海藻糖是由两个葡萄糖分子以α-1, 1-糖苷键相连的非还原性双糖，这种糖在自然界中广泛存在，植物、动物、真菌和细菌中均有发现。海藻糖具有抗压、抗干旱、抗高温、抗碱和抗渗透压作用，被广泛应用于食品、农业及生物技术领域。比如，海藻糖可为细胞提供保护层或稳定细胞，也可作为食品或化妆品的添加剂^[1]。同时，海藻糖还能够保护哺乳动物眼睛免受由干燥和氧化引起的干眼症的困扰^[2]。

麦芽寡糖基海藻糖合酶(Maltooligosyl trehalose synthase，MTSase)参与催化麦芽寡糖生成海藻糖，其反应主要是先由MTSase催化转糖基反应将麦芽寡糖的还原性末端由α-1, 4-糖苷键转化为α-1, 1-糖苷键，然后麦芽寡糖基海藻糖水解酶(Maltooligosyl trehalose hydrolase，MTHase)将麦芽寡糖末端的海藻糖切下，生成海藻糖和少两个葡萄糖分子的麦芽寡糖。Lama等首先报道了来源于嗜热微生物硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)的麦芽寡糖基海藻糖合酶系能够从淀粉中催化生成海藻糖^[3]。紧接着，许多科研工作者又从多种不同的古菌中克隆鉴定了这种麦芽寡糖基海藻糖合成酶系，如嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)和芝田硫化叶菌(Sulfolobus shibatae)^[4-5]。而且，分别编码MTSase和MTHase的基因能够融合在一起，并在大肠杆菌中进行表达，从而表现为一种双功能酶^[6]。另一方面，来源于嗜热菌Thermus caldophilus GK24的一种海藻糖合酶(Trehalose synthase)能够直接将麦芽糖转化为海藻糖^[7]，这一途径也是当前研究的热点之一。应用这种超嗜热性的酶生产海藻糖具有加快化学反应的进程，减少反应液中杂菌污染以及以淀粉为底物降低生产成本的的优越性^[8-10]。在本文中，我们克隆了来源于超嗜热古菌(Sulfolobus tokodaii strain 7)中编码麦芽寡糖基海藻糖合成酶的基因(ST0929)，并且以pET-15b为载体在大肠杆菌BL21细胞中表达，并鉴定了其酶学性质。本实验结果为将来在生物工程领域应用该嗜热酶来生产海藻糖提供了理论基础。

1 材料与方法 1.1 菌株、质粒、酶和药品

大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21-CodonPlus (DE3)-RIL和pET-15b质粒购自Novagen公司；限制性内切酶和其它分子生物学用酶均购自Takara公司；S. tokodaii strain 7麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因由北京中美泰和生物技术公司合成；亲和层析柱及填料购自美国GE Healthcare公司；麦芽五糖购自东京化学品公司；3, 5-二硝基水杨酸购自国药集团化学试剂有限公司；其余化学药品购自上海生工生物工程公司且为分析级。

1.2 MTSase基因的克隆和表达

根据在线密码子优化(Codon adaptation tool)软件(http://www.jcat.de/)对编码MTSase的基因ST0929 (BAB65941)进行适当密码子优化，设计引物：有义链5′-ATTGAACTCGAGATGAAGTTACTTTCAACCTATAG-3′，反义链5′-GCGAGGATCCTATTTAACAAGAATTAAAGGTAATTTATC-3′，下划线分别代表Xho I和BamH I酶切位点。PCR扩增条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 0.5 min，46 ℃ 32 s，72 ℃ 2.5 min，32个循环；72 ℃ 10 min。PCR得到的目的基因用Xho I和BamH I限制酶消化后克隆到pET-15b质粒上，将重组的质粒命名为pET-15b-ST0929，并通过DNA测序验证序列的正确性。将重组质粒转入大肠杆菌BL21细胞中，挑取单克隆于终浓度为100 mg/L氨苄青霉素和34 mg/L氯霉素的LB液体培养基(g/L，胰蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，氧化钠10.0，pH 7.0^[11])中培养过夜。培养过夜的细菌按1:100接种至新的LB培养基中，37 OD₆₀₀约0.5，加入终浓度0.2 mmol/L IPTG、16诱导完成后6 000 r/min离心15 min收集菌体细胞。

1.3 麦芽寡糖基海藻糖合酶的纯化

收集到的菌体在6 mL的破壁缓冲液(5 mmol/L咪唑，20 mmol/L磷酸钠缓冲液，0.5 mol/L的氯化钠，pH 7.4)中重悬，超声(200 W 15 min，超声5 s，间隔5 s)破碎细胞，4 ℃、10 000 r/min离心20 min，上清即为粗酶液，粗酶液先经过0.22 μm的滤膜过滤，接着进行亲和层析纯化，亲和层析首先用Binding buffer (20 mmol/L咪唑，20 mmol/L磷酸钠缓冲液，0.5 mol/L氯化钠，pH 7.4)平衡，最后用Elution buffer (200 mmol/L咪唑，20 mmol/L磷酸盐缓冲液，0.5 mol/L的氯化钠，pH 7.4)冲洗目的蛋白。SDS-PAGE检测目的蛋白，并用BSA法测其浓度^[12]。

1.4 酶活测定

该酶催化分子内的转糖基反应，将麦芽寡糖的还原性末端转化为非还原性末端，因此可检测反应体系中还原性糖含量的变化来指示酶活力的大小^[13]。标准条件下酶活测定体系为：50 mmol/L柠檬酸-磷酸缓冲液(pH 5.0)，0.1%的麦芽五糖和适量的酶液，总反应体系为1 ml。反应条件为75 ℃10 min。剩余的还原糖量用3, 5-二硝基水杨酸(DNS)法测定。以不同浓度的麦芽五糖绘制标准曲线，1 U酶活定义为每min转化1 μmol麦芽五糖所用的酶量。酶活性测定做3个平行，取平均值。酶活单位用U/mg表示。

1.5 最适温度和最适pH分析

将反应体系置于不同的温度梯度(55−95 ℃，间隔5 ℃)中反应，其它条件按标准方法测定。将温度梯度中所对应的最高酶活性定义为100% (0.46 U/mg)。

将反应体系置于不同的pH梯度(pH 4.0−9.0，间隔1.0)中反应，其它条件按标准方法测定。其中pH 4.0−5.0为柠檬酸-磷酸缓冲液；pH 6.0−7.0为磷酸钠缓冲液，pH 8.0−9.0为Tris-HCl缓冲液。将不同pH梯度所对应的最高酶活定义为100% (0.54 U/mg)。

1.6 温度稳定性和pH稳定性分析

将纯化的酶液(0.48 U/mg)置于不同的温度(75、85、95 ℃)条件下，孵育10 h。每2 h测定一次酶活，剩余酶活性在标准条件下测定。

将纯化的酶液(0.4 U/mg)置于不同的pH (pH 3.0.、4.0、10.0、11.0)条件下孵育10 h，每2 h测定一次酶活，剩余酶活性在标准条件下测定。

1.7 MTSase的底物特异性

以麦芽五糖、麦芽糊精、麦芽糖、壳寡糖为底物来测定MTSase的底物特异性。以上底物均具有还原性，因此可用DNS法测定。以上底物的终浓度均为0.1%。麦芽糊精是一种混合物，分子量大小不均一，因此可用加入酶与不加入酶反应体系的吸光度的变化来测定该酶是否能够利用麦芽糊精。除作用底物不同外，酶活测定方法与标准条件下的酶活性测定方法相同。

1.8 不同金属离子及一些添加物对酶活的影响

为探究不同金属离子对酶活性的影响，在标准反应体系中分别加入以下金属离子：K⁺、NH₄⁺、Ni²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Cu²⁺，终浓度10 mmol/L，75 ℃、pH 5.0反应10 min，测定酶活性。对照组为不加金属离子的粗酶液，粗酶液的酶活为0.53 U/mg。

为探究不同有机添加物对酶活性的影响，加入以下物质进行考察：甘露醇、山梨醇、EDTA、甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇和丙酮。其中甘露醇、山梨醇和EDTA的终浓度为10 mmol/L，甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇和丙酮的终浓度为10% (体积比)。75 ℃反应10 min，测定剩余酶活性。对照组为不加有机溶剂的粗酶液，粗酶液的酶活为0.53 U/mg。

2 结果与分析 2.1 MTSase基因的克隆

以S. tokodaii strain 7的麦芽寡糖基海藻糖合酶基因ST0929为模板进行PCR扩增，扩增结果如图 1所示。PCR扩增得到与预期大小相符的目的片段(2 115 bp)。ST0929基因的PCR产物用XhoI和BamH I酶切后连接到经同样双酶切的pET-15b上。连接产物转化E. coli DH5α，筛选重组质粒，并经双酶切及测序验证。测序验证正确后的重组质粒转入大肠杆菌BL21细胞中，表达重组蛋白，蛋白表达的SDS-PAGE电泳图如图 2所示。

2.2 序列比对分析

S. tokodaiistrain 7的麦芽寡糖基海藻糖合酶基因编码704个氨基酸，通过软件(http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html)计算其分子量大约为83.6 kD，pI值为5.93。这种古菌来源的MTSase与同样是古菌S. acidocaldarius(BAA11865)、S. solfataricus(BAA11008)、S. shibatae(AAM81591)、冰岛硫化叶菌(Sulfolobus islandicus) (ACP54490)来源的MTSase分别有54%、53%、53%和52%的相似性。Kobayashi等^[14]首先解析了来源于S. acidocaldarius的麦芽寡糖基海藻糖合酶的结构，并且提出了其可能的酶学催化机制。Kubota等^[15]进一步提出来源于S. acidocaldarius的MTSase中带有3个羧基的氨基酸残基D228、E255和D443对其酶的催化作用是密切相关的。相关学者通过计算机模拟的方法确定了来源于S. solfataricus ATCC 35092中的麦芽寡糖基海藻糖合酶中与底物结合和选择相关的残基是P402和A406^[16]。通过对以上物种来源的MTSase进行氨基酸序列比对，发现它们在催化位点处的序列是相当保守的，可以推断它们催化底物的机理是大致相同的。SignalP (www.cbs.dtu.dk/services/signalP)和THMHH (www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)软件对古菌S. tokodaii来源的MTSase进行序列分析，发现其没有信号肽和跨膜结构域，表明其是一种胞内蛋白。

2.3 最适温度与最适pH

从图 3A看出酶活性的最适温度为75 ℃。在50−95 ℃时，其剩余酶活性依然保留最高酶活性的60%。在60−90 ℃时，其剩余酶活性也能够达到其最适酶活性的80%。说明该酶是一种极端嗜热酶。从图 3B中看出，酶的最适pH为5.0。当pH为4.0时，酶活性非常低，只相当于最适酶活性的8%左右，表明该酶不适合在酸性条件下进行催化。当pH > 9.0时，其酶活性只相当于最适酶活性的20%。

2.4 温度稳定性与pH稳定性

将该酶置于75 ℃和85 ℃孵育10 h后，该酶的活性几乎没有变化。即使将该酶置于95 ℃的高温中孵育8 h，其酶活性也保留了最初酶活性的60% (图 4A)。这表明该酶具有较好的温度稳定性。

当将酶置于pH 10.0和pH 11.0的环境中孵育10 h后，该酶的活性几乎没有变化。此外，将酶放在pH 3.0和pH 4.0的环境中孵育10 h，其剩余酶活性也分别能够达到最初酶活性的65%和90% (图 4B)。这表明，该酶能够适应不同酸碱的环境条件。

2.5 MTSase的底物特异性

通过对麦芽五糖、麦芽糊精、麦芽糖和壳寡糖等底物的特异性研究，我们发现加入纯化的MTSase酶液后，与不加酶液的反应体系相比，麦芽五糖与麦芽糊精溶液的吸光度明显变小，而加入酶液后的麦芽糖和壳寡糖的吸光度与不加酶液的相比并没有明显的变化，表明古菌S. tokodaii来源的MTSase能够利用麦芽五糖和麦芽糊精，但不能利用麦芽糖和壳寡糖。

2.6 金属离子及一些添加物对酶活性的影响

通过实验发现，加入KCl、CaCl₂、ZnSO₄、EDTA、甘露醇对酶的活性没有影响，分别为最适酶活性的102%、106%、98%、98%、97%。(NH₄)₂SO₄的加入能够轻微抑制酶的活性，保留了最适酶活性的88%。MgSO₄、CuSO₄、NiSO₄的加入能够抑制酶的活性，分别保留了初始酶活性的62%、55%和30%。另一方面，该酶能够在一些有机添加物的存在下表现出一定的酶活力。有机溶剂甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇、正丁醇和山梨醇能够对酶活性有一定的抑制作用，分别保留最适酶活性的89%、59%、54%、71%、47%和91%。以上结果表明来源于S.tokodaii strain 7的MTSase能够在高浓度金属离子或者有机添加剂的存在下表现出一定的酶活性。不同金属离子及一些添加物对酶活性的影响如图 5所示。

3 讨论

在本研究中，我们从嗜热古菌S. tokodaiistrain 7中克隆表达了一种麦芽寡糖基海藻糖合酶，并鉴定了其酶学性质。我们分别对S. tokodaii、S. acidocaldarius、S. shibatae、S. solfataricus和Arthrobacter sp. Q36来源的MTSase进行了酶学性质的比较，酶学性质比较结果如表 1所示。

通过对不同物种来源的MTSase进行酶学性质比较，发现在最适反应温度方面，古菌S. tokodaii strain 7来源的MTSase与S. acidocaldarius、S. solfataricus来源的MTSase有相同的反应温度和pH，但比S. shibatae和Arthrobactersp.Q36来源的MTSase的最适反应温度分别高5 ℃和35 ℃。在热稳定性方面，S. tokodaii strain 7来源的MTSase在85 ℃孵育2 h，其酶活性几乎没有变化，即便是将此酶置于95 ℃中2 h，其剩余酶活性也保留了最初酶活性80%以上。相比而言，S. acidocaldarius来源的MTSase置于90 ℃中1 h，其酶活性就只保留了最初酶活性的70%，而S. shibatae、S. solfataricus来源的MTSase分别置于95 ℃和85 ℃中2 h后，其酶活性只有最初酶活性的40%和56%。Arthrobactersp. Q36来源的MTSase更是在60 ℃孵育2 h后，其酶活性完全丧失。这说明古菌S. tokodaii strain 7来源的MTSase的热稳定性是非常强的。在pH稳定性上，古菌S. tokodaii strain 7来源的MTSase比表 1中其它物种来源的MTSase具有更广的pH稳定性范围。在金属离子抑制方面，古菌S. tokodaiistrain 7来源的MTSase能够被Mg²⁺、Cu²⁺和Ni²⁺抑制，但不被Zn²⁺抑制。而S. solfataricus来源的MTSase能够被Cu²⁺和Zn²⁺抑制，Arthrobactersp. Q36来源的MTSase能够被Cu²⁺和Hg²⁺所抑制。综上所述，古菌S. tokodaii strain 7来源的MTSase具有良好的酶学性质。

在前期的蛋白原核表达过程中，经过诱导得到的酶蛋白全部以包涵体的形式存在或可溶性蛋白的表达量很低。通过尝试多种诱导条件，获得了部分可溶的酶蛋白。S. solfataricus来源的MTSase也部分以包涵体的形式存在^[18]。在接下来的工作中，可以通过尝试更换原核表达载体和包涵体复性的方法来增加可溶性蛋白的含量^[20]。但是，从另一方面讲，古菌S. tokodaii来源的MTSase与其它来源的MTSase相比，表现出了更好的酶学性质(表 1)。这主要体现在最适温度、温度稳定性和pH稳定性上。通过对以上5种来源的MTSase进行氨基酸序列比对，发现虽然古菌S. tokodaii来源的MTSase与其余4种来源的MTSase的氨基酸同源性只有50%以上，但是这5种来源的MTSase在催化位点处的序列是相当保守的，可以推断这种酶的催化机理是大致相同的。从酶学性质方面讲，哪些氨基酸决定了古菌S. tokodaii来源的MTSase具有如此酶学性质，尤其是在热稳定性方面表现出众的原因仍然是一个值得研究的方向。通过对底物特异性的研究发现，古菌S. tokodaii来源的MTSase不能利用麦芽糖、壳寡糖，但能利用低成本的麦芽糊精来生产海藻糖。总而言之，作为海藻糖合成途径中的一个关键酶^[19]，古菌S. tokodaiistrain 7来源的MTSase具有高最适温度，优良的温度稳定性和pH稳定性以及在酶法生产海藻糖的工业生产中提高反应速率、避免微生物污染的风险等优势^[10]，因此这种极端嗜热酶有望应用于生物工程领域生产海藻糖。