被毛孢属HirsutellaPat.是以嗜虫被毛孢Hirsutellaentomophila Pat.作为模式种而建立。该属主要特征为：孢梗束一般柱状、丝状，单生或分枝，有或无；菌丝通常无色、淡色或深褐色；产孢细胞散生于菌丝体上或者侧生于孢梗束外围菌丝上，表面光滑或粗糙，颈部简单或再育成多个小颈，颈部一般直，部分种可呈螺旋状或波浪状；分生孢子单细胞，少数多细胞，一般为柠檬形、椭圆形、梭形、橘瓣形等，经常埋于无色或有色的黏液层中；少数种还可形成二次分生孢子^[1]。迄今，Index Fungorum (http://www.indexfungorum.org)收录的被毛孢共有109个分类单元。被毛孢属有4个种与本文描述的新记录种接近，并具有两型产孢细胞且锥形产孢细胞长度大于40 μm，分别是H. stilbelliformis var. stilbelliformis H. C. Evans & Samson、H. stilbelliformis var. dolichoderi H. C. Evans & Samson^[2]、H. sporodochialis H. C. Evans & Samson^[3]、H. Zhangjiajiensis Z. Q. Liang^[4]。

被毛孢属的寄主范围很广，包括蜘蛛、螨类、昆虫等节肢动物和线虫，具有潜在的生物防治价值^{[5, 6, 7]}。20世纪80年代早期发现H. rhossiliensis Minter & B. L. Brady对许多植物的寄生线虫如茎线虫、根结线虫等有较强的致死效果^{[8, 9]}；H. citriformis Speare对果园中的柑橘木虱有很好的防治效果^[10]。被毛孢属的有性阶段为线形虫草属Ophiocordyceps(Petch) Sung et al^[11]，虫草是亚洲许多国家的传统药物，因此被毛孢属真菌中的活性物质也受到医药开发研究者的关注。研究表明一些被毛孢能产生各种对人类有价值的活性化合物，这些化合物具有抗肿瘤和抗疟疾的功效^{[12, 13]}。

目前，已报道的无性型是被毛孢的线形虫草，共有27个种^[11]。巨针线形虫草Ophiocordyceps macroacicularis S. Ban, T. Sakane & Nakagiri是最近被报道的一个具有被毛孢无性型的线形虫草属新种^[14]。其特征为：子座丛生，圆柱形，无分枝(97.2−166.1) mm×(1.3−2.4) mm；子囊壳垂直表生，卵形，淡褐色到棕色，(410−760) μm×(260−420) μm；子囊透明，圆柱形，长235−310 μm，子囊帽显著增厚，直径5.0−7.0 μm；子囊孢子针形的，具隔，透明，(200−300) μm×(2.3−3.0) μm。同时，文中明确指出巨针线形虫草的无性阶段是被毛孢并提供了图片，但没有对无性阶段进行详细描述，也没有与其它已发表被毛孢种类进行比较。本文从形态分类鉴定的角度对其无性阶段进行了鉴定和描述，讨论了该种与被毛孢属中其它相关种的区别，为该虫草的正确分类提供了无性阶段的鉴定证据。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 标本：标本采自贵州省贵阳市桐木岭(26°23'00.3"N，106°40'33.0"E)，寄主为蝠蛾科幼虫。标本编号：Dxhir140901；采集人：周叶鸣、瞿娇娇；采集时间：2014年9月。菌株编号：Gzuifr-hir140901，现保存于贵州大学真菌资源研究所菌种保藏中心(GZAC)。

1.1.2 培养基与染色液：PDA培养基：马铃薯200 g切块，用水煮沸30 min，过滤取汁，加葡萄糖20 g，水补足1 000 mL，pH自然，1×10⁵ Pa灭菌30 min，凝固前加入链霉素和青霉素，倒平板备用。棉蓝染色液：苯胺蓝0.025 g，乳酸10 g，石炭酸10 g，甘油20 g，蒸馏水10 mL。配制后用双层搽镜纸过滤后备用。

1.1.3 分子系统学分析所用序列：将菌株Gzuifr-hir140901测序得到的ITS1-5.8S-ITS2核酸序列经NCBI的BLAST程序进行比对，下载相似度大于93%的核酸序列以及被毛孢属和线形虫草属的部分真菌序列。表 1为本研究用于分子系统学分析的序列。

1.2 方法 1.2.1 菌株的分离、培养与形态鉴定：标本先用自来水将虫体表面冲洗干净，再用无菌水冲洗标本，接着用75%的乙醇表面消毒3−5 s。掰断标本虫体部分，用接种针挑取虫体断面的血体腔部位的组织块，接种到加有抗生素的PDA平板上，16 °C培养30 d。培养好的菌落，用透明胶带黏取菌落边缘的菌丝及产孢结构，95%乙醇固定后，用棉兰染色30 min以上，显微镜下观察描述并进行形态鉴定。

1.2.2 nrDNA的扩增和测序：从PDA平板上挑取菌丝体，根据Tigano-Milani等的方法提取总DNA^[15]。提取的DNA置于−20 °C保存，选用通用引物ITS5 (5′-GGTGAGAGATTTCTGTG-3′)和ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)扩增ITS区的nrDNA。反应体系(25 μL)：ddH₂O 8.5 μL，模板(10−100 mg/L) 2 μL，引物ITS4和ITS5 (0.4 μmol/L)均为1 μL，master mix为12.5 μL。PCR反应条件：94 °C 5 min；94 °C 40 s，49 °C 40 s，72 °C 60 s，35个循环；72 °C 10 min。PCR产物送上海Invitrogen公司测序。

1.2.3 分子系统学与拆分网络分析：用MEGA 5.2对序列进行对齐剪切后构建系统发育树，运行条件为邻接法(Neighbor-Joining)，运算次数(Replications) 1 000次^[16]。采用Splits Tree 4构建折分网络图，所用序列保存为Fasta格式，运行条件为P-distance，Unrooted Neighor Net。用与被毛孢属亲缘关系较近的球孢白僵菌Beauveria bassiana (Bals. -Criv.) Vuill.作为外群。

2 结果 2.1 形态鉴定与描述

巨针线形虫草的无性阶段 图 1

The anamorph of Ophiocordyceps macroacicularis Ban, T. Sakane & Nakagiri Figure 1

The fungus hardly grow above 30 °C while growing slowly under 16 °C on the PDA agar, and colonies diam up to 25−30 mm after 30 d. The colonies margin be white and the middle light-brown part with cashmere. Mycelium is hyaline, smooth, septate, wide 3.6−4.5 μm. Two bottles of terrier type were formed, A-phialides, column, (1.8−6.3) μm×1.8 μm. B-phialides, columnar base, awl-shap and tapers, width of base 3−3.8 μm, length 21−63 μm, width of neck 1.8−2.0 μm; Phialides formed directly from the mycelium end, occasional polyphialidic. Conidia orange segments or oval, (8.1−10.8) μm×(2.7−5.4) μm, enveloped in a hyaline mucus, thickness 1.8−2.7 μm.

Teleomorph: Ophiocordyceps macroacicularis Ban, T. Sakane & Nakagiri.

Host: Larva of a species of Hepialidae, Lepidoptera.

Specimen examined: Dxhir140901, 2014, Y. M. Zhou & J. J. Qu collected from the Tongmuling of Guiyang city, Guizhou province and Gzuifr-hir140901, strains were isolated by Y. M. Zhou conserved in the Insititute of fungal resource, Guizhou University.

菌落：在PDA上，30 °C以上不生长，16 °C培养30 d菌落直径25−30 mm。毡状，边缘白色，中间灰褐色有凸起，凸起处有绒毛，背面浅褐色；菌丝：透明、光滑、具隔，宽3.6−4.5 μm；产孢细胞：与菌丝无明显区分；形成两种类型产孢细胞，A型：柱状，(1.8−6.3) μm×1.8 μm。B型：锥形，基部柱状宽3−3.8 μm，向上逐渐变细，长21−63 μm，颈部宽1.8−2.0 μm。菌丝末端可形成产孢细胞，有再育现象；分生孢子：橘瓣状或卵型，(8.1−10.8) μm×(2.7−5.4) μm，孢子外具粘液，厚度为1.8−2.7 μm。

有性阶段：Ophiocordyceps macroacicularis S. Ban，T. Sakane & Nakagiri。

寄主：鳞翅目，蝠蛾科幼虫。

标本：标本Dxhir140901及其分离株Gzuifr- hir140901均保存于贵州大学真菌资源研究所菌种保藏中心(GZAC)。

2.2 分子系统学与拆分网络分析结果

系统发育分析(图 2)发现，菌株Gzuifr- hir140901与Ophiocordyceps macroacicularis聚在同一分支，支持率为98%，且与其他的被毛孢相比又独立分支。用Splits Tree 4构建的拆分网络图(图 3)展示了与系统发育树相似的结果。在网络中连接Gzuifr-hir140901的拆分图像，表明了它与Ophiocordyceps macroacicularis基本相同且与相关群存在明显差别。折分网络分析支持了系统发育树(图 2)展示的结果。系统发育树(图 2) A分支中的线形虫草的无性型皆为被毛孢，且基本都寄生于鳞翅目幼虫，寄生线虫的H. minnesotensis Minter & B. L. Brady和分离自植物的H. uncinata Seifert & H. Boulay未见有关它们有性阶段的报道；B分支的被毛孢属种类具有一个共同的形态学特征，它们的产孢细胞颈部具有螺旋。

3 结论与讨论

Evans & Samson (1982, 1984)报道了一些具有两型产孢细胞的种，A型在菌丝的侧面生长，菌丝与产孢细胞之间有一个压实的层；B型(锥形)多长在菌丝的末端^{[2, 3]}。拥有锥形产孢细胞且长度最大的、大于40 μm的被毛孢(表 2)有Hirsutella aphidis petch^[13]，H. besseyi E. E. Fisher^[17]，H. darwinii Evans & Samson^[2]，H. guignardii (Maheu) Samson et al^[3]，H. sinensis Liu et al^[18]，H. stilbelliformis var. dolichoderi H. C. Evans & Samson, H. stilbelliformis var. stilbelliformis H. C. Evans & Samson^[2]，H. sporodochialis H. C. Evans & Samson^[3]，H. zhangjiajiensis Z. Q. Liang^[4]，H. danubiensis Bałazy et al, H. vandergeestii Bałazy et al^[19]。同时具有两型瓶梗的种为H. stilbelliformis var. stilbelliformis H. C. Evans & Samson，H. stilbelliformis var. dolichoderi H. C. Evans & Samson，H. sporodochialis H. C. Evans & Samson，H. zhangjiajiensis Z. Q. Liang。H. stilbelliformis var. stilbelliformis和H. stilbelliformis var. dolichoderi 寄生膜翅目，H. zhangjiajiensis寄生蛹。目前都没有关于短小柱状瓶梗的报道。

系统发育树被广泛应用在分析、解释各级分类阶元的系统学关系，但其不能展示物种在进化过程中，杂交重组、基因水平转移和基因重复缺失等进化事件。进化网络分析可以较好地解决这个问题^[20]，它能提供一个传统进化树不能展示的、被平行事件掩盖的系统发育关系图像^{[21, 22, 23]}。根据分子系统学(图 2)和系统进化(图 3)分析结果，菌株Gzuifr-hir14090可能为巨针线形虫草O.macroacicularis的无性阶段得到了很好的支持。经过与巨针线形虫草文献^[14]中的无性阶段形态比较(表 2)，二者基本相同。

综上所述，标本Dxhir140901及其分离菌株Gzuifr-hir140901确定为巨针线形虫草O. macroacicularis S. Ban, T. Sakane & Nakagiri的无性阶段，为中国的新记录种。