 菌株来源: 金黄色葡萄球菌共13株。1334(S1)和1340(S12)购自中国农业菌种保藏中心(ACCC)；ATCC 29213(S2)、ATCC 6538(S6)、1.1697(S3)和1.1529(S8)购自中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)；21648(S4)、23656(S5)和ATCC 27217(S11)购自中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)；140660(S7)和141405(S13)购自中国药学微生物菌种保藏管理中心(CPCC)；S9、S10由中国农业大学动物医学院赠与。所有菌株均保存于-80 ℃。

1.1.2 试剂: 万古霉素、溶菌酶、溶葡萄球菌素均为美国Sigma公司产品；万古霉素E-test条为法国生物梅里埃产品；脑心浸液琼脂(BHIA)培养基、脑心浸液肉汤(BHI)培养基、Mueller-Hinton (MH)琼脂培养基均为英国Oxiod公司产品；PCR反应所用的ExTaq、dNTPs等均购自大连TaKaRa宝生物工程有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；引物由北京博迈德生物技术有限公司合成。 1.2 方法

1.2.1 最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)测定: (1)琼脂稀释法：配制浓度0.5-4.0 mg/L的BHI-万古霉素选择性固体培养基。过夜脑心浸液琼脂培养的金黄色葡萄球菌用生理盐水调制成10⁶ CFU/mL，取100 μL稀释好的菌悬液分别接种于0.5-4.0 mg/L的不同浓度BHI-万古霉素选择性平板的表面。将接种后的平板置于37 ℃普通温箱孵育24 h后观察结果。于黑色、无反射光的物体表面，用透射光判断试验终点，在投射光下仔细检查，是否有1个以上菌落或薄膜样生长， > 1个菌落推测为对万古霉素的敏感性降低菌株，以能抑制细菌生长的最低药物浓度为此菌株的MIC值。(2) E-test法：挑取脑心浸液琼脂培养基上的单个菌落，制成浊度为0.5麦氏菌悬液(使细菌的浓度达10⁸ CFU/mL后)，均匀涂布于厚4 mm、直径150 mm的MH琼脂培养基上，室温放置15 min待琼脂表面水分被吸干。贴长60 mm、宽5 mm、浓度范围为0.016-256 mg/L的E-test试验塑料薄条于涂布后的MH琼脂培养基上，37 ℃孵育18 h读结果。结果按照美国临床实验室标准化研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)规定，读取椭圆形抑菌环的边缘与E-test试验塑料薄条交叉处的药物浓度标记值即为万古霉素对该菌的最低抑菌浓度(MIC)值。如E-test试验塑料薄条两端产生不同的交界点，则读取较高数值侧的MIC值，如两侧相差值大于1个稀释度，则需重复实验。每次检测MIC值均用标准株ATCC 25923做质控监测。

1.2.2 耐万古霉素金黄色葡萄球菌体外诱导: 根据美国临床实验室标准化研究所2011年出版的操作手册中的定义：金黄色葡萄球菌对万古霉素的最低抑菌浓度≤2 mg/L时，是万古霉素敏感金黄色葡萄球菌(vancomycin susceptible S.aureus，VSSA)；MIC为2-4 mg/L时是指异质性中介耐万古霉素金黄色葡萄球菌(heterogeneous vancomycin-intermediate S.aureus，hVISA)，hVISA是指原代菌对万古霉素敏感，而子代菌种中却含有VISA亚克隆，出现频率为10^-6或以上^[7]；MIC为4-8 mg/L，为万古霉素中介耐药金黄色葡萄球菌(vancomycin intermediate S.aureus，VISA)；MIC≥16 mg/L，为完全耐药金黄色葡萄球菌(vancomycin-resistant S.aureus，VRSA)。 用脑心浸液琼脂培养基复苏金黄色葡萄球菌，挑取单克隆细菌，用生理盐水稀释成0.5麦氏左右，取100 μL接种于浓度为含1/2MIC万古霉素浓度的脑心浸液琼脂平板上，37 ℃恒温培养24 h。如有菌落生长，接种于同浓度BHI-万古霉素平板上，每个药物浓度培养4 d，每4天测定一次细菌的万古霉素MIC，根据细菌的MIC决定下次接种的万古霉素平板浓度，连续培养60 d。当菌株万古霉素MIC≥4 mg/L时，用E-test法再次验证。

1.2.3 耐药性关键基因检测: 提取基因组DNA：分别取10对金黄色葡萄球菌的细菌培养液1-5 mL，12 000 r/min离心1 min，尽量吸净上清。配20 g/L的溶菌酶，向菌体沉淀中加入180 μL溶菌酶使沉淀悬浮。再加入15 μL溶葡萄球菌素，混匀，37 ℃处理1 h以上。其余步骤按提取细菌基因组DNA试剂盒说明书进行。graR、graS、vraS和rpoB基因扩增引物见表 1。25 μL PCR反应体系：TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，10×Buffer (含有Mg²⁺)2.5 μL，dNTPs (2.5 mmol/L)2 μL，上下游引物(25 μmol/L)各1 μL，模板DNA (50-100 ng)1 μL，加ddH₂O至25 μL。根据预扩增的目的基因graR、graS、vraS和rpoB基因片段大小、碱基构成、引物序列的不同，设置不同的反应条件。graS、rpoB基因的扩增条件如下：94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30次循环；72 ℃ 7 min。vraS、graR基因的反应条件如下：94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，57 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30次循环；72 ℃ 7 min。结束后，将PCR产物于4 ℃保存。 PCR产物电泳检测，以目标片段处出现荧光条带为阳性。PCR产物纯化后送北京博迈德生物技术有限公司测序。将诱导前后13对金黄色葡萄球菌的graR、graS、rpoB、vraS基因进行序列比对，研究基因突变情况。 2 结果与分析 2.1 MIC测定

通过60 d体外诱导金黄色葡萄球菌，测定诱导前后金黄色葡萄球菌对万古霉素的MIC，如表 2所示。发现除了菌株S3诱导前后MIC值没有发生变化之外，其余12株金黄色葡萄球菌对万古霉素MIC都有不同程度的升高，其中6株菌经过体外诱导之后成为VISA，7株菌诱导之后对万古霉素仍处于敏感状态，MIC < 4 mg/L。

2.2 万古霉素诱导结果

13株金黄色葡萄球菌通过万古霉素的逐步诱导60 d后，有7株菌对万古霉素仍处于敏感状态，万古霉素MIC仍未超过4 mg/L，除了S3菌株的MIC值没有发生变化之外，其余6株菌S5、S6、S8、S11、S12和S13的MIC值都有所提升。在这13株金黄色葡萄球菌中，6株菌诱导为VISA (万古霉素MIC > 4 mg/L)。其中S9的MIC为8 mg/L，剩余5株菌的万古霉素MIC均超过8 mg/L，如表 2所示。图 1为13株金黄色葡萄球菌万古霉素MIC随诱导时间的变化情况。

2.3 耐药性关键基因检测

以所有菌株的基因组DNA为模板，利用表 1中的特异性引物对所有菌株的耐药性基因graR、graS、rpoB、vraS进行PCR扩增。电泳检测PCR产物均能获得目的条带。图 2为graR、graS、rpoB和vraS的基因条带。所有菌株的PCR产物纯化后送北京博迈德生物技术有限公司测序。将诱导前后13对金黄色葡萄球菌的graR、graS、rpoB和vraS基因进行序列比对。比对结果如表 3所示。

经过实验室60 d的体外诱导，大部分菌株都至少有一个基因发生了突变，并导致编码的氨基酸发生改变。13株菌中有6株菌诱导成VISA，占所有菌株的46%。在这5株rpoB基因存在突变的VISA菌株中有3株菌S4、S10、S7同时有L466S、H481N这两个突变，占rpoB突变率的60%；有2株菌同时有T1182I的突变。在7株VSSA中，有2株菌存在rpoB氨基酸的突变，其中S5也存在T1182I突变，而S6却发生I1182T的突变，即第1 182位的异亮氨酸被苏氨酸替代；另外5株VSSA菌株S8、S11、S12、S13和S3的rpoB基因均未发现氨基酸突变。

经过60 d的体外诱导之后，6株VISA中有2株菌的vraS基因发生氨基酸的改变，其中VISA菌株S10发生了G15V的突变，而S7却是V15G的突变；其余11株菌，包括7株VSSA的vraS基因都未发生变化。graR仅在1株VSSA中发生I136V、G207S的突变。

6株VISA中也有5株菌的graS基因经过60 d的体外诱导发生了氨基酸突变，与rpoB基因的突变率在VISA中所占的比例相似，VISA中只有S2菌株的graS基因未发现氨基酸的改变。在这5株graS基因存在突变的VISA菌株中有4株菌S4、S10、S7和S1同时有R232K突变，占graS突变率的80%。同时有3株VISA菌S10、S1和S9都有L26F的突变，3株VISA菌S4、S10、S1都有I59L突变。在7株VSSA中，有3株菌的graS基因在诱导前后未发现氨基酸的改变。其中L26F、D223Y、T224I的突变各有两株菌产生，但是S12却发生了F26L、L59I的突变。

3 讨论

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌具有多重耐药性，感染率逐年升高，与艾滋病、病毒性乙型肝炎并列为世界三大感染性疾病，严重威胁着人类的健康^[8]，万古霉素通过抑制细胞壁合成来达到抑制细菌的目的^[9]。我国暂无VISA和VRSA的报道，但据最新研究表明，我国耐甲氧西林金黄色葡萄球菌对万古霉素的MIC有逐年上升的趋势^[10]，金黄色葡萄球菌对万古霉素的敏感性下降已成为人们关注的热点。本研究利用前期实验通过实验室体外诱导获得耐万古霉素金黄色葡萄球菌，结果显示：13株万古霉素敏感性金黄色葡萄球菌体外经万古霉素诱导60 d后，发现除了菌株S3诱导前后MIC值没有发生变化之外，其余12株金黄色葡萄球菌对万古霉素MIC都有不同程度的升高，其中6株菌经过诱导之后达到万古霉素中介耐药，占菌株数量的46%，说明大多数对万古霉素敏感的金黄色葡萄球菌在长时间的选择压力下都有转变为VISA的潜力。此现象警示各医院系统要重视耐药性问题，合理地选择使用抗生素药物。

多种基因及基因调控系统参与金黄色葡萄球菌细胞壁的合成代谢，与万古霉素MIC值的改变密切相关^[11-12]。过去关于万古霉素耐药性机制的研究主要集中在双组分调控系统(two-component regulatory system，TCRS)。有大量报道表明，TCRS相关基因vraRS^[13]、graRS^[14-16]、walKR^[17-18]的突变与hVISA和VISA的出现直接相关。编码RNA聚合酶β亚单位的rpoB突变也可使Mu3(hVISA)转变为Mu50(VISA)^[19-20]。Cui等通过基因工程研究指出vraS基因的I5N突变和graR基因的N197S突变在VSSA向VISA的逐渐转变中起着非常重要的作用^[15]。但也有报道vraSR突变不经常在VISA临床菌株中找到^[21]。Howden等^[16]报道用VISA的graS等位基因替换对万古霉素敏感的亲本株的graS等位基因，导致敏感菌的万古霉素抗性达到敏感菌和临床分离株VISA之间的一个水平。JKD6008(VISA)和JKD6009(VSSA)相比较，尽管有6个基因突变，但是有一个潜在的重要突变导致了预测的第136位非极性氨基酸异亮氨酸取代了极性氨基酸苏氨酸(T136I)。导入SACOL0717(graS) T136I突变到JKD6009，提高了万古霉素抗性。Matsuo等^[19]报道编码RNA聚合酶β亚单位的rpoB基因的第481位氨基酸的组氨酸被替换为酪氨酸(H481Y)增加了金黄色葡萄球菌对万古霉素的抗性。

本研究对13株金黄色葡萄球菌进行PCR扩增，扩增与万古霉素耐药性密切相关的4个重要基因：rpoB、vraS、graR和graS，并测序分析，比较诱导前后不同菌株的氨基酸序列。比对结果发现：有3株VISA菌株同时有L466S、H481N这两个突变，但未发现H481Y的突变。Alam等^[3]报道rpoB基因的H481位置是金黄色葡萄球菌万古霉素MIC值升高的一个重要位置。H481Y/N位于利福平耐药性区域，该位点在临床利福平耐药性金黄色葡萄球菌中已被多次报道^[22-24]。与其他突变相比，rpoB的突变(包括H481N的突变)对利福平耐药性和万古霉素耐药性具有双重作用^[25-26]。虽然rpoB的L466S突变未曾在先前的研究中报道过，但本研究中有H481N突变的3株VISA中都同时伴随着L466S的突变。同时，具有L466S和H481N突变的3株VISA的graS基因上都包含一个新的突变位点R232K，并且这3株VISA的MIC值都较高(MIC≥12 mg/l)；而S1菌株只含有R232K的突变，MIC值较低(MIC=10 mg/l)。因此推测rpoB的L466S和H481N的突变与graS的R232K突变具有协同作用，协同提升万古霉素的耐药性，使其达到一个较高的耐药性水平。尽管有报道表明H481Y、I5N、N197S和T136I的突变有助于VSSA成为VISA，但在本研究中却未发现这些突变。此外，本研究发现VISA菌株S2的rpoB基因第917位精氨酸突变为丝氨酸，vraS、graR、graS基因未发现氨基酸的置换，其MIC为12 mg/l。推测rpoB的R917S突变与金黄色葡萄球菌对万古霉素的耐药性有关，但是该突变的具体功能还有待进一步证实。与其他的报道相比，有些菌株的rpoB、vraS、graR和graS基因上不包含重要的突变，但是MIC值仍有所提升，这表明可能有一些其他未知的基因或者突变位点与万古霉素耐药性的形成有关。

本研究还发现一些突变位点既可能出现在VISA菌株，也可能出现在VSSA菌株中，与万古霉素MIC升高不具有明显的相关性。包括rpoB基因的T1182I/I1182T突变、vraS基因的G15V/V15G突变、graS基因的L26F/F26L突变及I59L/L59I突变。另外，graS基因上的D223Y、T224I突变与graR的I136V、G207S这4个突变仅发生于VSSA菌株中，推测与VISA的转变无关。有报道表明graS基因上的L26F、I59L和T224I等位点既可能出现在VISA菌株，也可能出现在VSSA菌株中且突变率较高，但其对万古霉素耐药性的产生是否具有显著影响还不清楚^[27]。

4 结论

研究表明VISA可在实验室诱导获得，并且诱导成功率较高，敏感型金黄色葡萄球菌长期在万古霉素的选择性压力下可转变成中介耐药菌株。相比vraS和graR基因，发生在rpoB和graS上的突变对耐药性的产生更具有重要的意义；研究在VISA中的rpoB和graS基因上发现3个新的突变位点：L466S、R917S、R232K。这些突变位点很可能在万古霉素耐药性发展中起关键作用。