聚β-羟基丁酸酯(poly-β-hydroxybutyricacid，PHB)是一种生物可降解材料，由多种微生物在碳氮比失衡的条件下作为自身的能源物质时所积累^[1-2]。由于PHB具有相对较低的溶解性和相对较大的摩尔质量，因此可以在细菌胞内大量存储而不影响胞内外的渗透压^[3]。PHB与传统的聚丙烯塑料有相似的材料学性质，还具有生物相容性和生物降解性等独特性质，在工业、农业、食品和环保等领域具有十分广阔的应用前景^[4-6]。目前PHB的生产方法主要采用微生物合成法，但其出发菌株产率较低，生产成本较高，是当前PHB生产和应用的瓶颈问题。硫酸二乙酯(DES)是一种诱变谱较为广泛的烷化剂，能与DNA中碱基的磷酸部分发生烷化作用，从而引起DNA复制时碱基错误配对而引起的突变^[7]。紫外诱变是微生物育种中最常用和最有效的诱变方法之一^[8]，核酸在波长254 nm处有最大吸收峰，而紫外诱变时常采用的波长为200-300 nm，这样阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起基因突变。目前采用紫外线和硫酸二乙酯复合诱变的方法获取高产PHB菌种还未见报道。本试验以实验室前期筛选获得的Pseudomonas koreensisPK3菌株为出发菌株，采用紫外线和硫酸二乙酯相结合的复合诱变方法进行多轮诱变，以期获得一株PHB产量高和遗传稳定好的突变菌株。

1 材料与方法 1.1 菌种

出发菌株：假单胞菌属Pseudomonas koreensis PK3^[9]菌株由实验室前期筛选所获得，以下称为PK3。

1.2 培养基

种子培养基^[10]和发酵培养基^[11]均来自相关文献。

筛选固体培养基(g/L)：发酵培养基+2%琼脂粉+尼罗蓝，培养基中尼罗蓝的终浓度为50 mg/L。

1.3 主要试剂

PHB标准品购自Sigma-Aldrich公司；尼罗蓝购自上海生物科技有限公司。

1.4 菌体生长曲线的测定

将菌株接种于种子培养基上，32 °C恒温摇床中150 r/min培养24 h，然后按5%接种于液体种子培养基培养，培养18 h，每隔2 h用紫外分光光度法测定波长为620 nm下的OD值，计算菌株生长情况。

1.5 菌悬液的制备

将菌种活化后，接种于装有100 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，于32 °C、150 r/min培养8 h后，吸取5 mL培养液，加入装有45 mL生理盐水和玻璃珠的三角瓶振荡20 min，使菌体得到充分搅拌。采用血球计数板检测菌体浓度，使其为10⁷-10⁸个/mL。

1.6 紫外诱变育种

将稀释好的菌液各取10 mL放入10个无菌培养皿中，依次放置于距15 W紫外灯30 cm照射，时间分别为0、10、20、30、40、50、60、70和80 s (做3组平行样)。在暗光环境下，分别取经紫外线诱变的菌悬液0.2 mL涂布于10个含有尼罗蓝的固体平板培养基上，倒置于32 °C恒温培养箱中避光培养48 h。培养好的菌种在紫外透射仪下观察菌落情况，计算致死率。通过致死率选取合适的诱变时间的菌悬液，涂布在有尼罗蓝的固体培养基上，挑取具有荧光且菌落较大的菌株20个，用试管斜面培养保存，同时取对应的菌株接入含100 mL发酵培养基的250 mL摇瓶中，置于32 °C、150 r/min培养28 h后，测定PHB产量和PHB所占细胞干重的量。

1.7 硫酸乙酯(DES)诱变

以紫外线诱变所得产PHB高的菌株作为出发菌株，进行硫酸二乙酯诱变。取5 mL菌悬液 20份，与浓度为2%的DES溶液5 mL混合，在32 °C振荡处理，分别振荡处理0、10、20、30、40、50、60、70和80 min，最后加入1 mL 25%硫代硫酸钠溶液中止反应。将诱变处理的菌液稀释到10^-5，以未经化学诱变处理的出发菌为对照，在32 °C恒温培养箱中培养48 h。将培养好的平板取出，菌落计数，计算致死率。挑取具有荧光且菌落较大的菌株20个，用试管斜面培养保存，同时取对应的菌株接入含100 mL培养基的250 mL摇瓶中，置于32 °C、150 r/min培养28 h后，测定PHB产量和PHB所占细胞干重的量。

1.8 致死率计算

诱变菌株致死率(%)=(未诱变平板菌落数-诱变后平板菌落数)/未诱变平板菌落数×100。

1.9 遗传突变菌株稳定性试验

将经过紫外线和DES复合诱变筛选出的PHB产量最高的菌株连续9代传代培养后，测定PHB产量和PHB所占细胞干重的量。

1.10 PHB的测定

通过超声破碎机对细胞破碎处理，条件为：功率600 W，工作时间5 s，间隔时间5 s，连续20次。然后在8 000×g条件下离心10 min，去上清，烘干菌体，取10 mg干菌体，加入5 mL氯仿溶液，60 °C水浴1 h，获得含PHB的抽提溶液。然后吸取0.5 mL的抽提溶液于试管中，80 °C水浴加热除去氯仿，然后加入10 mL浓硫酸，密封试管后置于100 °C水浴加热10 min，冷却至室温，采用紫外分光光度计在235 nm处测定溶液的OD值。

1.11 胞内产物定性分析

分别称取10 mg菌粉、PHB标品于两个试管中，向每个试管中加入1 mL氯仿和1 mL酸化甲醇(含3%浓硫酸，体积比)，密封试管，放置于100 °C水浴中加热4 h，然后冷却至室温，加入1 mL蒸馏水充分振荡后，转移到5 mL离心管中，5 000 r/min离心5 min，下层即为溶有胞内产物的氯仿相，进行气相色谱分析。气相色谱条件：3.5% PEGA，柱长为2 m，以氮气作为载体，流速为40 mL/min，进样器温度为200 °C，FID检测器温度为250 °C，柱温80 °C维持2 min，然后以20 °C/min升高至195 °C，维持3 min。

2 结果与分析 2.1 菌体生长曲线的绘制

2环新鲜活化斜面菌种Pseudomonas koreensis PK3接种到种子培养基中，在培养温度32 °C条件下，180 r/min振荡培养16-18 h，然后接菌量5%移入新鲜发酵培养基中培养，每隔2 h用紫外分光光度法测波长为620 nm下的OD值，绘出菌体的生长曲线，如图 1所示。

选用对数生长中后期的细菌细胞进行诱变处理，此时的细胞不但菌浓合适、生理状态同步，而且绝大多数细胞对理化因素敏感，有利于诱变的作用。由图 1可看出，Pseudomonas koreensisPK3在培养2 h后开始进入对数生长期，在培养12 h后达到对数生长末期，因此选取培养10 h的菌体来进行诱变处理。

2.2 诱变条件的选择

2.2.1 紫外诱变：测定紫外线的不同照射时间对出发菌株致死率的影响，结果如图 2所示。

根据图 2所示结果可以看出，出发菌株对紫外线比较敏感，致死率与紫外线照射时间呈正相关。用诱变剂处理菌株后，只有当致死率达到70%左右时得到的突变株才能满足诱变筛选的条件^[12]。本研究中，对菌种PK3紫外线照射时间为60 s时，致死率为75%。所以，将紫外诱变60 s的菌悬液涂布在含有尼罗蓝固体培养基上，在32 °C条件下培养48 h。由于在筛选培养基中添加尼罗蓝染料，当细菌生长时，尼罗蓝能透过细胞壁进入细胞体内，并能特异性地与胞内的PHB结合，在365 nm紫外灯照射下产生橙红色荧光。因此，通过在含有尼罗蓝的固体培养基中上挑选菌落较大、橙红色荧光较强的菌落，作为诱变后正向突变的菌株。本研究中挑取具有荧光且菌落较大的菌株20个，接入含100 mL发酵培养基的摇瓶中，置于32 °C、150 r/min培养28 h后，测定PHB产量和PHB所占细胞干重的量。见表 1。

从表 1可以看出，紫外诱变对菌种诱变效果较好，诱变所得到的20个菌株与出发菌株相比，PHB产量和PHB所占细胞的干重都明显提高。其中UV-14的PHB产量达到13.75 g/L，PHB所占细胞的干重达到65.41%。所以，选择UV-14作为DES诱变的出发菌株。

2.2.2 DES诱变：实验采用终浓度为1% (体积比)的DES于37 °C进行诱变处理，DES诱变时间与致死率的关系如图 3所示。

从图 3可以看出，用DES诱变30 min时细胞致死率为72%。所以选择诱变3.0 min的菌悬液涂布在含有尼罗蓝的固体培养基上，在32 °C条件下培养48 h，挑取具有荧光且菌落较大的菌株20个，接入液体培养基中，置于32 °C、150 r/min培养 28 h后，测定PHB产量和PHB所占细胞干重的量。结果如表 2所示。

从表 2中可以看出，经DES诱变后的菌株PHB产量和PHB所占细胞干重都明显提高。其中UVCN-18的PHB产量可达到16.03 g/L，PHB占细胞干重达69.59%。

2.3 菌种遗传稳定性及稳产试验

将菌株UVCN-18在种子培养基固体斜面上连续转接9次，测定其遗传标记与PHB产量情况，结果见表 3。

从表 3中可以看出，UVCN-18的遗传稳定，连续传代9次后的PHB产量和PHB所占细胞干重分别为15.94 g/L和69.54%。对菌种PK3采用紫外诱变法和硫酸二乙酯复合诱变，并没有影响菌种正常生理生长，可能产生突变的PHB合成关键酶的相关基因遗传稳定，所以诱变后的菌种PHB的产量没有下降。

2.4 产物鉴定结果

采用气相色谱法对菌种UVCN-18的胞内产物进行定性分析，PHB标品结果如图 4所示，样品结果如图 5所示。

通过气相色谱图可以看出，通过氯仿抽提获得的胞内产物和PHB标准品的校正保留时间均为1.854，完全一致，应为同一物质，所以确定UVCN-18菌种能积累PHB。

3 讨论

本研究采用紫外线和硫酸二乙酯复合诱变选育PHB高产菌株，从研究结果来看，紫外线和DES对该菌种的致死率较高。当用紫外照射60 s时，对菌种的致死率就达到75%；DES诱变30 min时，对菌种的致死率达到72%。最终获得的突变体UVCN-18连续转接9次后，平均可积累PHB产量达15.94 g/L，占细胞干重69.54%，较原出发菌株Pseudomonas koreensisPK3 (4.42 g/L)提高了2.61倍。在近几年的报道中可以看出，对于从野外筛选获得的产PHB菌株，直接用于发酵生产PHB，所获得的PHB产量相对较少。在2013年，董静^[13]在土壤中筛选获得的甲烷氧化混合菌，在供氧条件下，培养基丰富的条件下培养5 d，然后饥饿培养15 d，PHB含量可以达到细胞干重的35.5%。在2014年，Han等^[14]从绿藻中分理出一株产PHB的菌株UMI-21，在以淀粉为碳源时合成PHB可达细胞干质量的45.5%。以前也有人采用转基因植物来合成PHB，John等^[15]将产PHB的关键基因与棉花纤维特异启动子相连构建了表达载体，导入棉花植物中，在纤维成熟时积累PHB水平为30-3 440 μg/g干纤维。但当PHB积累时会抑制植物生长，所以目前转基因合成PHB依然没有大规模应用。也有人利用活性污泥来合成PHB，但由于活性污泥环境中杂菌较多，导致合成的PHB纯度低，所以对PHB的分离提纯很困难。采用诱变的方法选育高产PHB菌株，不仅成本低、操作简单，而且所选育的菌种PHB产量高、遗传稳定。

近年来，采用紫外线和硫酸二乙酯复合对菌种诱变的报道较多，在2012年，罗跃中等^[16]曾经利用紫外线与硫酸二乙酯复合诱变，选育出一株遗传稳定的高效油脂降解菌株，其脂肪酶活性为14.85 U/mL，比出发菌株提高了15.2%；在2012年，张卫兵等^[17]利用紫外线与硫酸二乙酯复合诱变，筛选获得一株凝乳活力较高且水解活力较低的突变株DES-6，其凝乳活力为184.65 SU/mL，比原菌株增加了15.41%，水解活力为23.35 U/mL，比原菌株降低了64.80%。可见紫外线和硫酸二乙酯复合对菌种诱变效果显著，其主要原因在于这两种诱变方式均能使细胞中的遗传物质DNA发生突变，硫酸二乙酯是一种诱变谱较为广泛的烷化剂，能与DNA中碱基的磷酸部分发生烷化作用，从而引起DNA复制时碱基错误配对而引起的突变。在产PHB的菌种中，PHB聚合酶是PHB合成过程中的关键酶。DES可能导致编码PHB聚合酶的基因phbC发生突变，影响了PHB聚合酶的活性中心位置，使其酶活性提高，加快了对PHB合成所需的前体物质(R)-3-羟基丁酰辅酶A的聚合速度，进而提高了胞内的PHB积累量。对于确定诱变处理合成PHB相关基因的影响，还需通过分子生物学手段进一步探讨。

4 结论

(1) 通过气相色谱检测，诱变后的菌株依然能够在胞内积累PHB。并且采用紫外诱变法和硫酸二乙酯复合诱变出发菌株Pseudomonas koreensis PK3，筛选获得PHB产量较高且遗传稳定性好的菌株Pseudomonas koreensisUVCN-18，UVCN-18的PHB产量可达到16.03 g/L，PHB占细胞干重达69.59%。

(2) 将菌株Pseudomonas koreensisUVCN-18连续转接9次后，经摇瓶培养，在转速180 r/min、初始pH 7.6、接菌量5%，温度为32 °C，发酵28 h条件下，平均可积累PHB产量达15.94 g/L，占细胞干重69.54%。较原出发菌株Pseudomonas koreensis PK3 (4.42 g/L)提高了2.61倍。该突变菌株具有良好的遗传稳定性。