杨尺蠖Apocheima cinerarius(Erschoff)又名春尺蠖，在分类上属鳞翅目(Lepidoptera)尺蛾科(Geometridae)，主要分布在中亚地区和我国的新疆、宁夏、甘肃、内蒙、山西、陕西、河北、河南、山东等广大地区，是危害我国三北地区防护林的一种暴食性食叶害虫，主要危害杨、榆、沙枣、沙柳、胡杨等^[1]。该虫一年发生一代，以蛹在林冠下表土层中越冬，早春成虫羽化，交尾产卵，春季树木发芽长叶，幼虫开始上树取食，直到5月下旬和6月上旬，幼虫老熟下树入土化蛹，越夏和越冬。蛹期在表土层内长达9个月。杨尺蠖幼虫取食期间的食量很大，虫口密度大时短时间就可将大面积林木的叶片吃光，造成树木长势衰弱和枯死。近年来，该虫在山西临汾地区连续暴发，使大面积的杨树丰产林在4、5月份叶片被全部吃光，危害十分严重。

以往对杨尺蠖的防治主要是在幼虫期采用树冠喷洒化学杀虫剂的方法，由于杨树等林木的树冠高大，喷药困难且污染严重。在生物防治方面曾有人利用飞机低容量喷雾苏云金杆菌(Bacillus thuringiesis, Bt)制剂和杨尺蠖核型多角体病毒(AciNPV)制剂进行杨尺蠖防治^[2-3]。但是，Bt的伴孢晶体易被紫外线杀死，加上北方地区春季空气干燥，飞机喷洒的雾化液滴极易在短时间内挥发而使Bt失去附着力与致病力。核型多角体病毒AciNPV制剂生产中的技术瓶颈是昆虫病毒的繁殖依赖活体幼虫，而杨尺蠖一年繁殖一代的特性极大限制了AciNPV的工厂化生产和林间大面积应用^[4]。

我们结合杨尺蠖幼虫老熟后下树入土化蛹，蛹在土壤中要经历漫长的越夏和越冬的生物学习性，选择采自桃小食心虫Carposina niponensis(Walsingham)、红松林帕克阿扁叶蜂Acantholyda parki(Shinohara & Byun)和松毛虫Dendrolimus kikuchii(Matsumura)幼虫的昆虫病原真菌球孢白僵菌(Beauveria bassiana)的3个菌株，在杨尺蠖的蛹期的前期、中期、后期分别进行感染试验，结果显示，3株白僵菌均能侵染杨尺蠖蛹，并对处于前期和中期的杨尺蠖蛹感染快，致死率高，3个菌株中以采自桃小食心虫的菌株TST05对杨尺蠖蛹的致死率最高，校正死亡率在70%以上。这为我们利用昆虫病原真菌作为生物制剂防治杨尺蠖提供了依据。由于以蛹为防治对象，在土壤中使用菌粉制剂，不仅可以避免化学防治的弊端，而且地下防治具有明显优势，它可以为真菌提供较稳定的温度和湿度环境，利于病原真菌在土壤中存活、萌发和持续感染^[5]。

用昆虫病原真菌防治害虫，不同的菌种和菌株对同一寄主昆虫的感染毒力常常不同，一般来说，来自原寄主的病原真菌比来自其他寄主的病原真菌对防治对象有更高的毒力。这不仅是病原真菌对昆虫进化的适应，也是病原真菌对昆虫发生地区的生态适应的结果。因此，收集林间自然感染的虫尸，分离获得自然侵染杨尺蠖蛹的病原真菌，是筛选高致病菌种，进行杨尺蠖生物防治的基础。我们2014年在山西省临汾地区洪洞县杨树丰产林，采集获得自然染病的杨尺蠖蛹，培养分离和纯化出一株病原真菌--粉棒束孢Isaria farinose(Homskiold) Fries，异名为粉质拟青霉Paecilomyces farinosus(Holm. Ex Gray) Brown & Smith，是一类重要的昆虫病原真菌。本文报道对该菌株分离、培养、形态观察和分子鉴定的结果。希望为利用昆虫病原真菌进行杨尺蠖蛹的生物防治提供菌种资源和应用依据。

1 材料与方法 1.1 虫体采集与病原真菌的分离纯化

杨尺蠖在山西洪洞县(N36°18′，E117°42′)杨树丰产林1年发生1代，老熟幼虫从5月中旬下树入土，在表土层内结土室化蛹越夏和越冬。在杨树丰产林树下表土层采集杨尺蠖虫蛹过程中，发现了自然染病的虫蛹，收集后带回实验室。

在实验室将有真菌感染的杨尺蠖蛹置于解剖镜下观察并拍照，然后在无菌工作台上用接种环挑取虫尸表面的分生孢子，划线接种于PDA固体培养基(g/L：马铃薯200，葡萄糖20，琼脂20)。25℃培养5 d，将培养后的菌株进行二次划线分离。

1.2 回接实验

取培养7 d的白色菌种分生孢子，配制成孢子悬浮液(1×10⁸ conidia/mL)，并加0.1%的吐温80，用浸虫法对杨尺蠖蛹进行接种感染，然后置于25℃培养室培养，每天观察虫体染菌情况。

1.3 病原菌形态特征的扫描电镜观察

将纯化得到的菌株划线接种于PDA培养基平板中，在超净工作台将无菌的盖玻片45角斜插于接种线上，每个平板3个盖玻片，25℃下培养。3 d后，用镊子将盖玻片取出，将有菌的盖玻片经过50% PBS缓冲液漂洗，30%、50%、70%、90%、100%乙醇梯度脱水，其中100%乙醇脱水2次，最后经50%乙酸异戊酯加50%无水乙醇，100%乙酸异戊酯2遍脱去无水乙醇，每个梯度10 min。EMS850临界点干燥器中干燥后，将样品摆好贴片，1.5 kV、20 mA下喷金，最后放入扫描电镜(JSM-840EX)下观察真菌形态结构并拍照记录。根据菌株形态特征，参考《山西虫生真菌》^[6]和《Manual of Techniques in Insect Pathology》^[7]对菌株物种的分类地位作初步鉴定。

1.4 病原真菌的分子鉴定

将纯化得到的菌株于PDA培养基上大量培养，然后用真菌DNA抽提试剂盒提取出目的菌株基因组DNA。用真菌ITS通用引物ITS4 (5′-TCCTC CGCTTATTGATATGC-3′)和ITS5 (5′-GGAAGTA AAAGTCGTAACAAGG-3′)，并以提取出的菌株YHT01基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR (50 μL)反应体系：36.5 μL去离子水，5 μL 10×Dream Taq Green Buffer，4 μL dNTP Mix (2.5 mmol/L each)，2 μL DNA模板，1 μL ITS4 (10 μmol/L)，1 μL ITS5 (10 μmol/L)，0.5 μL Easy Taq DNA Polymerase。PCR扩增条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，53℃ 1 min，72℃ 1 min，30个循环；65℃ 10 min。扩增后的PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，以100 bp DNA Marker指示分子量。扩增得到的ITS序列由上海生工公司进行序列测定。从GenBank中BLAST进行序列相似性搜索，并下载与该菌株序列相近的序列，使用MEGA 5.0选择邻接法Neighbor-Joining构建系统发育树，从而确定该菌株的分类地位。

2 结果与分析 2.1 自然罹病虫尸症状

从山西临汾洪洞丰产林中采集杨尺蠖蛹的自然染病虫体，在实验室解剖镜下观察发现，自然染菌的虫蛹(图 1)有的蛹僵硬且被白色菌丝覆盖，菌丝在蛹的结间处更多(图 1A、B)，有的蛹体外有子座长出(图 1B、C、D)。

2.2 菌株分离结果

经划线分离纯化，分离获得1株虫生真菌，经过回接，将与自然染病症状一致的虫生真菌命名为YHT01。

2.3 YHT01回接杀虫实验结果

将制备好的YHT01菌株孢子悬浮液(浓度为1×10⁸ conidia/mL)，对杨尺蠖蛹进行回接杀虫实验。接菌培养5 d后，在蛹的节间处生出白色菌丝(图 2A)，7 d后蛹的全身覆盖菌丝(图 2C)，与野外自然染菌的症状一致。说明分离得到的菌株是致死杨尺蠖蛹的致病菌。

2.4 菌种鉴定

2.4.1 菌株的培养性状及形态特征: 将菌株YHT01在PDA培养基上25℃恒温培养5 d后，发现菌落呈椭圆形，白色，絮状(图 3A)。菌落背面中央呈橙黄色(图 3B)。在扫描电镜下可以看出，菌株生长3 d后，已经开始大量产生分生孢子(Co)，孢梗束(Cr)呈扫帚状(图 3C)；瓶状小梗(Ph)基部膨大，上部逐渐变得细长，轮生或单生于分生孢子梗上。瓶状小梗直径0.4 μm−1.1 μm，长4.2 μm−13.1 μm (图 3D)；瓶状小梗出芽产生分生孢子，形成分生孢子链。出芽产生的分生孢子小，卵形至椭圆形，壁光滑，大小为(2.1−3.4) μm×(1.1−1.8) μm (图E和F)。根据以上形态观察结果，参考《山西虫生真菌》^[6]和《Manual of Techniques in Insect Pathology》^[7]，初步判断该菌株为棒束孢属IsariaPersoon的粉棒束孢I. farinosa。

2.4.2 DNA提取及ITS序列PCR扩增结果: 以ITS4和ITS5为引物进行PCR扩增，得到菌株YHT01的ITS序列并送交上海生工公司测序，得到585 bp的DNA序列。序列提交GenBank，并已开放，序列编号为KR973432。在ncbi上下载与YHT01的ITS序列有较高相似性的序列，构建系统发育树。如图 4所示，KR973432与粉棒束孢Isaria farinosus (AB233337)在同一分支上，相似性为99%。这与该菌株形态鉴定的结果相同，可知分离得到的YHT01菌株为粉棒束孢I.farinosus。 3 讨论

本研究从自然染菌的杨尺蠖上分离得到一株病原真菌，经形态学和分子鉴定，为粉棒束孢。ITS序列由于其易扩增、信息量丰富、研究广泛等诸多优势，已经成为被子植物和真菌的通用核心Barcoding^[8-9]。利用ITS序列对粉棒束孢乃至整个棒束孢属的研究已有报道^[10]。

Hodge等认为棒束孢Isaria Pers.:Fr.是优先发表的属，所以将粉棒束孢Isaria farinose(Holm: Fr) Fr.作为其模式种，并建议所有先前被归在拟青霉属Paecilomyces中拟棒束梗孢组sect. Isarioidea的种都应该用棒束孢作为属名。因此，先前常用的粉拟青霉P. farinosus(Holm. ex Gray) Brown & Smith的名字被当作粉棒束孢Isaria farinosa的异名来处理^[11]。

拟青霉Paecilomyces是一类在土壤中广泛存在的虫生真菌。根据我们的统计，从1981年−2015年，在我国发现的拟青霉主要有12种^[12-23]，如表 1所示，分别是斜链拟青霉P. cateniobliquus、环链拟青霉P. cateniannulatus、细脚拟青霉P. tenuipes、粉质拟青霉P. farinosus、玫烟色拟青霉P. fumosoroseus、蝙蝠蛾拟青霉P. hepiali、灰绿拟青霉P. grsieiviridsi、淡紫拟青霉P. lilacinus、黄拟青霉P. flavescens、古尼拟青霉P. gunnii、蛹草拟青霉P. militaris以及蒲同拟青霉P. puntonii。这些拟青霉的主要寄主有：鳞翅目昆虫21种，如茶小卷叶蛾Adoxophycsprivatana、茶卷叶蛾Cacoecia ingentana、云尺蛾Buzura thibetaria、银纹夜蛾Argyrogramma agnata等；半翅目昆虫9种，如棉蚜Aphis gossypii、荔枝椿象Tessaratoma papillosa、棉三点盲蝽Adelphocoristaeniophorus、斑背安缘蝽Anoplocnemis binotata、烟粉虱Bemisia tabaci和桑梢角蝉Gargara genistae；垫刃目1种，根结线虫Meloidogyne等；鞘翅目3种，分别是纵坑切梢小蠹Tomicus piniperda、大青象甲Chlorophanus grandis和七星瓢虫Coccinella septimpunctata。

粉棒束孢(粉质拟青霉)被广泛应用于害虫防治上。李捷等研究粉棒束孢对桃小食心虫的致病力，桃小食心虫感染粉棒束孢初期行动缓慢，死后虫体变软，全身变成褐色，1−2 d后体表长出白色絮状菌丝，菌丝逐渐布满全身，并产生孢子，第十天累积死亡率为72.22%，粉棒束孢的蛋白酶活性、几丁质酶活性和脂肪酶活性也相应的发生变化^[24]。Demirci等用粉棒束孢(悬浮液浓度为1×10⁸ spores/mL)感染桔粉蚧Planococcus citri的各龄期，一龄若虫的致死率达到78.71%，二龄若虫的致死率为84.1%，成虫的致死率为84.5%，改善温湿度之后，致死率增大，对各龄期的桔粉蚧起到了很好的防治效果^[25]。Castineiras等在一种粉蚧上分离出另外一种棒束孢属的真菌I. fumosorosea^[26]。Lacey等研究了I. fumosorosea对Aphelinus asychis的致死率，以及致死率与湿度间的关系^[27]。Parker等研究了粉棒束孢感染E. integriceps的致死率与孢子悬浮液浓度的关系^[28]。粉棒束孢除了是昆虫的病原菌外，还能防治蜘蛛^[29]。

虽然粉棒束孢已广泛应用于农林害虫的防治，但是有关杨尺蠖蛹病原真菌的报道还未多见。1990年，阿地力江等^[19]在新疆野外调查中，发现杨尺蠖蛹被真菌寄生的现象，并分离得到一株粉质拟青霉(粉棒束孢)。他们用体表接种和土壤接种两种方法感染了幼虫和蛹，结果表明两种方法对杨尺蠖幼虫和蛹发病都有较高的致病力。本研究得到的粉棒束孢活体菌株YHT01菌株分离自山西省临汾市洪洞县自然染病的杨尺蠖蛹虫尸，是首次在山西发现，为今后在土壤中防治杨尺蠖蛹提供了菌种资源。