氮是一种在自然界广泛存在且所有生命活动不可缺少的营养元素，氮循环更是地球生物化学循环中不可缺少的重要组成部分之一。但过量氮素滞留水体易导致水体富营养化、引发赤潮、消耗大量溶解氧，同时水体脱氮过程还涉及温室气体排放，因此会直接威胁水生态安全、饮用水安全以及全球气候等重大环境问题^{[1, 2, 3]}。

固氮作用、硝化作用和反硝化作用是氮循环中较为重要、受主要关注的过程，然而越来越多的研究表明，一些被忽视的氮转化过程可能在一些特定的环境中起着举足轻重的作用。

尽管早在1938年硝酸盐异化还原成铵(Dissimilatory nitrate reduction to ammonium，DNRA)就在纯培养条件下被发现了^[4]，但由于常规分析方法难以鉴别DNRA的产物和活性，且另一种硝酸盐异化还原过程——反硝化往往更易发生^[5]，DNRA长时间内未受到足够重视。

DNRA过程以NO₃⁻/NO₂⁻为电子受体，氧化NADH产生NH₄⁺，存在于细菌和真菌中^[6]。与植物和少数细菌消耗能量进行的硝酸盐同化还原成铵不同，DNRA过程的主要目的不是进一步将产生的铵转化为供自身利用的有机氮，而是产能或减少对细胞有毒害作用的NO₃⁻/NO₂⁻，因此多数DNRA过程属于异养发酵产能过程，以Klebsiella为例：无NO₃⁻/NO₂⁻时，NADH氧化形成乙醇^[7]如公式(1)；存在NO₃⁻/NO₂⁻时，几乎不产生乙醇，反应式如公式(2)。

该类DNRA过程可以分为两个阶段：

第一阶段类似反硝化，异化硝酸还原酶(NaR)将NO₃⁻还原成NO₂^{−[8]。电子供体不足时，DNRA过程会停留在这一步，造成NO₂−的积累[9]。研究显示一些河流中NO₂−的积累主要就是由河底沉积物中厌氧DNRA细菌引起的[10]。}

目前已知的NaR酶有两种：一种在质膜上，与含细胞色素的电子传递有关，为反硝化细菌和多数DNRA细菌所共有。另一种是溶解性的，目前仅发现于专性厌氧的Closridium perfringens中，只含一个亚单位非血红素铁硫蛋白，其功能与含细胞色素的电子传递无关，其电子供体为铁氧还原蛋白^[11]。

第二个阶段，亚硝酸还原酶(NiR)将NO₂⁻还原成NH₄⁺。DNRA的NiR酶活性比反硝化的NiR更强，可以进行6个而非3个电子的传递。

目前已知的DNRA的NiR酶是一种胞浆周围酶，存在于Escherichiacoli中，由nrfA基因编码，其辅基为四细胞色素C复合体^[12]，电子供体可能是甲酸，但电子传递链中的具体氢载体还有待确定。

上述DNRA过程会产生N₂O，产量一般约为NO₃⁻或NO₂⁻总量的1%。但是Citrobacter C48的N₂O产量高达23.5%^[11]，而Clostridium KDHS2是已报道的唯一不能产生N₂O的菌株。N₂O的产生机理尚未确定，但可能不和NH₄⁺来自同一酶系统，例如Escherichiacoli的NaR酶是DNRA过程中产生N₂O必需的，而NiR酶则可以缺失^[13]。对于DNRA过程是否产生NO还鲜有报道^[14]。

除上述DNRA过程外，还有一种较为特殊的自养DNRA方式：自养硫细菌利用硝酸盐氧化硫化物(H₂S、S²⁻)以及单质S^{[4, 15]}，其反应式如公式(3)^[16]。

一些硫细菌既能进行DNRA产生NH₄⁺，又能进行反硝化产生N₂^[17]，但只有硫化物能产生NH₄⁺和N₂O，其对反硝化作用则可能存在抑制。一些硫细菌，如Desulfovibrio desulfuricans，不能代谢NO₃⁻，需要依靠外源NO₂⁻进行代谢^[18]。

NO₃⁻是比O₂产能效率低的电子受体^[19]，因此DNRA细菌多为专性厌氧菌和兼性厌氧菌，如Escherichia、Klebsiella、Citrobacter、Proteus、Desulfovibrio、Wolinella、Haemophilus、Achromobacter、Clostridium、Streptococcus、Neisseriasubflava等11属^[18]。在常见的存在DNRA的生境中，一般主导区系是Aeromonas、Enterobacteria 等兼性厌氧发酵细菌^[18]，但也有具备DNRA功能的微嗜氧菌和严格好氧菌(表 1)^[20]。Campylobacter sputorum是目前报道的唯一具备DNRA功能的微嗜氧细菌，其电子传递链与专性厌氧DNRA细菌、兼性厌氧DNRA细菌的电子传递链差异都较大，与反硝化细菌的电子传递链较为相似(图 1)^[9]。而好氧细菌种类相对较多，如Bacillus属、Pscudomonas属中的多种细菌都具备DNRA功能，但其具体机制尚不明确。

图 1 　细菌电子传递链[9] Figure 1 　 Electron transportchain[9] 注：A：专性厌氧菌Desulfovibrio desulfuricans；B：兼性厌氧菌Escherichia coli；C：微嗜氧菌Campylobactor sputorum；D：反硝化细菌Paracoccus denitricans. Note:A: Desulfovibriodesulfuricans; B:Escherichia coli; C: Campylobactor sputorum; D: Paracoccus denitricans.

图选项

DNRA广泛存在于土壤^{[21, 22, 23, 24]}、稻田^[25]、湿地、消化污泥^[26]，反刍动物的瘤胃^[27]以及淡水^[10]、河口、海洋沉积物^{[28, 29]}等生境中。由于DNRA过程有利于土壤中氮素的保存^[30]，我国对其的研究主要集中在稻田水淹土壤中^[13]，缺乏对其他生境的研究。

河口是连接河流与海洋的过渡地带，流场受到径流动力和海洋动力相互作用的影响。河口区域受到潮汐循环、咸淡水交替、出露淹没交替、泥沙冲淤交替等海陆互作的影响，各种环境因子复杂多变，多种氮循环过程在此并存，其中河口沉积物既是氮素营养盐的源和汇，也是以氮生化反应为主的微生物富集的场所，在氮循环的建立和平衡中起着主导作用。

河口又往往经济发达、人口密集，人为干扰向河口输入大量外源氮素，使河口区域的环境因子更加复杂，影响微生物群落及其相互作用^{[36, 37, 38, 39]}，引发水生态安全、饮用水安全和全球变暖等重大环境问题，故研究河口的氮循环过程对可持续发展有重要意义。

目前关于河口地区的氮循环形成的研究主要得出了以下两个结论^{[40, 41]}：首先，反硝化是减少入海氮通量及富营养化水环境中氮素去除的最好手段。全球范围内河口地区总氮负荷中约50%由反硝化去除。其次，河口地区通常可去除径流中10%−60%的氮负荷。

然而，由于氮转化途径复杂多样，现有海洋氮循环通量模型还无法计算达到氮平衡的范围^[42]。可见，可能还存在一些被忽视的重要氮循环途径。针对新发现的氮循环途径和河口区的特殊环境，Santoro^[43]在2010年提出了河口区氮循环的主要途径(图 2)^[43]，较为全面地推测了此类区域的氮素的来龙去脉。

图 2 　河口区氮素可能的转化途径[43] Figure 2 　 Microbial nitrogencycling in estuarine regions[43]

图选项

尽管自20世纪80年代末，DNRA过程存在于自然生态系统的氮循环过程之中的事实就已经被确认了^[18]，但是对DNRA过程的重要性的认识还是在近十年之内的事情^[44]：不同生态微环境下广泛存在DNRA过程，占初始NO₃span>⁻的10%−90%^[45]，DNRA在近海河口更是一种氮素内循环的重要过程^{[45, 46, 47]}，比如丹麦的Norsmide Fjord，其表层沉积物只发生DNRA过程^[48]。

一般DNRA过程在亚热带河口水体较为剧烈，例如Gardener等^{[49, 50]}的同位素实验表明：德克萨斯州海湾中15%−75%的NO₃⁻通过DNRA转化为NH₄⁺，仅5%−29%的NO₃⁻转化为N₂。而他们对佛罗里达州海湾的研究表明：在该相对高温高盐的河口滨海系统中，夏季富营养化严重，DNRA过程剧烈，河口富营养化加剧^[51]。澳大利亚的塔斯马尼亚州的河口也出现相同的现象：在水体富营养化过程中氮素内循环生成的NH₄⁺占NH₄⁺总量的10%−50%，并发生积累^[52]。

我国对于河口DNRA途径的研究较少，主要集中在珠江口。韦宗敏等^[53]在研究微生物好氧反硝化机理时，在利用珠江口沉积物筛选好氧反硝化菌种过程中发现了能在碳源充足的情况下进行DNRA的微生物群落，其转化效率可达30%；蒋然等^[52]测试了不同碳源对珠江河口沉积物中DNRA过程的影响；徐继荣等^[54]研究发现珠江口入海河段水样和沉积物NO₃⁻的还原速率远大于反硝化速率，都说明NO₃⁻生化转化途径中硝化-反硝化耦合反应不是唯一的主要途径。在长江口的氮循环方面，林啸^[55]研究发现：N₂O排放与沉积物水界面NH₄⁺-N通量而非NO_x-N通量呈正相关，因此长江口滨岸沉积物-水气界面N₂O排放的主要氮转化过程更为可能是DNRA。

但即使在相近的河口区域，DNRA过程也会有很大差异，例如林啸^[55]对密西西比河口氮循环研究表明DNRA过程对NO₃⁻的去除和NH₄⁺的生成的贡献都很小，与Childs等^[56]在墨西哥湾相近区域的研究结果较不同。可见，进一步认识、了解调控该过程的环境因子的重要性。

盐度是河口生态系统中变化最为剧烈的环境因子。Laverman等^[57]在咸-淡水交汇区的沉积物水土体系氮循环模拟实验中，观察到随盐度升高，DNRA过程的反应速率比淡水环境中提高35 mmol/(m³·h)，可见，咸潮入侵对DNRA过程可能有促进作用。而在长时间尺度上，Giblin等^[58]对Parker河口进行了长达13年的监测研究后，发现沉积物-水界面营养通量以铵为主，铵通量与盐度有较高相关性，DNRA过程的季节变化模式与盐度时间尺度变化一致。

对于盐度对DNRA过程的影响有两种解释：第一种认为这是由于与DNRA过程竞争的反硝化过程受到盐度的抑制作用，但也有研究表明反硝化对盐度并不敏感，故这一观点还存在争议^{[43, 48, 49, 50, 51]}；另一个较受认可的解释认为，随着盐度升高，SO₄²⁻含量下降，硫还原细菌的DNRA过程的电子供体(即低价态硫化物)就相应增多了，这既能抑制反硝化过程又能促进DNRA过程^{[13, 49, 50, 59]}。

一般认为，只有在强烈还原条件下 (Eh<−200 mV) DNRA过程才会在NO₃⁻异化还原中起到重要作用^[21]，例如殷士学^[60]对淹水土壤的培养实验显示：Eh在−100 mV之上时对DNRA影响不大，但从−100 mV降至−340 mV时DNRA过程明显增强。但也有对土壤的研究表明，DNRA过程对Eh的敏感性并不及反硝化过程^[61]，该结论是否适用于河口沉积物还有待研究。

虽然存在对氧浓度不敏感的DNRA细菌^[13]，但一般认为，低DO让DNRA菌群比反硝化菌群更具竞争力^{[15, 18]}，如宋国栋^[62]对长江口和东海沉积物监测显示：随DO减少至严重缺氧，厌氧氨氧化(Anammox)和反硝化速率分别降低了38%和43%，DNRA速率则增加了3倍。

这种现象可以归因于以下3点：(1)严重缺氧条件下沉积物有机氮矿化速率降低，硝化速率降低，从而抑制了反硝化过程等硝酸盐代谢途径^[60]。(2) 缺氧意味着氧化还原电位较低，对DNRA过程，尤其是硫还原菌的DNRA过程更为有利。(3) DNRA菌群一般以兼性厌氧发酵细菌为主。缺氧会迫使这些细菌更多地进行DNRA过程产能。

一般认为，DNRA过程在氮源缺乏、碳源丰富而不稳定的环境中更容易发生，并成为硝酸盐异化还原的主要途径^{[13, 57, 63]}。

氮源方面，一些细菌不适合利用NO₂⁻作为氮源，这可能与NO₂⁻对生物体有较大的毒害作用有关；但是也有少数细菌，如Desulfovibrio desulfuricans只能以NO₂⁻为氮源进行代谢。因此，NO₃⁻可能是更有利于DNRA细菌生长的氮源^[60]。但高浓度NO₃⁻对DNRA也存在抑制作用，例如在盐沼沉积物中，可利用的NO₃⁻增加会使DNRA过程去除NO₃⁻的效率由52%降至4%^[64]。另外，虽然低浓度氮源对N₂O的产出无关，但高浓度氮源有利于N₂O产出^[59]。DNRA过程的产物氨氮浓度则对DNRA过程没有影响，DNRA过程产生的氨氮可以成为其他微生物的氮源^{[10, 65]}。

碳源方面，在有机质富集的沉积物中DNRA过程去除NO₃⁻可达50%，与反硝化相当^{[41, 66]}。Tiedje^[20]认为易分解的碳源可被高效利用电子受体的DNRA细菌充分利用，因为DNRA过程中1 mol NO₃⁻接受8 mol电子，而反硝化过程中仅接受5 mol电子。该观点在之后的研究中得到了证明^[10]，即DNRA更趋向于在氧化程度较弱的碳源环境中发生。韦宗敏^[13]对珠江口沉积物培养实验表明：在C/N为2−10的条件下，DNRA过程都会发生，但碳源氧化状态越强，DNRA过程所需要的适宜C/N越高。

DNRA过程在亚热带河口、海洋区域较为剧烈，可见其对温度的要求较高。韦宗敏^[13]对珠江口沉积物培养实验显示：该区域混合菌群的产铵率在30 °C达到最高，为47.59%，随后产铵率随温度上升下降，高于Anammox过程的最佳温度12 °C和反硝化过程的最佳温度24 °C。

韦宗敏^[13]对珠江口沉积物进行培养实验后发现：初始pH值为7.0时，产铵率最高达25.71%，N₂O的产出量也达最高，pH 6.0−10.0之间时，DNRA过程都可以发生；殷士学^[59]通过淹水土壤的培养实验得出：DNRA过程发生于pH 5.0−8.0之间。一般认为DNRA过程多发生于偏碱性的环境中，而且DNRA过程本身也是产碱过程，因此环境pH和DNRA过程可能存在相互影响。

硝酸盐有较多的生化转化途径(图 3)^[18]。其中DNRA过程、反硝化过程和Anammox过程是沉积物厌氧环境中氮循环的3种关键过程^[62]。

图 3 　硝酸盐的生化转化途径及最终产物[18] Figure 3 　A conceptual diagram of the biochemical nitrate removal pathways[18]

图选项

反硝化过程将NO₃⁻还原为N₂O或N₂，而Anammox过程以NO₂⁻为电子受体，NH₄⁺为电子供体产生N₂O^[67]和N₂。两个过程会与DNRA过程竞争相同的底物，但生化过程一般是复杂的，每种过程都适应于特定的外界条件(图 4)^[68]。

图 4 　硝酸盐异化还原过程控制因素推测[68] Figure 4 　Hypothesized controlson predominant pathways of nitrate removal[68]

图选项

一般认为反硝化过程是DNRA过程的主要竞争者，但两类细菌的共培养实验显示：无论哪类细菌数量占优，都共同利用环境中的氮源和碳源，不抑制对方生长^{[53, 69]}。

而Anammox过程既参与对氮源的竞争，也可以与DNRA过程耦合达到脱氮的效果，因为DNRA过程可以为Anammox过程提供底物——NO₂⁻和NH₄⁺。DNRA-Anammox耦合过程中执行DNRA过程的不仅可以是DNRA细菌，也可能是Anammox细菌，如Kueneniastuttgartiensis^[47]。

虽然DNRA-Anammox耦合过程与反硝化过程不同，但最终结果都是将NO₃⁻转化为N₂并伴随少量N₂O产生，因此难以用传统的同位素示踪法区分，需要辅助其他示踪技术和基因标记方法来研究^[67]。因此虽然3种过程在沉积物中的发生频率和效率的比例决定了沉积物中氮的收支，但目前的研究一般只考虑3种过程中的一种或两种^{[70, 71, 72, 73]}。尽管目前亦有能在三者共存条件下区分各自贡献的方法^[74]，但需要建立开放的稳态体系，尚未见研究报道。

DNRA过程将在水体中易转移的NO₃⁻转换为不易转移的NH₄⁺，与两种主要脱氮过程——反硝化和Anammox过程竞争相同底物，可能加剧水体富营养化；但同时DNRA-Anammox耦合过程意味着DNRA过程可能有利于水体的脱氮。因此，探究DNRA过程对其它氮循环过程的影响和相互关系是非常有意义的。

国内目前对DNRA过程的研究较少，尤其是对于河口这样一个环境复杂、连接咸淡水两种生态系统的重要脱氮场所，DNRA过程所扮演的具体角色、受到哪些环境因子的调控以及具体调控机理还有待具体研究，同时新的实验技术和研究方法有待开发。此外，进一步研究DNRA细菌的生理生化特征和代谢途径，也将深入揭示DNRA过程的微生物基础。

综上，研究河口生态系统中的DNRA过程有助于加深我们对氮循环的认识，为我国河口地区甚至近海的水资源保护和生态治理提供科学指导。