金针菇Flammulina velutipes (Fr.) Singer，是目前我国人均消费量最多的菌菇之一，是世界上著名的药食两用菌，具有较高的营养价值和药用价值^[1]。金针菇中含有蛋白质、脂肪、粗纤维、多种维生素、胡萝卜素等有益成分，其中氨基酸的含量非常丰富，孙宇峰等从金针菇中检测出18种氨基酸，人体所必需的8种氨基酸占总量的44.5%，高于一般的菇类^[2]，尤其是赖氨酸的含量特别高。高含量的赖氨酸能促进儿童生长发育、增强记忆、提高智力。在日本，金针菇是儿童保健和智力开发的必需食品，被称之为“增智菇”。

L-赖氨酸(L-lysine)的生物合成在不同生物体内有完全不同的两条途径。大多数细菌和绿色植物的L-赖氨酸的合成是通过L-天冬氨酸为起始物的二氨基庚二酸途径(DAP途径)。真菌、眼虫以及少数细菌则是以α-酮戊二酸(α-Ketoglutarate)为起始物的氨基己二酸途径(α-Aminoadipate pathway，AAA途径)^[3-4]。

氨基己二酸途径是谷氨酸族氨基酸合成途径中的一部分^[5]。该途径通过7个中间产物8个酶促反应生成L-赖氨酸^[6]。α-酮戊二酸有5个碳原子，而赖氨酸有6个碳原子。因此α-酮戊二酸形成赖氨酸需延长碳链。第一步是α-酮戊二酸在高柠檬酸合酶(Homocitra te synthase，HCS)的催化下，与乙酰辅酶A作用，形成高柠檬酸。高柠檬酸在高柠檬酸脱水酶(Homocitrate dehydratase，HCD)催化下脱水形成顺-高乌头酸(cis-Homoaconitate)，后者再由高乌头酸水合酶(Homoaconitate hydratase，HAH)催化形成高异柠檬酸(Homoisocitrate)，然后在高异柠檬酸脱氢酶(Homoisocitrate dehydrogenase，HIDH)催化下，形成α-酮己二酸(α-Ketoadipate)，该反应所需辅酶为NAD⁺，反应过程中脱去羧基。

α-酮己二酸的形成提供了L-赖氨酸的碳骨架结构，随后α-酮己二酸在氨基己二酸转氨酶(Aminoadipate aminotransferase，AAT)作用下，以谷氨酸为底物生成α-氨基己二酸和α-酮戊二酸。α-氨基己二酸在其还原酶(Aminoadipate reductase，AAR)的催化下，形成α-氨基己二酸-δ-半醛(α-Aminoadipate-δ-semialdehyde)。己醛基团一旦形成，在α-氨基己二酸-δ-半醛-谷氨酸还原酶(即酵母氨酸还原酶，Saccharopine reductase，SDR)作用下，即与谷氨酸在氨基部位缩合，形成酵母氨酸(Saccharopine)。酵母氨酸在酵母氨酸脱氢酶[Saccharopine dehydrogenase (NAD⁺，L-lysine- forming)，SDH]作用下，氧化裂解形成L-赖氨酸。

赖氨酸作为人类第一限制性氨基酸在金针菇中含量甚高，这已经被很多科学家证实，然而迄今为止很少有关于金针菇赖氨酸合成途径及相关基因的报道^[7]。本研究基于金针菇的全基因组序列，构建了金针菇中L-赖氨酸的从头合成途径，分析了该途径中的关键酶基因，对关键基因进行了理化性质研究以及生物信息学分析。结果表明金针菇是通过α-氨基己二酸途径合成赖氨酸，金针菇基因组中预测到该途径中几乎所有的酶。

1 材料与方法 1.1 供试菌株

金针菇(Flammulina velutipes)单核菌株Dan3由上海市农业科学院食用菌所良种创新与繁育研究室保存并提供。

1.2 基因组测序

基因组测序由上海市农业科学院食用菌所良种创新与繁育研究室委托上海美吉生物医药科技有限公司完成。测序采用Illumina Hiseq2000和Roche454 FLX+两种方法完成。同时委托该公司对测序数据进行了原始数据统计、基因组组装、基因预测、基因功能注释等。基因预测利用AUGUSTUS (version 2.3.1)软件。将预测基因的蛋白序列分别与Nr、Genes、String、GO、Swiss-port和Uniprot数据库进行blastp比对(BLAST 2.2.24+)，从而获得预测基因的注释信息。

1.3 L-赖氨酸合成途径基因的筛选

以KEGG公布的赖氨酸生物合成途径(Lysine biosynthesis，map00300)为研究基础^[8]，从这些合成途径上筛选金针菇中赖氨酸生物合成关键基因。

1.4 L-赖氨酸合成途径关键基因的重预测

将筛选到的基因序列分别向上游和下游各延伸5 kb，利用Softberry网站提供的FGENESH在线软件^[9]，以Laccaria(generic)为模板，进行基因重预测并得到相应基因的一级结构。将得到的氨基酸序列与NCBI Nr数据库再次进行blastp比对，从而确证该基因的注释信息，保证后续研究的准确性。

1.5 L-赖氨酸合成途径关键基因的生物信息学分析

利用Protparam分析了预测的蛋白基本理化性质^[10]；使用TargetP 1.1 Server (http://www.cbs.dtu. dk/services/TargetP/)预测其亚细胞定位；利用SOPMA预测了基因编码蛋白的二级结构^[11]。

2 结果与分析 2.1 基因组测序

用Illumina Hiseq2000和Roche454 FLX+ 两种方法获得原始数据后，首先，利用Newbler v2.8对454 Shotgun文库进行基于overlap的拼接，获得contig序列，把这些contig作为长序列，加上Illumina修剪后的PE (paired-end)和MP (mate-pair)数据，用软件Velvet 1.2.07选择多个不同的Kmer参数进行组合拼接，得到最优的组装结果。其次，运用GapCloser软件对组装结果进行局部内洞填充和碱基校正。

拼接组装后，金针菇单孢菌株Dan3基因组大小总计为34.17 Mb，153个Scaffolds。共预测到 12 351个基因，基因总长22 862 927 bp，预测基因长度占基因组比例为62.55%，平均长度为1 851 bp。

2.2 L-赖氨酸合成途径关键基因筛选

运用BLAST算法(blastx/blastp 2.2.24+)将所获得的预测基因与KEGG的基因数据库 (Genes)进行比对，根据比对得到的KO编号可以获得相应基因参与的具体生物学通路。Dan3基因组中有3 075个基因被注释到KO条目，占总基因数的24.90%，涉及KEGG数据库中287个Pathway。与L-赖氨酸合成途径(map00300)相关的基因共有 11个(图 1)，其中DAP途径只预测到3个基因：天冬氨酸激酶(Aspartate kinase，EC2.7.2.4)、天冬氨酸半醛脱氢酶(Aspartate-semialdehyde dehydrogenase，EC1.2.1.11)和高丝氨酸脱氢酶(Aomoserine dehydrogenase，EC1.1.1.30)。而该途径中其它大部分酶并没有被预测到。由此可知，正如前人的研究报道一样，属于真菌的金针菇中并不存在DAP途径。而AAA途径中预测到了8个酶的存在(图 1，表 1)，由此证明金针菇中L-赖氨酸的生物合成是通过AAA途径。我们构建了如图 2所示的金针菇L-赖氨酸生物合成途径。

2.3 金针菇赖氨酸合成途径关键基因的生物信息学分析

2.3.1 高柠檬酸合酶：HCS参与α-氨基己二酸途径的第一步反应，催化α-酮戊二酸和乙酰辅酶A缩合形成高柠檬酸，该反应被认为是α-氨基己二酸途径的关键限速步骤^[12]。HCS的活性在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)中已经被深入研究^[13-14]。金针菇基因组中，gene1846被预测为HCS。通过分析，其序列一级结构特征如图 3，DNA全长1 793 bp，包括7个内含子8个外显子，ORF全长1 395 bp，编码464个氨基酸，分子量为50.70 kD，理论等电点为5.78。结构域分析显示该蛋白属于酵母LYS21家族(图 4A)，蛋白序列与陶兰柱担菌Cylindrobasidium torrendii的HCS (Accession No. KIY62754)相似性最高，达92%。二级结构预测显示(图 4A)，该段序列含有较高比例的α-螺旋(45.26%)和无规则卷曲(29.96%)。亚细胞定位预测该蛋白没有信号肽，这与S. cerevisiae中的HCS酶不同，后者的HCS属于线粒体酶^[12]。

2.3.2 高乌头酸水合酶：HAH催化顺-高乌头酸结合一个水分子形成高异柠檬酸。在S. cerevisiae中由LYS4基因编码^[15]，是一个线粒体酶，受赖氨酸和谷氨酸的调控抑制。该酶的催化机制至今尚不明确，有可能与顺乌头酸酶相似^[16]。金针菇基因组中，gene1049被预测为HAH，其一级结构特征见图 3，序列全长2 161 bp，包括1个内含子2个外显子，ORF全长2 112 bp，编码703个氨基酸，分子量为74.90 kD，理论等电点5.75。结构域分析显示该蛋白属于顺乌头酸酶家族(Aconitase superfamily，图 4B)，蛋白序列与C. torrendii的HAH (Accession No. KIY68848)相似性最高，达82%。二级结构预测显示(图 4B)，该段序列含有较高比例的α-螺旋(32.43%)和无规则卷曲(34.85%)。亚细胞定位预测其定位于线粒体(表 2)。

2.3.3 高异柠檬酸脱氢酶：HIDH催化高异柠檬酸生成α-酮己二酸，为L-赖氨酸合成提供碳骨架结构。金针菇基因组中，gene4911预测为HIDH，一级结构特征显示(图 3)，其序列全长1 536 bp，包含8个内含子9个外显子，ORF全长1 044 bp，编码347个氨基酸，分子量为37.32 kD，理论等电点5.80。结构域分析显示该蛋白属于异柠檬酸脱氢酶家族(Iso-dh superfamily，图 4C)，蛋白序列与C. torrendii的HIDH (Accession No. KIY69758)相似性最高，达79%。二级结构显示(图 4C)，该段序列具有较高的α-螺旋(47.84%)和无规则卷曲(39.68%)。亚细胞定位预测其定位于线粒体(表 2)。

2.3.4 氨基己二酸转氨酶： AAT是一个依赖于 5′-磷酸吡哆醛(Pyridoxal 5′-phosphate)的酶(PLP-dependent enzyme)，它负责催化α-酮己二酸生成α-氨基己二 酸，由L-谷氨酸作为氨基供体。从酿酒酵母中分离到两个氨基己二酸转氨酶^[17]。

在金针菇基因组中，我们也预测到有两个基因(gene3816和gene4872)编码氨基己二酸转氨酶(AAT1和AAT2)。序列一级结构特征如图 3所示，序列全长分别为1 802 bp和2 205 bp，分别包含7个内含子和8个外显子，以及12个内含子和13个外显子。ORF全长分别为1 443 bp和1 608 bp，分别编码480和535个氨基酸，分子量分别为54.21 kD和59.33 kD，理论等电点5.12和6.52。结构域分析显示AAT1和AAT2都属于氨基转移酶家族(图 4D和图 4E)。AAT1蛋白序列与C. torrendii的芳香族氨基酸转移酶Aro8 (Accession No. KIY71393)相似性最高，达53%。AAT2蛋白序列与C. torrendii的PLP-dependent transferase (Accession No. KIY73729)相似性最高，达71%。二级结构预测显示(图 4D和图 4E)两段序列都具有较高的α螺旋(34.38%和33.08%)和无规则卷曲(32.71%和35.33%)，β转角占9.79%和10.09%。

2.3.5 氨基己二酸还原酶：AAR酶催化的反应是目前仅在真菌中发现而且唯一一个同时发生腺苷酸化和还原反应的过程^[18]。在早期的基础研究中，AAR催化的反应被认为是三步反应^[19]，首先是氨基己二酸与ATP反应形成腺苷酸衍生物；第二步紧接着该腺苷酸衍生物在NADPH存在的条件下被还原；第三步，被还原的腺苷酸衍生物裂解形成α-氨基己二酸-δ-半醛。第一步的产物被成功的分离并鉴定，即δ-腺苷-α-氨基己二酸，然而第二步的产物因为太不稳定而无法鉴定^[6]。

金针菇基因组中预测到gene7226编码氨基己二酸还原酶，一级结构特征如图 3所示，序列全长2 391 bp，包含14个内含子15个外显子，ORF全长1 641 bp，编码546个氨基酸，分子量为57.96 kD，理论等电点6.53。结构域分析显示该蛋白属于依赖于NAD(P)⁺的醛脱氢酶超基因家族(ALDH-SFsuperfamily，图 4F)，蛋白序列与C. torrendii的醛脱氢酶(Accession No. KIY68485)相似性最高，达79%；并且与双色蜡蘑(Laccaria bicolor)的醛脱氢酶(Accession No. XP_001878717)的相似性也高达78%。二级结构显示(图 4F)，该段序列具有较高的α螺旋(47.84%)和无规则卷曲(39.68%)。亚细胞定位预测显示该蛋白定位于线粒体(表 2)。

2.3.6 酵母氨酸还原酶和酵母氨酸脱氢酶：SDR和SDH两者都是催化可逆反应，不同的pH值催化不同的反应。两者都受高浓度的α-酮戊二酸和赖氨酸调控抑制^[20]。

值得注意的是，在金针菇的基因组测序报告中并没有预测到SDR基因，我们在分析SDH时，将其序列向上游延伸了5 000 bp，意外发现附近的SDR基因。这两个基因同时位于Scaffold-88，物理距离仅相差111 bp，由此推测这两个基因在基因组中位于同一个基因簇中，可能属于同一个遗传连锁群，其所代表的进化意义有待进一步深入研究。有报道称，SDR和SDH在序列上并没有同源性，但是都具有真菌特异性，二者分别以NADPH和NADH作为辅酶，催化的反应非常类似^[6]。

经分析显示，SDR序列全长1 033 bp，包含 4个内含子5个外显子(图 3)，ORF全长786 bp，编码261个氨基酸，分子量为27.43 kD，理论等 电点是5.35。结构域分析显示该蛋白属于 NADB-Rossmann超家族(图 4G)，这是一个包含脱氢酶和氧化还原酶的蛋白大家族。蛋白序列与 C. torrendii的SDR (Accession No. KIY68484)相似性最高，达74%。二级结构(图 4G)显示，该段序列具有较高的α-螺旋(38.31%)和无规则卷曲(26.44%)。

SDH序列全长1 408 bp，包含4个内含子5个外显子，ORF全长1 182 bp，编码393个氨基酸，分子量为42.91 kD，理论等电点是5.27。结构域分析显示该蛋白亦属于NADB-Rossmann超家族(图 4H)，蛋白序列与白环蘑菇(Leucoagaricus)的SDH (Accession No. KIY68484)相似性最高，达77%。二级结构显示(图 4H)，该段序列具有较高的α-螺旋(29.26%)和无规则卷曲(36.13%)。

3 结论与讨论

本研究基于金针菇的全基因组序列，首次完整地报道了金针菇中L-赖氨酸的从头合成途径，对该途径中的关键基因进行了理化性质研究以及生物信息学分析，确证了金针菇中L-赖氨酸是通过α-氨基己二酸途径形成，而非二氨基庚二酸途径。

α-氨基己二酸途径通常被认为分为两部分，前半部分是从α-酮戊二酸开始到α-氨基己二酸，后半部分是从α-氨基己二酸到L-赖氨酸。参与前半部分反应的HCS、HAH和HIDH三个酶在S. cerevisiae中均存在于线粒体中^[12]。在金针菇中，HAH和HIDH也发现含有线粒体转移肽，但是金针菇HCS却没有预测到线粒体转移肽(表 2)。S. cerevisiae的两个AAT一个存在于线粒体中，一个存在于胞质中^[6]，而我们的结果显示金针菇中的两个AAT均存在于胞质中(表 2)。AAA途径的后半部分反应通常认为是发生在胞质中，S. cerevisiae中的AAR、SDR、SDH这3个酶也被证明是在胞质中发挥作用，然而金针菇中的AAR酶亚细胞定位预测显示其定位于线粒体。推测这些差异可能是由于不同物种的赖氨酸合成途径在进化过程中产生了分离，也有可能是由于全基因组测序后的基因注释的不完善，下一步我们将会对这些基因进行克隆并进行功能验证，确证其定位信息。

值得探讨的是，我们的分析结果显示，金针菇基因组中SDR和SDH两个基因位于同一个基因簇中，物理位置非常相近，可能属于同一个遗传连锁群；而且有报道称，这两个基因编码的蛋白酶催化的反应非常类似^[6]。目前尚未有关于二者在分子方面和进化方面的报道，其所代表的进化意义有待我们进一步深入研究。

L-赖氨酸是人和动物的必需氨基酸，只能从日常饮食中获取。本文分析了金针菇α-氨基己二酸途径中的8个关键酶，其中HCS、HAH、SDR和SDH受终产物赖氨酸的反馈抑制作用，这些关键酶基因可作为提高赖氨酸含量的调节靶点，通过利用赖氨酸结构类似物(AEC)筛选突变株或重组体^[21]，或者通过基因工程手段改良金针菇品种，以获得高赖氨酸含量的新品种，从而满足人们日常对赖氨酸的摄取，为儿童生长发育提供重要营养来源，将会有重大意义。