根际(rhizosphere)是根与土界面间很薄(不足1 mm到几毫米范围)的、受根系统影响极大的微区土壤^[1]。与临近的大量土壤相比，这个区域因植物渗出、分泌和根际分解作用而含多种多样的有机物质，营养丰富。这些有机物质可作为碳源和能源被细菌利用，使根际中微生物的活动非常活跃。根际也成为了与根有关细菌(常称为根际细菌)的“大本营”。在这些微生物中，对植物起积极影响和作用的为植物根际促生微生物(Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)^[2]。PGPR通过直接或间接的作用而促进植物的生长，其中固氮和产铁载体是PGPR重要的直接促生机制^[2]。

干旱、半干旱荒漠区面积约占全球陆地面积的30%，而灌木是这些地区的主要植被组成部分，它们在改善气候、防风固沙和水土保持等方面发挥着不可替代的生态功能^[3]。而在这些环境中，土壤N和Fe等含量低常是旱生灌木生长的重要限制性因子^[4]。具有产铁载体能力的固氮细菌可能对这些环境中的灌木生长有积极作用、对荒漠化生态系统的恢复和保护有重要的意义。

西鄂尔多斯为内蒙古西部荒漠化草原-草原化荒漠的生态环境脆弱带。该地区自然条件恶劣、土壤贫瘠，植被以多年生旱生灌木和小灌木为主，其中有四合木(Tetraena mongolica)、沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)和白刺(Nitraria tangutorum)，它们为强旱生、古老孑遗植物^[5]。由于该区处于荒漠地带，区域生态环境逐渐恶化，珍稀植物退化和减少，生物多样性和农牧业生产受到严重威胁^[6]。植物种类是根际微生物群落结构的决定性影响因素之一^[7]。四合木、沙冬青和白刺对干旱贫瘠的荒漠土壤环境有很好的适应性，或许其根际存在适应干旱荒漠环境、固氮能力较强的PGPR。但目前尚缺乏对西鄂尔多斯孑遗灌木植物根际固氮细菌的相关研究。

因此，本研究从西鄂尔多斯荒漠3种超旱生灌木植物的根际土壤中分离筛选固氮细菌，测定其固氮酶活性和产铁载体能力，以期为认识荒漠灌木根际固氮细菌多样性及其植物促生能力、理解荒漠植物对极端生境的适应机制、荒漠生态系统植被恢复与重建以及孑遗等灌木的有效保护提供理论依据和实践基础。

利用5点法于2014年9月中旬在西鄂尔多斯荒漠进行植物根际土采样，采集该地区3种孑遗灌木(四合木、沙冬青、白刺)根际土：首先将该区中等大小的植株根部大块土壤抖落，用无菌刷将附着在根表面的土壤刷下，放置于无菌塑料袋中，然后混合均匀，4 ℃保存，运回实验室，并在24 h内用于细菌分离。

称取0.5 g根际土样放于49.5 mL无菌水中，150 r/min振荡30 min，吸取上清进行梯度稀释。取稀释度为10^-4、10^-5、10^-6的土壤悬浮液100 μL，分别涂布到无氮的固体Ashby培养基^[8]，28 ℃培养4 d，挑选比较大、黏稠的菌落接种到无氮培养基上进行纯化，然后保存到斜面LB培养基^[9]、置于4 ℃作菌种短期保存之用。

用乙炔还原法对所分离的细菌进行固氮酶活性测定。挑取LB斜面培养基上的单菌落接种到Ashby固体培养基，置于28 ℃下进行活化培养；选择生长迅速(活化培养24 h菌落直径即可达到1 mm及以上)的菌株，分别挑取其不同菌株间菌落大小相近的单菌落、接种于体积为10 mL装有4.5 mL液体Ashby培养基的西林瓶中。在30 ℃、120 r/min培养24 h后，在无菌条件下(超净工作台中)将棉塞换成橡胶塞子，抽出10%的空气后注入10%的高纯乙炔。继续在同等条件下培养24 h后，用气相色谱仪(岛津LC-20)测定乙烯的生成量，以ARA (acetylene reduction activity)来反应固氮酶活性的大小，其单位为nmol C₂H₄/(H∙Culture)。每个菌株样品重复3次。按照文献[10]来计算ARA的大小。

ARA (nmol C₂H₄/(H∙Culture))=V_st×C_st×A_sa×V_tu/V_sa/A_st/H/22.4×10⁶

其中V_st为标准乙烯进样体积，C_st标准乙烯浓度，A_sa为乙烯峰面积，V_tu为西林瓶体积，V_sa表示样品进样体积，A_st表示标准乙烯峰面积，H表示培养时间。

对生长迅速、固氮能力较高的菌株进行产铁载体能力的测试和分析。从LB斜面培养基上挑取单菌落接种到CAS检测平板^[11]，对是否具有产铁载体能力的根际固氮细菌进行定性初筛，对晕圈直径(D)及菌落直径(d)进行测定并计算其比值，之后对筛选到的可产铁载体的菌株进行产铁载体能力的定量测定。定量测定方法参考Payne^[12]所述方法进行：将初筛得到的功能菌株接种到MSA^[13]液体培养基中，28 ℃、150 r /min培养48 h。将菌悬液6 000 r/min离心10 min，取上清液1.5 mL加入1.5 mL CAS检测液，充分混匀，于25 ℃下静置1 h，测定630 nm波长处的吸光值(A_s)，并取双蒸水作对照调零。另取1.5 mL CAS检测液与1.5 mL未接种的MSA液体培养基上清液充分混匀，同上测定吸光值即为参比值(A_r)。按照Payne^[12]对铁载体活性单位SU进行定义，依据计算结果对细菌产铁载体能力进行划分，A_s/A_r从1.0-0之间以0.2为间隔，每减小0.2增加一个+，一般产铁载体能力较高(+++)的细菌其A_s/A_r低于0.5^[14]。

16S rRNA基因扩增引物为细菌通用引物27F和1492R，扩增条件和体系组成参考Lane进行^[15]。nifH基因扩增引物、扩增条件和体系则参考Diallo等^[16]。扩增中使用大连宝生物rTaq酶及其缓冲体系。PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

测序所得16S rRNA基因序列以在线EzTaxon (http://www.ezbiocloud.net/eztaxon)进行菌株分类地位的初步确定，寻找相似性最高的模式种序列作为系统发育分析的参比序列；然后用MEGA 6.0软件中的Musle模块以默认参数进行多重序列比对，基于Maximum Composite Likelihood模型，用Neighbor-joining法构建系统发育进化树分析发育地位，重复验证数为1 000。

采集了西鄂尔多斯荒漠3种孑遗灌木的根际土壤，从中分离获得能在Ashby培养基上生长的细菌分离物共计22株。其中，来自沙冬青的9株、四合木的7株、白刺的6株。EzTaxon分析表明，此22株细菌的16S rRNA基因序列分别与现有相关模式菌株的相似性为98.64%-100%。固氮细菌分类类群组成(表 1)和系统发育分析(图 1)表明，此22株固氮细菌分属于厚壁菌门(Firmicutes，9%)、放线菌门(Actinobacteria，9%)和变形菌门(Proteobacteria，82%)；其中包括α-和γ-变形菌亚纲，它们分别占45.5%和36.4%；在属的分类水平上，分属于9个属，其中Psedumonas为优势属(27.27%)、其次为Ensifer和Ochrobactrum属(均分别占总菌数的18.18%)；而在种的分类水平上，分属于12个种，其中Pseudomonas hibiscicola (27.27%)和Ensifer melioti (18.18%)为优势种。而不同灌木间，所分离得到的固氮细菌类群组成差异明显。例如，四合木的优势菌属为Ensifer，比例高达42.85%；而在沙冬青和白刺根际土壤中的优势属均为Psedumonas (均各占33.33%)；Psedumonas和Ochrobactrum在3种灌木的根际土壤中都存在，而其余的属只发现于一种或两种灌木的根际土壤，例如Ensifer未从白刺分离到，而Bacillus只在沙冬青中分离到等。

图 1　固氮细菌基于16S rRNA基因的系统发育进化树 Figure 1　Phylogenetic tree based on 16S rRNA genes 注：括号中的序号代表序列GenBank登录号；分支点数字代表步长值；标尺代表序列间分歧度；以绿弯菌(Chloroflexus aggregans) 16S rRNA基因序列作为外群；菌株编号中的前两位数字06、05、03分别代表相应菌株分离自四合木、沙冬青和白刺. Note: Numbers in parentheses represent the sequences' accession number in GenBank; Numbers at the nodes indicate the bootstrap values on Neighbor-Joining analysis of 1 000 resampled date sets; Bar 0.05 represents sequence divergence; With Chloroflexus aggregans 16s rRNA gene sequences as out-group; Strain number in the first two digits of 06, 05, 03 represent the strains isolated from Tetraena mongolica, Ammopiptanthus mongolicus and Nitraria tangutorum, respectively.

图选项

研究发现22株固氮细菌中有10株生长迅速(在Ashby无氮培养基上培养24 h即可长出肉眼可见、明显的菌落)。它们分离自四合木、沙冬青和白刺的分别有4、4和3株。以这些菌株的细胞基因组为模板进行固氮酶nifH基因扩增，均扩增出了预期长度(320 bp)的片段；测序和序列分析表明，这些序列均为nifH基因，序列已提交GenBank (KU314402-KU314411)，进一步说明这些菌株为固氮细菌。对这些固氮菌株的ARA测定结果(表 2)分析表明，它们的ARA值介于871.71-3 383.09 nmol C₂H₄/(H∙Culture)之间；除分离自沙冬青和白刺的SN0501和SN0305菌株的固氮酶活性略低[约1 000 nmol C₂H₄/(H∙Culture)]，其余菌相对较高，特别是分离自沙冬青和白刺的SN0502和SN0304的固氮酶活性高于了3 000 nmol C₂H₄/(H∙Culture)。

生长于固体CAS培养基上的细菌分泌铁载体时会在菌落周围形成黄色晕圈，产生黄色晕圈越大产铁载体能力就越强。定性分析表明，10株固氮酶活性较高的菌株中有7株的菌落有明显的黄色晕圈；结合定量测定结果(表 3)的分析表明，这些菌株SU的范围为23%-64%，A_s/A_r值范围为0.35-0.79；菌株SN0603和SN0302产铁载体能力较高，它们的A_s/A_r值分别为0.39和0.36。

生物固氮在陆地生态系统中是一个非常重要的氮输入环节，它可以长期为植物提供氮营养^[17]。在营养贫瘠的荒漠土壤中，灌木根际细菌的生物固氮过程对于土壤氮量的提升起了非常重要的贡献，这也是灌木在荒漠中常形成“肥岛”的原因之一^[18]。植物种类和土壤性质是决定植物根际细菌菌群结构的重要因素之一^[7]，在干旱半干旱地区可能存在一些固氮能力较高的、有应用潜力的根际固氮细菌类群^[19]。

西鄂尔多斯荒漠年降雨量不足200 mm、蒸发量却高达2 500-3 000 mm，为干旱地区，孑遗灌木四合木、沙冬青和白刺为该地区主要建群植物。本研究发现在这些灌木根际土壤的可培养固氮细菌中，变形菌门(Proteobacteria)和假单胞菌属(Pseudomonas)类群成员的数量居多。而Kumar在印度Haryana干旱半干旱地区所分离得到的绝对优势门和属分别为Firmicutes门(80%)和Bacillus属。Bacillus在其它干旱和半干旱地区也被发现是优势固氮菌属^[20-22]，与本研究中Bacillus最高只占11.11%明显不同。在草地等生态系统中，植物种类大于土壤对固氮细菌类群结构的影响^{[19, 23]}。我们的研究结果中，不同灌木根际固氮细菌组成间差异明显，且明显不同于其它干旱半干旱地区的相关研究结果。这似乎也说明干旱地区灌木根际固氮细菌类群的主要决定因子也为植物种类，但这尚待进一步以不同土壤培养同一种灌木等研究来验证探讨。

本研究所分离到的固氮细菌中有10株在无氮的Asbay培养基上生长较为迅速，它们的固氮酶活性都比较高、最高可高达3 000 nmol C₂H₄/(H∙Culture)以上，显著高于从生长于环境良好的作物如水稻^[10]或杉木、杨树^[24]根际分离得到菌株的固氮能力。而Kumar等^[19]从干旱和半干旱地区分离得到固氮细菌的固氮酶活性也较高。说明干旱半干旱地区可能是高酶活固氮作用发生的重要场所。

Kloepper等^[25]很早就推测固氮细菌在根际和根表的优势生长可能与细菌高产铁载体分泌机制有关，而铁载体的产生对植物生长的良好促进效果已经被许多研究者所证实^[26-27]。产铁载体的菌株也表现出明显的抑制植物病原微生物的效果^[28]。也有研究表明，根际促生菌株只具有某一种生理活性时，对植物生长的促进效果较差或者极不显著。但是，当菌株同时具有两方面或者更多促生活性时，促生效果将很明显^[29]。

本研究中生长迅速、具有高固氮酶活性的菌株中，高达70%的菌株具有产铁载体的能力，其中43%的菌株产铁载体能力较高(级别在+++及以上)。这些结果表明，西鄂尔多斯高原荒漠可成为具有多种植物生长促进能力且能力较高的PGPR菌株的重要来源。

鄂尔多斯荒漠孑遗灌木植物根际固氮细菌类群多样，有植物差异性，包含多种高固氮酶活性和产铁载体能力的固氮细菌，具有作为良好的植物生长促进接种物的潜力，有望用于荒漠生态系统植被的恢复和重建。