木聚糖是植物细胞壁中半纤维素的主要组成成分，其完全水解需要多种酶的协同作用。内切-1,4-β-D-木聚糖酶俗称木聚糖酶，它随机切割木聚糖主链后生成木糖，是木聚糖降解过程中发挥主要作用、具广泛应用价值的一类酶^[1]。研究表明木聚糖酶分布于GH5、7、8、10、11、43等家族中，GH10家族的木聚糖酶由于能将天然支链木聚糖降解为木寡糖而备受关注^{[2, 3]}。木聚糖酶在饲料添加剂、纸浆漂白、食品加工、医药等行业中具有广泛的应用前景，但不同应用领域所需木聚糖酶性质具有差异，因此对不同环境来源木聚糖酶基因资源的开发具有重要意义^{[4, 5]}。

植食性动物胃肠道中存在丰富的与木质纤维素降解有关的酶类，但不同动物之间存在差异^{[6, 7, 8]}。近年来，研究者通过微生物分离培养和宏基因组学等方法从天牛胃肠道^[9]、黑颈鹤粪便^[10]、山羊瘤胃^[11]、奶牛瘤胃^[12]等动物中获取了多种木聚糖酶。滇金丝猴(Rhinopithecus bieti)主要采食地衣、野果、针叶树的嫩叶、越冬的叶芽苞、松萝等^{[13, 14]}，是典型的植食性动物，由于动物摄食植物种类以及动物的物种差异，其胃肠道中可能蕴含不同于其它动物的新微生物木聚糖酶基因资源。

本研究以野生和半圈养的滇金丝猴粪便微生物为研究对象，提取其宏基因组DNA，利用简并引物PCR扩增获得GH10木聚糖酶基因片段，通过构建系统进化树首次研究了滇金丝猴粪便微生物中GH10家族木聚糖酶基因的多样性，为新型木聚糖酶的开发和滇金丝猴胃肠道微生物资源的利用奠定了基础。

1 材料与方法 1.1 野生和半圈养滇金丝猴食物结构及其粪便样品采集

野生和半圈养滇金丝猴粪便样品采自云南省维西县白马雪山国家级自然保护区。滇金丝猴的粪便颗粒较小、粪便量少，为保证目的DNA的质量，粪便样品用干冰保存运输。采集野生和半圈养滇金丝猴的粪便样品各23份，于-70 °C保存备用。

半圈养滇金丝猴不关在笼子里，而在自然保护区内被人为限制活动区域，并接受人工投食。投食植物采自保护区内，主要包括松萝、地衣、箭竹、鸡素子等树木的嫩叶、花、果实。野生型滇金丝猴的食谱比半圈养更为广泛，除半圈养投喂的植物外，还包括华山松、大叶杨、岷江冷杉、大叶杜鹃、野萝卜等多种植物，且随季节变化其采食的植物种类会发生变化，例如：野生滇金丝猴春季以芽苞、嫩叶为主要食物；夏季以叶片为主要食物；秋季以果实为主要食物；冬季以针叶树松果籽及嫩枝皮为主要食物^[15]。

1.2 菌株和质粒

大肠杆菌感受态细胞Escherichia coli Trans-I由本实验室保存；pMD19-T vector购自日本TaKaRa公司。

1.3 酶和生化试剂

DNA Marker (DL2000、DL15000)、Taq DNA聚合酶购自日本TaKaRa公司；质粒抽提试剂盒购自上海捷瑞公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒、dNTPs、PCR产物纯化试剂盒购自上海华舜公司；氨苄青霉素(Ampicilline)、琼脂糖(Agarose)购自德国Sigma公司；其余为国产分析纯。

1.4 滇金丝猴粪便微生物GH10木聚糖酶基因片段的扩增及文库构建 1.4.1 滇金丝猴粪便微生物宏基因组DNA的提取：参照QIAamp DNA Stool Mini Kit (QIAGEN)试剂盒操作说明，分别提取23份野生滇金丝猴的粪便微生物宏基因组DNA，然后取相同浓度的DNA混合(半圈养滇金丝猴宏基因组DNA的获取方法同野生型)，对野生和半圈养金丝猴的混合基因组DNA进行Nanodrop检测，其A₂₆₀/A₂₈₀值分别为1.88和1.87，均满足后续实验要求，置于-20 °C保存备用。

1.4.2 GH10木聚糖酶基因扩增：分别以混合的野生和半圈养滇金丝猴粪便微生物基因组DNA作为模板，用简并引物Xyn 10F (5′- GGYCAYACBCTNRTNTGGCA-3′)和Xyn 10R (5′- YTCRTTNACNACRTCCCA-3′)扩增目的片段^[16]。PCR反应体系(20 μL)：10×PCR buffer 4 μL，dNTPs (2.5 mmol/L) 2 μL，rTaq DNA polymerase (5 U/μL) 0.3 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH₂O 10.7 μL。PCR反应条件为：94 °C 5 min；94 °C 30 s，60 °C 30 s，72 °C 30 s，15个循环；94 °C 30 s，44 °C 30 s，72 °C 30 s，30个循环；72 °C 5 min；其中从60 °C到44 °C每个循环下降1 °C。

1.4.3 克隆文库构建及阳性克隆筛选：2%的琼脂糖凝胶电泳显示野生和半圈养滇金丝猴粪便微生物宏基因组DNA都能扩增出100-250 bp的基因片段，符合简并引物Xyn 10F和Xyn 10R扩增第十家族木聚糖酶基因的理论值。扩增产物经琼脂糖核酸电泳检测后切下目的条带，胶回收试剂盒纯化PCR产物。用pMD19-T载体于16 °C过夜连接，产物转化到E. coli Trans-I感受态细胞中，在含有X-gal、IPTG、Amp的LB平板上检测，选择白色菌落进行菌液PCR验证，鉴定为阳性重组子的克隆送深圳华大生物科技有限公司测序，测序通用引物为M13。

1.4.4 系统发育分析：测序所得DNA序列使用Vector NTI 11.5软件去除两端载体序列，用NCBI中的BLASTx (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)工具比对，与GenBank中木聚糖酶基因序列有较高相似性的序列鉴定为木聚糖酶基因，将基因片段翻译为氨基酸序列构建系统进化树并进行多样性分析，参考序列选用与环境来源木聚糖酶基因片段相似性较高的木聚糖酶基因序列。多序列比对采用ClustalX，采用MEGA 6.0软件选择邻近相接法(Neighbor-Joining method)构建系统进化树，其步值设定为1 000。

1.4.5 序列登录号：两种环境中获得的序列信息提交至EMBL数据库，野生和半圈养粪便微生物来源的木聚糖酶基因片段登录号分别为：LN717193-LN717218和LN717219-LN717246。

2 结果与分析 2.1 野生、半圈养滇金丝猴粪便微生物GH10木聚糖酶基因比对分析

从两个克隆文库中分别挑取100个阳性重组子测序，去载体比对分析发现，野生和半圈养文库中分别有96、70条基因片段与GenBank数据库中GH10木聚糖酶基因有高度一致性，其氨基酸序列一致性分别在58%-95%、63%-81%之间；序列长度分别介于151-193 bp和166-196 bp之间。ClustalX软件比对发现所有蛋白质序列都具有GH10木聚糖酶的催化残基(DVVNE)。

利用CD-Hit程序将两种环境样品中获得的基因序列去冗余，最终获得54条不同序列，微生物组成对应厚壁菌门、拟杆菌门、未培养细菌。其中野生滇金丝猴粪便微生物GH10木聚糖酶基因克隆文库中得到26条，微生物来源于uncultured bacterium和Butyrivibrio、Bacteroides、Ruminococcus、Sphingobacterium、Chryseobacterium、Clostridium、Bacillus 7个属的14个种。从半圈养滇金丝猴粪便微生物GH10木聚糖酶基因克隆文库得到28条，来源于uncultured bacterium和Clostridium、Paludibacter、Sphingobacterium、Ruminococcus、Roseburia、Chryseobacterium 6个属的15个种。

比较两种环境GH10木聚糖酶的微生物来源(表 1)，发现获取的基因片段都与Uncultured bacterium、Ruminococcus、Clostridium、Chryseobacterium、Sphingobacterium来源的GH10木聚糖酶基因有较高的一致性；而Bacillus、Bacteroides、Butyrivibrio这3种微生物来源的GH10木聚糖酶基因仅在野生环境克隆文库中发现；Paludibacter和Roseburia来源的GH10木聚糖酶基因仅存在半圈养环境克隆文库中。

2.2 滇金丝猴粪便微生物木聚糖酶基因多样性分析

用本研究获得的54条(野生D、半圈养S)木聚糖酶基因片段与GenBank来源的25条参考序列构建进化树(图 1)，并将其分为A、B、C、D、E、F和G 7个分支。

滇金丝猴粪便微生物中未培养细菌来源的GH10木聚糖酶基因为优势组分，分支A、B共有20条序列与未培养细菌来源的木聚糖酶基因参考序列聚在一起，其中野生环境来源的木聚糖酶基因丰度与半圈养环境来源的相当。分支A中xynd-3-5、xynd-5-5、xyns-5-5与来自奶牛瘤胃Uncultured bacterium的木聚糖酶基因聚在一起。分支B中有3个小分支，其中一个小分支有13条基因没有与参考序列聚在一起而单独成簇，而xyns-5-13与其他克隆存在明显的进化距离而成为新的一簇。xynd-1-13、xyns-5-2、xyns-5-12与已知的其他Uncultured bacterium来源的木聚糖酶基因不相关，单独聚集为一簇。

由图 1可见，20条GH10木聚糖酶基因与厚壁菌门Firmicutes来源的木聚糖酶基因参考序列相似性较高。其中来自C、D、F亚簇的9条序列与梭菌属Clostridium来源的木聚糖酶参考序列聚在一起，但C、D、F之间的距离较远，说明滇金丝猴粪便微生物中Clostridium来源的GH10木聚糖酶序列多样性较高。此外，有8条序列(分支E)与源于瘤胃球菌属Ruminococcus的木聚糖酶参考序列聚在一起，其中有5条序列来源于野生环境；序列xynd-6-53和xynd-6-60单独聚为一类，与其他序列存在一定的进化距离。分支E中仅有半圈养环境来源的木聚糖酶基因xyns-5-6、xyns-5-17与Roseburia intestinalis来源的木聚糖酶聚在一起。xynd-6-80虽然与来源于土壤的Bacillus sp. HJ2的木聚糖酶存在最高一致性(58%)，但在进化树中存在明显的进化距离。

分支G中有14条GH10木聚糖酶基因与拟杆菌门Bacteroidetes来源的木聚糖酶基因参考序列聚在一起，分布于4个不同的属，包括Bacteroides、Sphingobacterium、Chryseobacterium、Paludibacter。基于进化分析和序列比对发现，仅xynd-6-42、xynd-6-44、xynd-6-79三条野生粪便微生物来源的木聚糖酶基因序列和Bacteroides sp. CAG:875聚在一起，xyns-3-15、xyns-5-16、xyns-3-2 三条半圈养粪便微生物来源的木聚糖酶基因序列和Paludibacter propionicigenes WB4聚在一起。

3 结论与讨论

植物细胞纤维主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，其中半纤维素的主要组成成分是木聚糖，而木聚糖酶是木聚糖降解过程的重要酶类。植食性动物胃肠道中蕴含着丰富的微生物木聚糖酶基因资源，并且不同动物之间存在差异，然而目前对其基因多样性的研究报道还很少，且主要集中在反刍动物。Wang等^[17]采用同源克隆法研究山羊瘤胃中GH10家族的木聚糖酶基因多样性，并用改进的TAIL-PCR方法从山羊瘤胃中获得5个GH10的木聚糖酶全长基因。Li等^[18]通过研究绵羊饲喂周期内不同时间点GH10木聚糖酶和CP植酸酶基因组成的比较，表明了瘤胃环境GH10木聚糖酶和CP植酸酶基因呈现多样的转录变化趋势，从分子水平揭示了瘤胃环境降解酶的动态性和复杂性。

本文首次报道灵长类植食性动物滇金丝猴粪便微生物来源的GH10木聚糖酶基因多样性，采用未培养技术，直接从滇金丝猴粪便微生物中提取总DNA，用GH10简并引物扩增基因片段并构建克隆文库。结果从两种环境的滇金丝猴粪便微生物宏基因组克隆文库中获得54条第十家族的木聚糖酶基因片段，BLAST比对分析表明，实验所得大多数木聚糖酶基因同已知的木聚糖酶基因相似性较低，其中最低为58%，表明所得的基因片段具有较高的新颖性。

野生和半圈养滇金丝猴粪便中GH10木聚糖酶的微生物来源存在差异，Bacillus、Bacteroides、Butyrivibrio微生物来源的GH10木聚糖酶基因只存在于野生滇金丝猴的克隆文库中，而Paludibacter、Roseburia微生物来源的GH10木聚糖酶基因只在半圈养滇金丝猴的克隆文库中存在。两者不同的生活方式和食物结构可能是引起差异的主要因素，半圈养滇金丝猴以人工投食为主，食物相对单一，而野生滇金丝猴由于活动区域广阔，其摄食植物种类丰富多样。来源于瘤胃球菌属Ruminococcus的GH10木聚糖酶在野生和半圈养滇金丝猴粪便、山羊和绵羊瘤胃中都存在，说明该菌在木聚糖的降解中发挥着重要作用(表 1)。来源于Butyrivibrio、Sphingobacterium、Chryseobacterium、Paludibacter、Roseburia、Bacillus 6个属细菌的GH10木聚糖酶仅见于滇金丝猴粪便，而山羊瘤胃来源于Prevotella、Xanthomonas、Verrucomicrobiae、Cellulosilyticum 4个属，绵羊瘤胃来源于Schizophyllum属的GH10木聚糖酶在滇金丝猴粪便中没有发现。滇金丝猴粪便GH10木聚糖酶基因来源的微生物主要来自厚壁菌门，而山羊和绵羊瘤胃中GH10木聚糖酶基因主要来源拟杆菌门细菌^[19]，这一结果丰富了动物胃肠道中木聚糖酶基因分布的微生物多样性，也表明了动物摄食植物种类以及动物的物种差异对木聚糖酶基因微生物来源的影响。

本研究结果表明滇金丝猴胃肠道中蕴含不同于其它动物的新微生物木聚糖酶基因资源，获得了丰富的GH10木聚糖酶基因片段，下一步可在获得的基因片段基础上，利用热不对称交错PCR (TAIL-PCR)或反向PCR等方法获得木聚糖酶全长基因，并进行基因的克隆表达，以充分开发利用滇金丝猴胃肠道微生物的木聚糖酶基因资源。