根区环境受到土壤理化性质、土壤微生物群落构成的微生态系统影响发生改变，而根围微生物经过长期营养循环，受到土壤质量、土壤类型以及果树的种植年限等多种因素的相互作用，微生物群落必然也会复杂多样^[1-2]。因此，根围微生物群落多样性可作为指示土壤质量、评价土壤肥力的生物指标。叶片是叶围微生物生存的“微环境”^[3]，作为微生物群落的另一个动态栖息地^[4-5]，植物叶围活跃着多种微生物，这些微生物可能影响氮素的固定、促进植物生长、控制植物病害等^[6]，不仅影响植物健康，也对微生物群落自身的演变发挥重要作用。

葡萄和葡萄酒产业在国内迅速发展，同时为使葡萄酒产业国际化，国内大力推广以及改良酿酒葡萄品种，Bokulich等^[7]利用Illumina高通量测序研究了不同地域、不同品种酿酒葡萄汁中微生物群落结构，发现在葡萄汁中含有代表葡萄酒酿酒过程中酯类物质形成的属如Gluconobacter或是产生异味的Lactobacillus，以及能提高葡萄酒感官的部分菌群，同时运用统计模型预测了不同品种酿酒葡萄对酿酒葡萄园微生物群落的影响，推测不同品种微生物群落构成差异可能会导致葡萄酒品质发生变化。Martins等^[8]利用T-RFLP方法研究了不同葡萄园中根围、叶围、葡萄藤以及葡萄浆果上的附生细菌，发现在葡萄叶围以及葡萄上的优势菌群为Pseudomonas和Sphingomonas，这两种菌属以能在逆境胁迫中生长而著称。同时研究还表明，葡萄果实、叶片微生物数量变化、群落结构和菌群多样性及变化规律受葡萄藤以及根区微生物的影响。通过改善根区、叶片微生物生态环境来促进植物生长，以及从植物生长微环境中筛选具有良好促生和抗菌作用的有益菌群已日益被人们重视，如分布于根围土壤、叶片、果实中的微生物群落Candida oleophila、Cryptococcus laurentii等能有效抑制果实采后病害^[9-10]，而葡萄根区以及叶片微生物不仅可以揭示葡萄与微生物的生态关系，而且对开发利用有益的葡萄根区微生物也有重要意义。

由于环境中99%以上的微生物是不可培养的，传统方法只能揭示部分微生物特征，而采用分子生物学方法可避免传统方法的局限性，丰富对生态系统微生物多样性的认识。T-RFLP技术能够产生大量的可操作分类单元(OTUs)，并结合在线数据库，快速准确地获得相关微生物的重要信息，用于各种微生物群落的分析比较，是一种较为先进的研究微生物群落的分子生态学方法^[11]。因此，本文以不同品种酿酒葡萄为研究对象，采用T-RFLP技术考察不同品种酿酒葡萄根围以及叶围微生物群落种群结构和数量变化，旨在为改善葡萄栽培条件，适时调整葡萄园的栽培管理策略，指导葡萄种植业更加合理有序发展提供理论依据。

引物：FAM-27 F/926 R [上游引物27F 5′端加羟基荧光素FAM (6-carboxyfluorescein标记)]，由北京睿博兴科生物技术有限公司合成；Rsa I酶，NEB (北京)有限公司；高速离心机(H165-W)，湖南湘仪离心机仪器有限公司；基因扩增仪(EDC-810)，北京东胜创新生物科技有限公司；SB5200DT超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；SHB-III循环式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；Fast DNA SPIN Kit for Soil试剂盒、E.Z.N.A^TM Gel Extraction Kit试剂盒，美国MP公司；微孔滤膜(0.22 µm)，美国Millipore公司；基因分析仪3730 xl DNA analyzer，美国ABI公司。

样品采集于河北沙城某酿酒葡萄园，采用五点取样法取黏附在酿酒葡萄根系上的较大颗粒土，收集根系及黏附其上的土壤即为根围土，用无菌保鲜袋封装，放置于采样箱中，叶围与根围取样点植株对应，采摘酿酒葡萄植株中下部无病害绿色叶片，将采下的叶片与根系土样对应编号放置于保鲜袋中，带回实验室。

将收集的葡萄根围土样过80目筛，风干，称取约0.50 g，用DNA提取试剂盒提取总DNA；叶围称取约10 g，加入100 mL PBS (0.1 mol/L，pH 7.0)缓冲液，180 r/min涡旋振荡30 min后4 ℃超声15 min，采用微孔滤膜在真空抽滤装置中过滤，取出滤膜，剪碎放入灭菌离心管中，用DNA提取试剂盒提取总DNA。将提取的根围和叶围DNA Nano Drop测定浓度后冻存在−80 ℃，备用。

采用具有荧光标记的细菌通用引物27F/926R (引物27F的5′端用FAM标记)扩增7个不同白葡萄品种的根围、叶围微生物基因组DNA。50 μL PCR反应体系：DNA模板1 μL，正反向引物(10 μmol/L)各2 μL，dNTPs (2.5 μmol/L) 4 μL，10×Pyrobest buffer 5 μL，Pyrobest DNA polymerase (2.5 U/μL)0.3 μL，ddH₂O 35.7 μL。PCR反应条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。其中根围DNA在作为模板时稀释10倍后扩增，以防土壤中腐植酸等PCR抑制剂影响扩增效率。PCR产物用胶回收试剂盒纯化回收。纯化后的PCR产物用限制性内切酶Rsa I酶切，20 µL酶切体系：10倍酶切Buffer 2 µL，DNA模板约100−200 ng，混匀后加入酶(10 U/µL) 0.5 µL，用ddH₂O补齐至20 µL。酶切反应条件：37 ℃酶切3 h。

消化后的酶切产物取0.3 µL通过3 mol/L醋酸钠和95%乙醇沉淀，4 ℃、8 000×g离心20 min。加入0.5 µL GS1200LIZ内标和8.5 µL去离子甲酰胺，放入96孔板，经由95 ℃变性5 min后置于冰上，利用基因分析仪进行T-RFLP检测。

片段大小以及荧光强度使用软件GeneMarker (version 1.75)分析，根据峰面积定量T-RFs，舍去 < 50 bp以及 > 500 bp的片段以规避引物和片段大小测定的不确定性^[12]。细菌中相对丰度过小的末端限制性片段不会对群落的特征产生较为明显的影响^[13-14]，因此在分析过程中舍去相对丰度 < 1%的T-RFs。T-RFs谱图上的峰面积大小以及数量反映了微生物群落结构及其多样性。微生物的多样性指数计算采用^[15-17]方法：(1)物种丰富度指数S：即为物种的数目。(2) Simpson指数：D=1−∑P_i²，其中P_i为第i种占总个体数的比例，Simpson指数反映了物种的优势度。(3) Shannon-Wiener指数：H=−∑P_ilnP_i，Shannon指数反映样品的多样性程度，其值越高表明群落物种的多样性越高。(4)均匀度指数：J=−∑P_ilnP_i/lnS。以上各公式中，P_i=N_i/N，N_i为属i的单菌落数量，N为样品中的总单菌落数量。多样性指数采用Past 3.0，聚类分析采用Primer 6.0，其他数据分析利用origin 9.0和IBM SPSS Statistics 20统计软件分析，组间比较采用One-Way ANOVA，多重比较采用LSD检验。

采用T-RFLP技术对不同酿酒葡萄品种根围和叶围细菌DNA扩增产物进行酶切图谱分析，根围和叶围细菌分别检测到72.0−593.6 bp的优势片段15个和16个。根围T-RFs片段具体为72.0、73.3、74.6、91.5、103.7、114.8、118.1、419.4、421.3、448.7、453.6、455.2、475.2、482.6、593.6 bp。不同品种葡萄根围微生物优势菌群推测可能是74.6 bp的藤黄单胞菌属，在长相思(Sau)、米勒(Mul)、赛美蓉(Sem)、琼瑶浆(Tra)、白云霓(Ugn)、白诗南(Che)、白福尔(Fol)中的丰度百分比分别为52.18%、41.42%、34.14%、24.38%、22.12%、16.72%和12.47% (图 1A)。这些现象说明酿酒葡萄品种的根围具有较高的微生物群落多样性，同时在所有根围均发现419 bp的T-RFs片段，推测可能为肠杆菌属。

图 1　不同品种葡萄根围和叶围细菌T-RFs相对丰度百分比 Figure 1　The relative percent of rhizosphere and phyllosphere bacterial T-RFs in different wine grape cultivars

图选项

叶围T-RFs菌群片段具体为72.0、73.3、74.6、91.5、103.7、114.8、118.1、197.3、242.0、419.4、421.3、448.7、453.6、475.2、482.5、593.6 bp (图 1B)。由此推测，不同品种葡萄叶围微生物优势菌群可能为91.5 bp的弗兰克氏菌。在长相思、米勒、赛美蓉、琼瑶浆、白云霓、白诗南、白福尔中的丰度百分比分别为12.20%、21.20%、13.65%、62.21%、21.32%、29.33%、20.46% (图 1B)。弗兰克氏菌能与非豆科植物共生固氮，且具有根瘤菌所没有的自身防止固氮活性受氧损伤的独特机制^[18]。

每一个峰可作为一个OTU分析，同时根据图谱计算微生物群落结构多样性Shannon香农指数(H)、Simpson辛普森指数(D)、均匀度指数(J)。

利用限制性内切酶Rsa I对不同酿酒葡萄品种的细菌PCR产物酶切分析，多样性指数如下：根围Simpson指数大小顺序为白福尔 > 琼瑶浆 > 白诗南 > 赛美蓉 > 白云霓 > 米勒 > 长相思；Shannon指数最大的为白福尔，最小的为白云霓，这与Simpson指数基本一致。叶围Simpson指数最大的为白诗南，最小的为米勒，与Shannon指数基本一致(表 1)。

利用数据库MiCA (http://mica.ibest.uidaho.edu/)在线比对，得出部分T-RFs片段可能代表的类群。

对不同品种葡萄根围T-RFs定性分析得知，448.7 bp的片段为所有葡萄根围共有的T-RFs片段，根围所含T-RFs片段最多的葡萄品种为白诗南，主要为72.0、73.3、91.5、114.8、118.1、419.4、421.3、448.7、453.6、475.2、482.5、593.6 bp的T-RFs片段。含有细菌群落最少的为长相思，主要有73.3、91.5、114.8、419.4、448.7 bp的T-RFs片段(表 2)。

对不同品种叶围T-RFs片段定性分析可知，白云霓叶围所含的T-RFs片段最多。主要T-RFs片段为72.0、74.6、91.5、103.7、114.8、197.3、419.4、421.3、453.6 bp。米勒叶围所含的T-RFs最少，主要T-RFs片段72.0、91.5、103.7、118.1 bp (表 3)。

为研究不同品种葡萄之间的微生物群落演变，对不同微生物群落的Bray-Curtis相似性进行了计算，并依据Bray-Curtis相似性构建了系统进化树(Phylogenetic tree)和非度量多维标度(Nonmetric Multidimensional Scaling，NMDS)，根据系统进化树分析得知，根围细菌群落根据品种不同聚类，白诗南和长相思、米勒和赛美蓉、白云霓和琼瑶浆以及白福尔组成不同的微生物群落簇(图 2A、3A)。结合聚类结果分析可知，叶围细菌类群总的趋势和根围保持一致，NMDS表明不同品种其根围以及叶围的微生物群落组成有一定差异。细菌群落的NMDS分别在米勒和赛美蓉、白福尔和白诗南以及长相思中形成不同的微生物群落簇，以上这些结果表明不同品种的微生物群落在酿酒葡萄不同组织中发生了演变(图 2B、3B)。

图 2　不同品种酿酒葡萄根围细菌群落进化树及NMDS分析 Figure 2　The NMDS plot of Bacterial communlties phylogenetic tree on rhizosphere in different wine grape cultivars

图选项

图 3　不同品种酿酒葡萄叶围细菌群落进化树及NMDS分析 Figure 3　The NMDS plot of Bacterial Communlties phylogenetic tree on phyllosphere in different wine grape cultivars

图选项

研究酿酒葡萄根围、叶围微生物不仅可以揭示葡萄与微生物的生态关系，而且对开发利用有益的微生物也有重要意义^[8]。本研究应用T-RFLP技术分析了酿酒葡萄不同品种根围、叶围细菌群落结构，发现不同品种葡萄根围微生物优势T-RFs片段为91.5 bp，推测可能为变形菌门中的弗兰克氏菌，弗兰克氏菌能够与许多非豆科植物共生，固定空气中的氮，对于生态改良有着非常重要的应用前景，在所有酿酒葡萄根围均发现有419.4 bp的片段，推测可能为肠杆菌目中的肠杆菌属，肠杆菌通常位于肠道，但在果园生态系统发现，推测可能是该酿酒葡萄园施用了大量农家粪便造成的。叶围Simpson指数最大的为白诗南，最小的为米勒，与Shannon指数基本一致。生物多样性是衡量生态系统稳定和健康的重要指标，由于不同葡萄品种根系分泌物种类和数量的不同，必然导致品种间根区微生物群落结构多样性的差异。叶围微生物受到更多的紫外照射，温度波动、湿度变化^[19]，且叶围面临着营养不足的状况^[20-21]，这些环境的改变可能促进了微生物群落的多样性^[22-23]。国内外的研究资料表明，根围土壤提供微生物所需的大量碳源，包括氨基酸、有机酸和碳水化合物等^[24]，根围微生物种群与植物的健康状况关系密切，葡萄根围、叶围微生物数量、群落结构以及优势种群和种群结构多样性及变化规律受到葡萄品种、土壤类型、施肥、环境因素以及微生物相互作用的影响，这些影响因素对微生物具有改善生态条件的优势，还有待进一步研究。