空气中约有80%氮气，但植物不能直接利用，而固氮微生物却可以将空气中的氮转化为植物可用的氨，称之为微生物固氮过程^[1-2]。微生物固氮过程是通过固氮菌体细胞内的多种固氮酶，在常温和常压的条件下，将空气中的氮气(N₂)还原成氨(NH₃)的生化过程^[3-4]。所以，研究固氮酶的特性对研究生物固氮是有重大意义的。

目前，发现具有生物固氮能力的微生物多为细菌，有100多个属，占细胞系统发育分支的一半以上^[5]。而已经发现的植物内生固氮菌主要集中在固氮螺菌属(Azospirillum)、肠杆菌属(Enterobacter)、产碱杆菌属(Alcaligennes)、草螺菌属(Herbaspirillum)等，其宿主植物有甘蔗、玉米、水稻、甘薯、香蕉、菠萝、牧草等^[6]。2015年有研究发现，在意大利的水稻根部分离到具有植物促生作用的内生菌株Kosakonia oryzaeKO348^[7]；同年，瑞士的Bergottini在巴拉圭圣圣冬青山的巴拉圭茶根部分离出一株也具有植物促生作用的菌株Kosakonia radicincitans strain YD4^[8]，该菌株存在促进植物生长活性的基因。

本研究从采集的玉米根系中分离筛选出一株具有固氮能力的内生细菌Kosakonia radicincitansGXGL-4A，对其进行了形态学、生理生化及分子生物学鉴定，并在此基础上对其泌铵能力和固氮酶活性进行了测定。到本文撰稿前，仅国外对Kosakonia oryzae有研究报道，且只发现其具有植物促生作用，未见其有固氮能力相关的研究报道。而本研究经过大量实验，首次证实了Kosakonia radicincitansGXGL-4A具有固氮基因和固氮能力，对固氮微生物的研究具有重要的理论和现实意义。

1 材料与方法 1.1 材料

样品：玉米根及根际土壤样品共106份，分别采集自上海、广东、广西及江西地区。

试剂：PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；2×Taq Master Mix购于北京康维试剂生物技术公司(产品组成为：0.1 U/μL Taq polymerase，500 μmol/L dNTP each，20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.3)，100 mmol/L KCl，3 mmol/L MgCl₂，其他稳定剂与增强剂)；细菌基因组提取纯化试剂盒购自美国普洛麦格生物产品(上海)有限公司；PCR产物回收试剂盒购于德国凯杰生物技术(上海)有限公司；其它化学试剂为国产分析纯或进口分装。

1.2 固氮菌的富集培养、分离、纯化

1.2.1 根际土壤: 称取附着在玉米根上的土5 g，放入45 mL无菌水中，28 ℃、180 r/min振荡30 min，静置10 min，制得10⁻¹稀释液，用无菌水10倍系列稀释，各取0.1 mL涂布于Ashby平板^[9]，28 ℃培养2−3 d后，选取菌落形态不同的单菌落反复进行平板划线分离，得到纯菌落后保存以备鉴定和实验使用^[10]。

1.2.2 玉米根: 取根系，用水洗净，在70%酒精中浸泡30 s，无菌水洗3次，再在加入1滴表面活性剂的5%−20% NaClO溶液中浸泡5−10 min，在70%酒精中浸泡30 s，无菌水洗5次，最后一次的无菌水涂布平板。如无菌生长说明消毒彻底，反之则重新取样分离。将灭菌的材料及10 mL磷酸缓冲液放入灭菌的研钵内磨碎，静置5 min，取上清液1 mL (作为原始液)，用无菌水做10倍稀释，再分别取0.1 mL涂布于Ashby平板，28 ℃培养2−3 d后，选取菌落形态不同的单菌落反复进行平板划线分离，得到纯菌落后保存以备鉴定和实验使用^[8]。 1.3 固氮菌的筛选、鉴定

1.3.1 菌落及菌体形态观察: 在固氮菌分离培养基平板上培养初步筛选的菌株2−3 d，观察其菌落形态；取菌体涂片，经革兰氏染色后，在普通光学显微镜下观察菌体形态；根据参考文献[11]处理扫描样品，用LB液体培养基^[9]过夜培育GXGL-4A菌株，吸取1 mL菌液加入已灭菌的1.5 mL离心管，室温4 000 r/min离心2 min，吸出上清液，加无菌水重悬沉淀，立即吸取少量菌液于铜板上，置于空气中干燥，干燥固定后的样品用扫描电镜(Tecnai G2 spirit Biotwin，120 kV Bio-TEM)观察固氮菌形态。生理生化特性的测定参考《微生物学实验教程》^[12]。固氮菌生理特性的测定参照《常见细菌系统鉴定手册》^[13]。

1.3.2 固氮酶基因nifH的检测: 用试剂盒提取菌株的基因组DNA作为PCR扩增模板，上游引物为nifH P1 (5′-GGCTGCGATCCVAAGGCCGAYTCVA CCCG-3′)，下游引物为nifH P2 (5′-CTGVGCCTTGTT YTCGCGGATSGGCATGGC-3′)。25 μL PCR反应体系：DNA模板1 μL，20 μmol/L引物P1 1 μL，20 μmol/L引物P2 1 μL，2×Taq Master Mix 12.5 μL，双蒸水9.5 μL。扩增程序为：94 ℃5 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 10 min。扩增产物经1.0%−1.2%琼脂糖电泳检测。

1.3.3 16S rRNA基因鉴定: 用试剂盒提取菌株的基因组DNA作为PCR扩增模板，上游引物为f (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3′)，下游引物为r (5′-TACGGCTACCTTGTTA CGACTTCACCCC-3′)。16S rRNA基因的PCR扩增采用25 μL反应体系(同nifH基因扩增体系)，扩增程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30个循环；72 ℃ 10 min。扩增产物经1.0%琼脂糖电泳检测正确，送上海生物工程公司进行测序。所得基因序列通过美国国家生物技术信息中心NCBI数据库进行BLAST在线序列比对，运行软件绘制系统发育树。 1.4 序列拼接与基因组分析

菌株GXGL-4A基因组DNA按照试剂盒说明书进行制备。制备的基因组DNA通过Illumina HiSeq 2500进行双向测序，所得序列通过Velvet v. 1.2.09软件进行组装，获得基因组草图。利用ZetaBio原核基因组注释系统进行标注，根据预测模型的基因表型由基于同源的UniProt数据库的蛋白质命名。

1.5 铵载体基因nrgA的克隆分析

选取铵载体基因nrgA进行PCR克隆。nrgA基因的PCR引物为nrgA-F (5′-CGGGATCCATGAAA AACACAACATTAAAAACAGGTC-3′)和nrgA-R (5′-CCCAAGCTTTCAGGCGTTGTAGGCGTTTTCGCCG-3′)。PCR扩增以细菌基因组总DNA为模板，采用25 μL反应体系(同nifH基因扩增体系)，扩增程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30个循环；72 ℃ 10 min。扩增产物经1.0%-1.2%琼脂糖凝胶电泳纯化回收，连接到pMT-19T载体，并转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，经PCR鉴定出阳性转化子后进行测序并确认。测序所得基因序列提交GenBank数据库进行比对分析。

1.6 靛酚蓝-分光光度法测定菌株分泌氨态氮含量

1.6.1 标准曲线的制定: 配制标准液：精确称取0.235 8 g (NH₄)₂SO₄溶于水，定容至100 mL，获得含氨态氮量为500 mg/L原液，稀释10倍得氨态氮含量为50 mg/L的标准液。 配制检测试剂：1.25%亚硝基铁氰化钠溶液(二水亚硝基铁氰化钠0.362 2 g，加水定容至25 mL)，溶液A (苯酚5.00 g，1.25%亚硝基铁氰化钠溶液2.0 mL，加水定容至500 mL)，溶液B (NaOH2.50 g，柠檬酸三钠2.0 g，NaClO 3.5 mL，加水定容至400 mL)。 按照表 1依次加入各种试剂，充分混合后，放入37 ℃水浴显色20 min，取出后用水冷却至室温，在637 nm下测定其OD值^[14]。

1.6.2 样品的检测: 将GXGL-4A菌株在LB培养基中于37 ℃、180 r/min培养过夜，培养液按10⁵倍稀释后涂布至Ashby无氮固体培养基上生长4 d。在无氮条件下，固氮菌GXGL-4A会利用空气中的氮气进行固氮作用，并将其固定的部分氮最终以氨态氮形式分泌到胞外。因此，可用移液枪(无菌条件下，用单片刀切去Tip头部)吸取略带粘稠的分泌物，加入10倍体积的无菌水稀释后，稀释液通过0.45 µm无菌滤膜除菌，收集到无菌Eppendorf管中即为待测样品。样品中氨态氮的浓度采用靛酚蓝-分光光度法进行测定。 1.7 乙炔还原法(ARA)^[15]测定固氮酶活性

以瓦斯兰德固氮菌(Azotobacter vinelandii，瓦斯兰德固氮菌是本实验室从中国微生物保藏中心购买的一株革兰氏阴性菌，实验前期对其进行过研究)为对照。将菌株接种在橡胶塞封口的50 mL三角瓶中，在28−30 ℃下培养24−48 h后，用无菌注射器抽出2 mL的气体，然后再给每瓶注入2 mL C₂H₂，再置培养箱中培养12−48 h。从各培养瓶中取气样200 μL，注入日本岛津公司生产的GC-2010型号气相色谱仪中，测C₂H₄的生成情况。从气相色谱仪显示屏的C₂H₄峰值判断有无C₂H₄的产生，以接种但未注入C₂H₂的培养瓶作为对照1，以未接菌但注射C₂H₂的培养瓶做对照2。以nmol C₂H₄/(mL· h)表示固氮酶活性(N)。

2 结果与分析 2.1 固氮菌筛选、形态观察及生理生化特征

经Ashby无氮培养基多次筛选后得到GXGL-4A菌株。GXGL-4A的菌落在无氮培养基上为无色透明，表面湿润，圆形，不易挑起；在LB培养基上为淡黄色，湿润，边缘清晰，圆形，易挑起。革兰氏染色结果显示为阴性。电镜下观察为杆状，有荚膜，能泌铵和胞外多糖类黏性物质，周生鞭毛或一端生单鞭毛，易脱落，菌体大小约为1.5 µm×0.5 µm (图 1)，单个或常见2个菌体细胞串联在一起。不运动，兼性厌氧，葡萄糖氧化发酵阳性，柠檬酸盐利用阳性，发酵葡萄糖产酸产气，M.R试验阴性，产吲哚实验阴性，硝酸盐还原实验阳性，接触酶阳性，属于Kosakonia radicincitans。

2.2 基于16S rRNA基因的系统发育分析

菌株GXGL-4A的16S rRNA基因片段条带单一，经检测序列长度约为1.2 kb，其固氮酶基因nifH的PCR扩增产物在琼脂糖凝胶上有清晰条带显示(图 2)，序列长度为296 bp。根据16S rRNA基因的Blast比对结果绘制GXGL-4A的系统发育树(图 3)，结合基因组测序，结果表明所筛选出的玉米固氮菌GXGL-4A属于Kosakonia radicincitans，与Kosakonia oryzae Fo8A1d 16S rRNA基因序列有95%的相似性。

2.3 固氮菌GXGL-4A的基因组特征分析

通过测序可得，覆盖度为200×，拼接收获得GXGL-4A菌株的基因组序列，全长约为5.64 Mb，GC含量为53.93%；其中编码区占整个基因组大小的87.15%。综合菌株GCGL-A的形态特征、生理生化特征、16S rRNA基因序列及基因组测序分析结果，将其命名为K. radicincitans GXGL-4A，属于γ-变形菌纲，肠杆菌目(Enterobacteriales)，Kosakonia radicincitans种，为植物根际促生菌(PGPR)。

通过对固氮菌GXGL-4A基因组扫描，对其固氮相关基因，包括固氮酶结构基因和其调节基因、铵载体、一般氮代谢调控基因等进行了分析，共鉴定出27个相关基因。其中包括5个nif结构基因及其5个辅因子(FeMoco)；7个一般氮代谢调控基因，包括1个ntrB、3个ntrC、2个glnD、1个PII；1个铵载体(nrgA)；1个固氮酶调节基因(nifA)及8个其它nif基因。其中，铵载体基因nrgA已提交GenBank数据库，其GenBank登录号为KU057369。

2.4 铵载体nrgA基因的克隆结果

对铵载体nrgA基因进行克隆，采用PCR法成功扩增出其全长DNA序列，大小为1.26 kb，在琼脂糖凝胶电泳上可观察到一条清晰的条带(图 4)。

2.5 分泌物中氨态氮含量测定

2.5.1 标准曲线的制定: 以标准氨氮量为横坐标、OD为纵坐标绘制标准曲线，见图 5，该标准曲线方程为y=0.068 6x−0.075 6，R²=0.999 3，表明其曲线相关性很好，可用于氨态氮的检测。

2.5.2 固氮菌胞外氨态氮含量的测定: 实验进行6个平行样品检测，得出其吸光度，代入标准曲线可以得到其氨态氮含量，分别为0.248、0.255、0.243、0.258、0.251、0.249 μg。经计算，可得氨态氮含量为2.51 mg/L。 2.6 GXGL-4A和瓦斯兰德固氮菌的固氮酶活性

如表 2所示，GXGL-4A菌株在无氮培养基上能够有效地还原乙炔，达到232.94 nmol C₂H₄/(mL·h)，但在LB培养基培养时其还原乙炔的活性降低，为88.86 nmol C₂H₄/(mL·h)，约为无氮培养条件下的1/3；而瓦斯兰德固氮菌则相反，其在LB培养基上为383.47 nmol C₂H₄/(mL·h)，约为无氮培养条件下[76.79 nmol C₂H₄/(mL·h)]的5倍，结果表明GXGL-4A菌株相比瓦斯兰德固氮菌更能适应无氮环境，而在有氮环境中菌株的固氮能力则被抑制。

3 讨论

近年来，随着生物固氮研究的深入，新的固氮微生物被不断发现。本研究从两广地区、上海等地采集了106个样品，经过多次筛选获得6株固氮菌，再对这6株菌进行固氮酶nifH的检测，最终选定GXGL-4A为供试菌株。对GXGL-4A菌株经过电镜观察及生理生化鉴定发现其体外有荚膜，并能分泌出胞外多糖类黏性物质，菌落不易挑起。nifH基因是固氮酶中最保守的一个基因^[16]，常用来对固氮酶进行鉴定^[17]。本实验通过nifH基因引物进行PCR扩增得到了GXGL-4A的nifH基因片段，说明GXGL-4A是固氮菌，再结合16S rRNA基因进一步鉴定使得结果更精确。通过16S rRNA基因序列分析比对，GXGL-4A与Kosakonia oryzaeFo8A1d 16S rRNA基因序列有95%的相似性，并结合基因组测序鉴定其为Kosakonia radicincitanssp.，属于肠杆菌目(Enterobacteriales)。

铵载体蛋白是一类存在于细胞膜上主动转运NH₄⁺的载体，普遍存在于真核生物或原核生物细胞膜上，可将细胞所处环境中的微量铵离子转运到细胞内，确保细胞内的铵库稳定和细胞氮代谢的正常运行^[18-19]。第一个被克隆的铵载体蛋白基因是来自酵母(Sauharomy cescerevisiae)中的低亲合高容量铵载体基因mep。有研究表明，mep1、mep2、mep3这3个基因在酵母基因组中表达铵转运蛋白，它们之间的协同作用能够影响酵母吸收环境中的铵离子，当外界环境中唯一的氮源只有铵离子，且铵离子浓度低于5 mmol/L时，同时缺失这3个基因的酵母突变体不能生长^[20]。原核生物中第一个被克隆的铵载体基因是来自枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)中的nrgA基因^[18]。大肠杆菌(Escheruchia coli)中的铵载体编码基因amtB编码产物由401个氨基酸组成，与nrgA具有42%相似性^[21]。铵通过直接调控nifLA操纵元的表达及nifA的活性抑制固氮酶活性^[21]。此外，从棕色固氮菌(Azotobacter vinelendii)^[22]、巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)^[23]和根瘤菌(Rhizobium)^[24]中也克隆出铵载体蛋白编码基因。本研究通过对GXGL-4A菌株进行基因组扫描，并结合PCR产物的测序验证，共鉴定出该菌27个固氮相关基因，包括固氮酶结构基因和其调节基因、铵载体、一般氮代谢调控基因等，部分基因序列已提交到GenBank数据库。该菌具有较好的泌铵能力，目前我们正在进行铵载体基因的原核表达及基因敲除等工作，以期通过基因工程的方法进一步提高该菌的泌铵能力，并深入研究其泌铵和铵转运分子机制。

采用靛酚蓝-分光光度法测定固氮菌胞外分泌物中铵态氮的含量具有方法简单、经济快捷、结果可靠等特点。即使在有氮条件下，如采用包括玉米浆、酵母粉、大豆粉、蛋白胨等有机氮源作为发酵培养基主要成分，其测定结果与以硝酸钠等无机氮源培养测定的最终结果并无差异^[14]，后期若获得大量的泌铵突变株可以采用此法进行初筛，再结合突变株在无氮培养条件下的生长表现即可迅速鉴定出目标突变株，加快泌铵突变株的创制进程。