植物内生菌是能够定殖在植物细胞间隙或细胞内，并与寄主植物建立和谐关系的一类微生物^[1]。内生菌不仅能够参与植物次生代谢产物的转化与合成，而且还能够独立产生丰富的次生代谢产物，是天然产物的重要来源^[2]。自1993年Stierle从短叶红豆杉(Taxus breviflia)中分离得到一株能合成抗癌物质紫杉醇的内生真菌Taxomyces andreanae后，引起国内外学者对药用植物内生菌的广泛关注。目前，我国学者对药用植物内生菌的研究较多，已有学者从黄花蒿、冬麦、黄连、甘草、大花金挖耳等传统药用植物中分离到对植物病原菌具有较强拮抗作用的内生菌并对其多样性进行了初步的探 究^[3,4,5,6]；药用植物内生菌次生代谢产物含有与宿主植物相同或相似的药用活性成分，包括抗菌、抗炎症、降糖、抗氧化活性类物质等天然化合物^[7]。研究显示，51%从植物内生菌分离的生物活性物质是以前没有发现的化合物，其中多种化合物具有广谱抗菌活性，这对抗菌活性物质的开发具有重大的意义^[8]。目前药用植物内生菌已成为人们寻找新型药物的重要来源。

枸杞Lycium barbarum L.为茄科多年生落叶小灌木，是我国传统的药用植物，也是重要的经济来源。其花、果、叶、根皮均可入药，药用成分主要有多糖、糖脂、类黄酮、生物碱等，具有降血糖、降血压、抗肿瘤、抗衰老、抗疲劳、激发生长和促进造血功能等药用保健价值。宁夏被指定为中国枸杞的唯一特产地，所产枸杞被《中华人民共和国药典》收录为道地性中药材。宁夏枸杞因具备生态、社会、经济三位一体的效益，成为我国北方干旱半干旱荒漠地区的营林先锋树种。枸杞产业对促进西部地区农业经济的发展具有重要的推动作用。目前，对宁夏枸杞的研究多集中在育种、栽培技术及枸杞多糖(LBP)的生物活性等方面，而对宁夏枸杞内生菌多样性及其物活性的研究极少，仅见刘建利^[9]对4株内生真菌的抗氧化活性的研究报道。

因此，本研究拟对宁夏枸杞不同发育阶段各药用组织器官中内生细菌的遗传多样性和分布特征进行分析，以5种病原菌为指示菌对分离菌株的抑菌活性进行测定，旨在了解枸杞内生菌的生物学特性及其未知的药理学作用、为揭示内生菌与道地药材之间的相关性研究奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 植物材料：以宁夏枸杞的主要栽培品种宁杞1号为供试材料，2013年5月-2014年7月期间在宁夏育新枸杞开发有限公司的各种植区内选择树龄8年的健康植株，采用5点取样法，于枸杞的不同发育期定期采集健康的花、果、叶、根皮用于菌株分离。

1.1.2 供试指示菌：大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、玉米大斑病菌(Exserohilum turcica)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、番茄炭疽病菌(Colletotrichum nigrum)，供试指示菌由宁夏大学生命科学学院和农学院提供。

1.2 方法 1.2.1 菌株的分离纯化：将新鲜枸杞根皮、花、叶、果上杂物冲洗干净后，称取各组织材料5 g在超净台中分别用无菌水清洗3遍，经75%的乙醇和含有效氯为5%的NaClO₄溶液进行表面消毒处理，无菌水漂洗多次后置于研钵中加入无菌生理盐水研磨至匀浆，取上清液梯度稀释后接种于营养琼脂(Nutrient agar，NA)平板，置28 °C培养2-3 d进行菌落计数和菌株分离；取最后一次漂洗液涂布于平板以检测表面消毒是否彻底。根据菌落形态挑选单菌落进行划线纯化，经革兰氏染色并镜检细胞形态和纯度后，纯菌落转接于试管斜面保存。

1.2.2 菌株的16S rRNA基因序列分析：将纯化的菌株接入NA液体培养基中，28 °C、150 r/min振荡培养2 d，4 °C、8 000 r/min离心收集菌体，采用细菌基因组DNA提取试剂盒(北京天根)进行菌株总DNA提取。采用通用引物对27F (5′-AGAG TTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-TACGG YTACCTTGTTACGACTT-3′)扩增菌株的16S rRNA基因序列^[10]。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测合格后，用限制性内切酶Hinf I和Msp I进行ARDRA分型，根据分型结果选择代表菌株委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。测序结果在GenBank中进行blast同源性搜索，获得同源性相近的菌种序列，经ClustalX多重比对后，运用MEGA 5.0软件，采用Neighbor-joining法构建系统树，boostrap 1 000次检测各分支的置信值，对各菌株的系统发育地位进行分析^[11]。

1.2.3 抑菌活性检测：将分离纯化的菌株接种于20 mL的NA液体培养基中，于28 °C、180 r/min培养72 h后，将发酵液以8 000 r/min离心5 min取上清液。采用琼脂扩散法对菌株的抑菌活性进行检测^[6]。取200 μL指示病原菌加入冷却至45 °C的固体培养基中(NA用于培养指示细菌，PDA用于培养指示真菌)混匀倒平板，冷凝后用打孔器在平板上打出直径为5 mm的孔。取发酵上清液80 μl，于28-30 °C培养18-72 h观察并测量抑菌圈的直径，以灭菌NA无菌培养液为空白对照组，每实验设置3次重复，实验数据采用IBM SPSS Statistics 19软件进行数据分析。

2 结果 2.1 内生细菌的分离纯化及其多样性

枸杞各组织表面消毒后最后一次漂洗液涂布NA平板，28 °C培养72 h后未见菌落生长，说明组织表面消毒彻底。菌落计数结果表明，不同组织中定殖的内生细菌数量有明显差异。根部细菌密度大，数量多，叶中细菌数量次于根部，果实中细菌数量最少。通过对菌株的培养特征和镜检结果进行归类，本研究从枸杞根皮、花、叶、果中共分离内生细菌34株。菌株编号见表1。

结合菌落形态特征和ARDRA分型结果，选择27株代表菌株进行测序，序列拼接后获得长度为1 300-1 400 bp左右的序列。将27株枸杞内生细菌16S rRNA基因序列提交至GenBank，获得序列号KJ605123-KJ605132、KJ751509、KJ605134- KJ605143、KM355774-KM355779。序列分析结果表明，枸杞内生细菌分属于7科11属，多样性丰富，其中芽孢杆菌属Bacillus为优势类群，也是各药用组织中的共有属。内生细菌的群落组成和多样性存在明显的组织特异性。花中分离出的内生细菌种类最多，分布于7个属，黄单胞菌属Xanthomonas、Terribacillus为花的特有属；根皮内生菌分布于5个属，短波单胞菌Brevundimona为特有属；叶部内生细菌分布于4个属，葡萄球菌属Staphylococcus为特有属；果实中的内生菌分属于3个属，其中泛菌属Pantoea是特有属。副球菌属Paracoccus、Oceanobacillus是根皮和花的共有属，寡养单胞菌属Stenotrophomona为叶和花共有属，不动杆菌属Acinetobacter为根皮和叶的共有属。芽孢杆菌在根皮和花中占绝对优势。以各菌株16S rRNA基因序列构建的系统发育树如图1所示。

2.2 枸杞内生细菌的抑菌活性

采用改进的牛津杯法对34株内生细菌的抑菌活性进行测定，结果见表2。

表2表明，在测定的34株内生细菌中，至少有26株菌表现出不同程度的抑菌活性，占测定菌株的76.5%。其中属于芽孢杆菌属的菌株R2、R7和属于短波单胞菌属的菌株R3对玉米大斑和番茄炭疽的抑菌效果比较明显；属于寡养单胞菌属的L5与F5对番茄炭疽的拮抗作用较明显；泛菌属的菌株G7仅对小麦赤霉病菌表现出较强的抑制活性；芽孢杆菌L3则对各指示菌均表现出相对较强抑制活性。总体上看枸杞内生菌对植物病原真菌的拮抗作用较强，芽孢杆菌的抑菌活性强于其他类群，但几乎所有菌株对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的拮抗作用相对比较弱，部分抑菌效果见图2。

3 讨论

已有研究证实，内生菌的分布特征和群落结构不仅受宿主植物基因型的影响，还受外界环境因子的影响。即使是同一种植物，不同组织中内生细菌的种类和数量也不尽相同，存在复杂的多样性^[5,12,13]。本研究运用16S rRNA基因序列分析法对宁夏枸杞各部分组织内生细菌多样性进行了分析，结果表明分离的34株内生细菌分属于7科11属，多样性较丰富，不同组织中内生细菌的种类和数量均有差异。Rosenblueth认为内生菌在植株体内的分布通常下部组织多于上部组织，越往植株顶部，内生菌越少^[14]。目前对植物可培养内生细菌的分离结果表明，内生细菌在林木组织中以根部最多，茎部次之，叶部较少，而在一年生和多年生的经济作物中，根部最多，叶茎中数量相近^[15]。本研究表明宁夏枸杞根部细菌密度大，数量多，叶次之，花和果实中细菌数量最少，与已有的研究结果基本一致。而在种群分布上，枸杞花中内生细菌的多样性较其他部位更加丰富，分布于7个属，有2个特有属。内生菌分布的组织特异性可能与其进入宿主植物的方式和位点有关。目前普遍认为土壤是内生菌的主要来源，土壤内微生物进入宿主后随着蒸腾作用沿着维管束由地下部分逐渐向地上部位扩增，因而地下部位内生菌的数量多于地上部位；而宿主植物的地上部位接触环境的多样性又比地下部位丰富，进而影响微生物群落的多样性；环境中的微生物一般会沿着植物的气孔、水孔及伤口等破损处进入植物选择合适的营养和生态位定殖，造成地上部位内生菌的种类多于地下部位^[16]。

序列分析表明枸杞内生细菌大多属于土壤土著细菌，如芽孢杆菌属、假单胞菌属、泛菌属等，其中芽孢杆菌属细菌是宁夏枸杞分离频率最高的菌群，该属分布于枸杞所有组织中，属于优势类群，这与目前一些学者对甘草、春兰根等中草药内生细菌研究结果相一致^[5,17]。已有研究表明多种芽孢杆菌属的细菌通过竞争营养空间、产生脂肽类抗生素、诱导植物系统抗性等作用对植物病原菌产生广谱抗性^[18]；枸杞内生细菌的抑菌试验表明，不同菌株的抑菌活性存在很大差别，其中有4株芽孢杆菌对植物病原菌有较强的拮抗活性，这与山苍子、茄科作物及荔枝等植物内生菌的拮抗效果相一致^[19,20,21]；而几乎所有菌株对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抑菌效应都不明显，这与赵赟鑫等对中国红豆杉内生菌的研究结果不同^[22]，这表明不同宿源的内生菌其代谢产物的抑菌效应存在显著差异，这可能与宿主植物的种类及所处地域环境、气候等因素相关。

宁夏枸杞因药材质量上乘而成为宁夏乃至全国的道地性药材^[23]，而药材品质对内生菌种群多样性及其生态分布均有影响，种群结构差异产生功能多样性。本实验通过16S rRNA序列分析，发现枸杞内生细菌与许多具有重要生物学功能的细菌有着很高的同源性。如芽孢杆菌属、假单胞菌属的许多菌株可以分泌吲哚乙酸或赤霉素等，能有效促进植物的生长、抑制多种病原菌活性、显著提高植物的抗病性^[24,25]；Oceanobacillus对植物耐盐碱环境的适应机制有一定的协同调节作用；寡养单胞菌属的一些菌可降解有机农药等多种有机污染物，有些还具有硝化反硝化、解磷聚磷等生物活性^[26]；泛菌属中的一些种具有较高的固氮、溶磷、植物激素生产和铁载体合成等植物促生活性^[27]。对内生菌而言，药材基因型和同种异质是一种选择性压力，并通过影响内生菌的种群结构和分布而产生功能的多样性，不同功能的内生菌群再以各自不同的方式影响着药材性状、生长以及有效成分的积累等，最终导致道地药材与非道地药材品质的差异。同时，特异性的植物内生菌可提高植物对生物或非生物胁迫的抵抗力促进植物的生长发育和增强植物的抗逆性。现代研究表明，内生菌在与植物协同进化过程中，不但自身能够产生特殊的化学物质，还能诱导宿主植物次生代谢产物的合成和积累，作为传统的药食两用经济植物，道地药材宁夏枸杞所具有的药用价值和耐盐抗旱的逆境品质是否与其体内定殖的内生细菌有关，这些内生细菌是通过何种途径作用于宿主植物的，有待于进一步研究。