脂类代谢组学是在基因组学、转录组学和蛋白质组学之后兴起的一个重要研究领域，随着脂类分析技术的不断发展，对脂类的研究已经深入到生物膜的组成、结构及功能等方面。目前，生物膜脂的研究主要包括鞘脂类代谢组学和磷脂代谢组学^[1-2]。各种类型的鞘磷脂和鞘糖脂在生物体内大量存在，它们不仅是细胞膜结构的重要组成成分，还是一些信号分子的前体，参与神经递质的释放、膜蛋白的定位和运输、代谢物的转运、调节细胞的生长、分化、凋亡、衰老等生命活动^[3-4]。

AUR1基因(Aureobasidin A resistant gene)编码IPC合成酶，又称为短梗霉素A (AbA)抗性基因，是通过抗AbA的酵母突变体发现了AUR1基因。IPC合成酶在真菌的鞘脂合成途径中发挥重要的作用，它催化神经酰胺和磷脂酰肌醇生成肌醇磷脂酰神经酰胺(IPC)和甘油二酯，是鞘脂合成代谢的关键酶^[5](图 1)。已有大量的实验表明短梗霉素A通过抑制IPC合成酶抑制真菌和原生动物的生长，IPC合成酶受到抑制不仅导致神经酰胺积累，引起细胞周期进程阻滞，促使细胞凋亡，而且引起微管蛋白降解，细胞膜和内膜系统完整性破坏等一系列的细胞生长抑制情况，最终因不能合成复杂鞘脂类而导致细胞死亡^[6-7]，因此AUR1的表达和调控对真菌生长和发育具有至关重要的作用。本文通过研究灰葡萄孢菌及其抗AbA突变体BcAUR1基因序列与酶活性的关系，探讨IPC合成酶的结构与功能，为明确AUR1的调控和AbA的抗性机制提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 菌株和试剂

灰葡萄孢菌(B. cinerea)由浙江大学农业与生物技术学院李红叶教授实验室提供；大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α：本实验室保存；灰葡萄孢菌突变体(BcAUR1)由本实验室通过化学诱变剂EMS诱变，AbA筛选获得^[8]。

主要试剂：pMD18-T Vector、内切酶BamH Ⅰ、SalⅠ、Prime STAR HS DNA Polymerase、Taq DNA Polymerase、10 mmol/L dNTPs mix均购自Takara宝生物工程(大连)有限公司；DNA提取试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司；DNA胶回收试剂盒购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；快速质粒小提试剂盒购于北京康为世纪生物科技有限公司；C₆-NBD-cer (荧光的底物)和PI (磷脂酰肌醇)购自Matreya公司。

1.2 实验方法

1.2.1 灰葡萄孢菌AUR1基因的克隆: 分别接种化学诱变得到的6株抗AbA的灰葡萄孢菌突变体，28℃、150 r/min培养4 d至瓶中出现大量菌丝球。参照DNA提取试剂盒说明提取灰葡萄孢菌的总DNA。根据AUR1基因序列设计特异性引物F (5′-AGACGGGAGCGGCTACCCTTTTA-3′)和R (5′-CACCTAACAATGACCTCACTAAGC-3′)，PCR扩增体系：Buffer (Mg²⁺) 5 μL，dNTPs (2.5 mmol/L) 4 μL，正向引物(10 μmol/L) 1 μL，反向引物(10 μmol/L) 1 μL，DNA polymerase 0.6 μL，模板5 μL，补足ddH₂O至50 μL。反应条件：94℃；94℃，64℃，72℃，35个循环；72℃ 10min。取5 μL扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳分析、检测。回收PCR扩增产物(参照北京鼎国DNA胶回收试剂盒说明操作)。

1.2.2 目的基因的亚克隆及鉴定: 使用pMD18-T vector试剂盒，同时参照文献[9]进行感受态细胞的制备和连接产物的转化。在转化的平板培养基上随机选取3个边缘清晰的白色菌落，同上PCR体系条件进行菌落PCR电泳检测。参照快速质粒小提试剂盒说明提取质粒，电泳检测。提取的质粒用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ进行双酶切，反应体系(总体积20 μL)：10×Taq Buffer 2 μL，BamH Ⅰ 0.5 μL，Sal Ⅰ 0.5 μL，重组质粒5 μL，双蒸水12 μL。轻轻混匀，37℃酶切过夜，并进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 序列测定及分析: 将筛选出来的菌斑放大培养，提取质粒进行序列测定。比较抗AbA的灰葡萄孢菌突变体与野生型菌株之间的BcAUR1基因序列的差异。DNA测序由北京华大基因有限公司进行。测序结果在GenBank上进行Blast搜索比对，并用DNAMAN软件分析同源性。

1.2.4 IPC合成酶活力测定: 微粒体的制备IPC合成酶位于真菌的高尔基体膜上，采用超速离心可得到含IPC合成酶的微粒体蛋白。参照Burke等方法^[10]，取培养好的菌体抽滤，称重，加液氮迅速研磨至白色粉末，加入25 mL含0.1 mol/L NaCl，0.05 mol/L Tris-HCl (pH 8.0)，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L EGTA，1 mmol/L benzamidine，1 mmol/L PMSF，1.5 mg/L Leupeptin，3 mg/L pepstatin A的缓冲液中，4℃下2 000×g离心15 min。取上清，20 000×g离心15 min。取上清，100 000×g离心1 h，沉淀即为微粒体。将沉淀溶于400 μL含50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)、10%甘油、0.25 mol/L蔗糖、1 mol/L DTT的缓冲液中，轻轻混匀，Bradford法测定微粒体蛋白浓度。 IPC合成酶活性的测定IPC合成酶活性的测定参照Zhong等^[11]的方法进行，以pH 7.050 mmol/L的Tris-HCl、10 mmol/L EDTA、150 mmol/L NaCl、10%甘油和2 mmol/L CHAPS配制成反应缓冲液；向反应缓冲液中加入底物C₆-NBD-Cer (6-(N-(7-Nitro-2, 1, 3-benzoxadiazol-4-yl) amino)-hexanoylceramide，带荧光标记的神经酰胺)和PI (磷脂酰肌醇)，C₆-NBD-Cer的终浓度为0.1 mmol/L、PI终浓度为2 mmol/L，最后加入微粒体终浓度为0.1 mg/L。反应混合液50μL置于30℃水浴中20 min，加入10%的乙酸终止反应。12 000 r/min离心5 min，取10μL进行HPLC。色谱条件：C₁₈的反向色谱柱(15 cm×4.6 mm)，荧光波长：λ_ex=465 nm，λ_em=530 nm，流速1 mL/min，柱温：25℃，洗脱梯度50% CH₃CN-50% H₂O (0.1% CH₃COOH)到90% CH3CN-10% H₂O (0.1% CH₃COOH)，然后用100% CH₃CN洗柱10 min。以荧光底物C₆-NBD-Cer的减少量来计算IPC合成酶活力。IPC合成酶活力单位定义为：每分钟转化1微摩尔底物的酶量为1个活力单位。

1.2.5 神经酰胺的含量测定: 神经酰胺的提取参照周全等的方法^[12]进行，将灰葡萄孢菌菌丝用液氮研磨成粉末状，悬浮在4 mol/L NaOH中，52℃自溶24 h。粉末用无菌水洗，醋酸中和至pH 7.0，8 000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀加5 mL乙醇，室温振荡10 min，8 000 r/min离心10 min，收集沉淀。沉淀加氯仿׃甲醇׃水(1׃2׃0.8，体积比)，50℃保温4 h，离心收集沉淀，重复提取一次，合并2次提取液。提取液中再加入氯仿׃甲醇׃水的体积比例达到2׃2׃1.8，充分振荡，静置分层。收集氯仿相，即为含有神经酰胺的粗提液，粗提液真空干燥得到神经酰胺粗制品。神经酰胺含量测定采用苯甲酰化法^[13]，以C₂-Cer为标准品，在280 nm用酶标仪测定OD值。 2 结果与分析 2.1 灰葡萄孢菌突变体AUR1基因的克隆及鉴定

分别从6株通过化学诱变获得的灰葡萄孢菌突变体中提取基因组DNA，利用AUR1基因序列的特异引物，扩增得到约1 000 bp的电泳条带，与已知IPC合成酶基因序列大小一致，见图 2。6株突变体进行菌落PCR鉴定结果正确。

2.2 序列测定结果及分析

野生型灰葡萄孢菌的AUR1基因含1 135个核苷酸，其中第117位到231位是115 bp的内含子。6株灰葡萄孢菌突变体IPC合成酶基因与野生型序列比对，发现所有突变体均缺失了115 bp的内含子序列；突变体TA和突变体TF只缺失内含子，未发生氨基酸突变。突变体TB在IPC合成酶的中间区域有两个氨基酸突变即P155S和S177P，C端区域有一个氨基酸突变即F237L。突变体TC仅在IPC合成酶的中间区域一个氨基酸发生突变，即P155S。突变体TD和突变体TE都是N端区域有一个氨基酸突变V33A，见表 1。灰葡萄孢菌突变体IPC合成酶的氨基酸序列与酵母、烟曲霉和构巢曲霉比较发现，33位的氨基酸残基在它们之间各不相同；而155位的Pro和177位的Ser具有保守性；237位的氨基酸残基在烟曲霉和构巢曲霉是Leu，而酵母和灰葡萄孢菌分别是Val和Phe，由此得出IPC合成酶中间区域155位的Pro和177位的Ser是最保守的。

2.3 AbA对灰葡萄孢菌IPC合成酶的影响

以C₆-NBD-Cer和PI为底物，分别在不加AbA和加AbA的条件下，进行酶促反应，通过高效液相层析荧光光谱检测底物的减少量，计算得出IPC合成酶比活力，见表 2。野生型菌株在含有AbA和缺乏AbA时IPC合成酶比活力下降42.4%，说明AbA能抑制IPC合成酶活力。突变体在含有AbA和缺乏AbA时，酶的比活力下降幅度远小于野生型，在8.80%−0.35%之间，说明突变体对AbA产生了抗性。突变体中TC的AbA抗性最强，说明AUR1基因中缺失内含子和P155S的突变是产生AbA抗性的原因。TF的AbA抗性次之，可能AUR1基因中缺失内含子也是产生AbA抗性的一个因素。

2.4 AbA对神经酰胺的影响

神经酰胺是IPC合成酶的底物，IPC合成酶抑制会导致神经酰胺积累。野生型的神经酰胺的量在含有AbA时比不含AbA时增加了51%，如图 3所示，证实IPC合成酶抑制导致神经酰胺的积累。突变体细胞中神经酰胺的量在AbA存在时比AbA缺乏时略有增加，但差异不显著。表明突变体能抵抗AbA对IPC合成酶的抑制作用。

3 讨论

神经酰胺含量测定表明野生型IPC合成酶抑制，导致神经酰胺的积累，突变体能抵抗AbA对IPC合成酶的抑制作用。AUR1基因序列中内含子对IPC合成酶的调控起重要的作用，AbA通过抑制IPC合成酶引起神经酰胺积累，IPC合成酶是鞘脂代谢的关键酶。

先前的研究表明IPC合成酶中间区域的氨基酸序列是保守的，N端和C端保守性不高，保守区域中单个的氨基酸突变与AbA抗性相关^[14-15]。真菌AbA抗性的获得与IPC合成酶的少数氨基酸突变有关，酵母IPC合成酶158位苯丙氨酸被酪氨酸取代^[16]和构巢曲霉275位的甘氨酸被缬氨酸取代^[15]是获得AbA抗性的原因。我们的实验结果证实4种不同的抗AbA灰葡萄孢菌突变株AUR1基因中均缺失内含子，因此IPC合成酶基因序列不仅与保守区域氨基酸突变相关，而且与AUR1序列中缺失内含子相关；除了AUR1基因序列缺失内含子外，P155S的氨基酸突变与AbA抗性也有关系，这些结果不同于酵母和构巢曲霉。我们前期通过紫外诱变也获得了灰葡萄孢菌AUR1基因缺失内含子突变株^{[5, 11]}，证实了该突变株AUR1基因的内含子在抗AbA机制中发挥着重要的作用，是调控AUR1基因表达的重要元件。已有众多的研究表明一些内含子具有调控基因转录的功能，在其序列中发现了转录调控元件，起着启动、增强和抑制基因表达的作用^[17-19]。我们的实验也表明BcAUR1基因中内含子缺失突变株产生了AbA抗性，推测该内含子对BcAUR1基因表达起着抑制作用。

AbA能够抑制野生型IPC酶活力，而对突变体的酶活力影响较小，证实了AbA抑制IPC合成酶活力，突变体产生了AbA抗性。突变体TC在含有AbA和缺乏AbA时IPC酶活力受抑制的程度最小，AbA抗性强，也表明除了内含子缺失外，IPC合成酶的中间区域155位的保守氨基酸Pro对AbA抗性起一定作用。而TE对AbA的抗性相对较弱，可能与IPC合成酶N端区域的33位的Val不具保守性相关。综上所述以及我们先前的实验结果，均表明灰葡萄孢菌的IPC合成酶的表达与其基因内含子序列的调控相关，而与其氨基酸突变的位点和突变的氨基酸种类相关性较小。

灰葡萄孢菌在加入AbA比不加AbA时，神经酰胺的含量显著增加，表明了AbA能通过抑制IPC合成酶的活力而导致神经酰胺积累，而突变体在有AbA与无AbA时，神经酰胺的含量没有显著差异，证明了突变体能抵抗AbA对IPC合成酶的抑制作用。进一步证实了IPC合成酶表达对真菌生长、发育具有至关重要的作用，是鞘脂代谢途径的关键酶。