自Deisenhofer等首次解析了不产氧光合细菌(APB)绿色绿芽菌(Blastochloris viridis)的光反应中心(RC)晶体结构以来^[1]，光合作用机理研究取得重大突破，APB光合机构(色素蛋白复合体，PPC)的环境适应性调控机制也成为光合作用研究的热点。APB的光合机构主要包括光反应中心(RC)、中心捕光复合体(LH1)和外周捕光复合体(LH2)，其中LH2主要执行光能的捕获和传递，RC-LH1主要进行光能的转化。在细胞中RC-LH1具有较恒定的化学计量比，而LH2数量和分布呈现多样性，与细菌的环境适应性密切相关。LH2是由跨膜脱辅基蛋白、细菌叶绿素(BChl)和类胡萝卜素(Car)组成的超分子复合物，其中Car具有光保护、捕获和传递光能功能，在维系光合机构的稳定性方面也发挥重要作用^[2]，Car与邻近BChl保持优化的相对取向和分子构型，有利于Car和BChl之间的Förster和Dexter能量传递^[3]。PPC中Car的组成和含量依菌种(株)和环境因素的变化而呈现高度多样性，深入研究PPC中Car种类与光能吸收与传递的关系和规律，对于诠释光合作用能量传递机制以及APB环境适应性机制具有重要意义。

LH2中Car介导的能量传递效率不仅与Car构象有关，也与Car共轭长度(共轭双键数目，N)有关^{[2, 4, 5, 6]}。例如，Papagiannakis等^[6]、Kakitani等^[7]与Hayashi等^[8]研究表明，LH2中Car介导的能量传递效率与Car构象有关，LH2中Car可以呈平面构象，也可以是扭曲构象，这与LH2的脱辅基蛋白结构有关，脱辅基蛋白在决定Car-BChl单线态能量传递效率中起重要作用，平面构象的Car有利于能量在Car-BChl之间传递，比Car扭曲构象的LH2具有更高的能量传递效率。Kosumi等^[5]、Papagiannakis等^[6]、Koyama等^[9]、Polívka等^[10]、Frank等^[11]和Desamero等^[12]研究表明，LH2中Car介导的能量传递效率与Car共轭长度有关，共轭长度短的Car主要用于捕光和能量传递，共轭长度长的Car主要作用是维持结构稳定和光保护，即能量传递效率与Car共轭长度呈负相关关系。我们知道，不同物种的LH2中，除了脱辅基蛋白存在差异外，Car种类多种多样，不仅共轭长度的不同，取代基也不同，如−OH、−OCH₃、−C=O等，使Car的极性也具有明显的差异。LH2中具有不同取代基、不同极性和不同共轭长度Car与能量传递效率关系目前还不明确，仍需要进行深入研究。

固氮红细菌(Rhodobacter azotoformans, Rba.azotoformans)能量代谢方式灵活多样，本课题组前期研究表明，该菌株在光照厌氧条件下LH2中Car成分95%以上为球形烯^[13]。基于此，本文选用Rba.azotoformans 134K20菌株为材料，获得了主要含一种Car的LH2，通过在培养基中添加二苯胺(DPA)，获得了缺失部分Car的LH2，将源自3种APB的具有不同共轭长度、极性和取代基的3种Car分别与缺失部分Car的LH2重组，分析了Car的组装率、构象以及3种Car对重组LH2能量传递效率的影响。这对于揭示Car在光能传递中的控制作用和PPC环境适应性机制具有重要参考价值。

134K20和CQV97菌株的培养采用改良的Ormerod培养基^[14]，以2.46 g/L乙酸钠作碳源，氮源分别1.0 g/L谷氨酸钠(134K20)和1.32 g/L硫酸铵(CQV97)。283-1菌株的培养采用紫色硫细菌无机选择性培养基^[15]。培养条件均为3 000 lx，30 °C。

本文采用TLC法^[16]和HPLC^[13]分别从134K20、CQV97和283-1中纯化获得了球形烯(spheroidene，SE)、玫红品(rhodopin，RP)和奥氏酮(Okenone，OK) 3种Car^{[16, 17, 18]}。

以乙醇为溶剂，配制5.0 mmol/L DPA储备液，然后添加至培养基中，使其终浓度为100 μmol/L，同时以乙醇溶剂为对照。按1.0%接种134K20菌种后，于3 000 lx、30 °C条件下光照厌氧培养7 d。LH2的分离纯化采用硫酸铵分级分离结合阴离子交换层析法^[19]，收集层析洗脱样品并扫描吸收光谱。

Car和缺失部分Car LH2 (LC-LH2)的组装参照文献[11, 12]并稍作修改：室温条件下，取1 ml OD₈₅₀约为1.0的LC-LH2溶液，加入50 μl Car乙醚溶液，使其轻铺于LC-LH2溶液表面，用氮气轻吹溶液表面，使乙醚溶剂挥发，混合液在黑暗冰浴条件下超声处理10 min，8 000 ×g离心10 min，测定组装体系的吸收光谱。上述组装过程重复5次，同时设置乙醚溶剂对照。

参照文献[20, 21]采用荧光激发光谱的方法测定Car组装率：固定发射光谱波长为860 nm，扫描激发光谱，用480 nm (Car)和590 nm (BChl)激发光谱强度的比值(I₄₈₀/I₅₉₀)表示具有能量传递活性Car的含量，以野生型LH2 Car含量为100%，计算组装LH2 (N-LH2)和LC-LH2中Car相对含量，N-LH2和LC-LH2中Car相对含量的差值，即为Car的组装率。

参考文献[22]通过离子交换层析除去混合液中未与LH2结合的Car，测定重组LH2吸收光谱和荧光光谱，将OD₈₅₀约为0.6的LH2的荧光激发光谱和吸收光谱在BChl Qx吸收峰590 nm处归一。采用Cogdell等估算LH2中Car到BChl能量传递效率的方法^{[4, 21]}，计算Car 3个特征峰吸光度和激发光谱强度的比例，这3个比值的平均值即为LH2中单线态Car到BChl的能量传递效率。

0.1% LDAO、pH 8.0的10 mmol/L Tris-HCl缓冲液中测定LH2的吸收光谱、共聚焦拉曼光谱和荧光激发光谱。吸收光谱测定：使用光程为1 cm石英比色杯，于紫外可见分光光度计进行波长扫描。共聚焦拉曼光谱测定：取OD₈₅₀约为1.0的LH2于石英比色杯中，置于载物台物镜视野下，调节焦距，激光聚焦于液体表面。激光光源为Nd:YAG激光器，光栅为2 400 L/min，激发波长为532 nm，输出功率50 mW，使用50%激发功率，步长为1 cm⁻¹，精密度为1 cm⁻¹。采用紫外增强CCD探测器，扫描范围在855−1 993 cm⁻¹，曝光时间为10 s，累积次数为3。荧光激发光谱的测定：取OD₈₅₀约为0.6的LH2溶液于光程1 cm荧光比色杯中，激发光和发射光狭缝均为5.0 nm，以860 nm为发射波长，扫描激发光谱。

分别从未添加和添加100 μmol/L DPA培养的134K20细胞中分离纯化LH2，将制备的LH2浓度调整至OD₈₅₀约为0.5，测定吸收光谱，如图 1所示。这2种LH2中BChl 800 nm和850 nm Qy带、590 nm Qx带以及374 nm soret带吸光度没有明确的变化，表明这2种LH2均为结构完整的LH2^[23]，添加DPA处理后，纯化的LH2仍然具有明显的Car特征吸收峰，但吸光度明显降低，表明这种LH2中Car含量明显降低。因此，获得了缺失部分Car的LH2 (简称LC-LH2)。

图 1 　纯化的2种LH的吸收光谱 Figure 1 　Absorption spectra of 2 types of purified LH2 Note: CK: The LH2 purified from strain 134K20 supplied without DPA; LC-LH2: The LH2 purified from strain 134K20 supplied with 100 μmol/L DPA.

图选项

前期研究表明，134K20、CQV97和283-1菌株主要积累的Car分别为球形烯(SE)、玫红品(RP)和奥氏酮(OK)^{[13, 16, 24]}，这3种Car共轭双键数目(N)分别为10、11和12，取代基分别为−OCH₃ (SE)、−OH (RP)、苯环和−C=O (OK)，极性由高到低的顺序依次为RP、OK和SE。图 2显示了134K20、CQV97和283-1 3个菌株光合色素的TLC图谱(A1、B1、C1)、纯化获得的球形烯(SE)、玫红品(RP)、奥氏酮(OK) 3种Car的吸收图谱(A2、B2、C2)和HPLC分析结果(A3、B3、C3)。SE特征峰位于345、430、452和483 nm处，RP特征峰位于360、447、473和502 nm处，OK特征峰位于309、377、457、483和511 nm处，与文献报道^{[17, 18, 25]}相吻合。HPLC分析，这3种Car均呈单一的色谱峰，表明制备的3种Car纯度较高。

图 2 　3个菌株光合色素TLC图谱，SE、RP和OK 3种Car的吸收光谱及其HPLC分析 Figure 2 　Profiles of pigment fingerprints on TLC from 134K20, CQV97 and 283-1 (A1, B1, C1), absorption spectra(A2, B2, C2) and HPCL analysis (A3, B3, C3) of SE, RP and OK

图选项

随着LC-LH2溶液中加入Car次数增加，Car区400-550 nm的吸收峰逐渐升高，添加至第5次时，Car特征吸收峰强度不再继续升高，表明组装反应达到平衡，如图 3所示。Car区吸收峰升高，并不能说明Car完全结合到LH2上活性结合位点，可能还存在着没有能量传递活性的结合态Car^[12]，因此，进一步采用荧光激发光谱估算了重组LH2中具有能量传递活性的Car的组装率，结果见表 1。以未添加DPA (对照)提取的LH2中的Car为100%，经过添加DPA处理，LH2中Car含量降低，与对照LH2相比，Car降低了64.7%。SE、RP和OK与LC-LH2组装，它们的组装率分别为29.4%、24.0%和29.4%。结果表明，Car能够组装到LH2中，不同的Car组装率有一定的差异。

图 3 　SE、RP和OK与LC-LH2组装过程的吸收光谱 Figure 3 　Absorption spectra of reconstruction between LC-LH2 and the Cars of SE, RP and OK Note: CK: No Car added; 1-5: The total number of times Car added.

图选项

色素蛋白复合体中的Car分子可以产生强的拉曼信号，这些拉曼信号的变化可反映出LH2复合体中Car分子结构和构象的变化^[6]。在室温下，复合体中Car的共振拉曼光谱一般可分为4个区域：约1 520 cm⁻¹ (ν1模式)、1 160 cm⁻¹ (ν2模式)、1 010 cm⁻¹ (ν3模式)和950 cm⁻¹(ν4模式)，分别归因于Car分子中C=C共轭双键的伸缩振动、C-C键的伸展振动、C-CH₃弯曲振动和C−H振动^{[2, 6]}。与对照LH2相比(图 4)，组装外源Car后，组装LH2中ν2、ν3和ν4域处的拉曼峰没有明显变化，而ν1域处的拉曼峰发生不同程度的位移。当组装Car为SE (N=10)时，1 515 cm⁻¹ (ν1区)处拉曼信号未见明显变化，与LC-LH2中Car相同；随着组装Car共轭长度的增加，ν1拉曼峰左移约5 cm⁻¹，OK左移幅度大于RP，表明主要是Car分子中C=C数量增多的缘故，这与文献报道相吻合^[12]。所有组装LH2在956 cm⁻¹(ν4区)处均产生较弱的拉曼峰，该峰值较弱表明Car 中C−H键在一个平面上，是采取平面构象方式结合在LC-LH2上，而不是呈扭曲构象。由于这些Car均采用同样构象方式结合在LH2上，因此，在下面研究不同Car对组装N-LH2能量传递效率影响时，可以忽略Car构象的影响。

图 4 　组装LH2和对照组LH2的共振拉曼光谱 Figure 4 　Resonance Raman spectra of LC-LH2 (CK) and the LC-LH2 with SE, RP and OK incorporated

图选项

组装LH2在590 nm处归一化处理的吸收光谱和荧光激发光谱如图 5所示。参照Cogdell方法^{[4, 21]}计算了组装LH2中总Car到BChl的能量传递效率，组装LH2 (N-LH2)与缺失部分Car LH2 (LC-LH2)中Car能量传递效率的差值即为重组Car能量传递效率；重组Car能量传递效率与重组Car相对含量的比值，即为单位重组Car能量传递效率。组装LH2中总Car、重组Car和单位重组Car能量传递效率如表 2所示。结果表明，与缺失部分Car LH2相比，由于组装LH2中Car含量升高，能量传递效率明显升高，但组装LH2的能量传递效率明显低于未缺失Car的LH2，其原因可能是由于组装LH2中Car含量仍然低于未缺失Car LH2中的Car。由于Car含量不同，Car在LH2中的能量传递效率也不同，因此，采用了单位Car含量(1.0%)来比较重组Car能量传递效率。组装LH2中单位Car能量传递效率由高到低的顺序依次为SE、RP和OK，这3种Car共轭体系的大小关系依次为SE (11)、RP (12)和OK (13)，极性由高到低的顺序是RP (含羟基基团)、OK (含酮基基团)和SE (含甲氧基基团)。由此可见，随着共轭体系增大，这3种Car能量传递效率依次降低，这与文献报道的LH2中Car到BChl能量传递效率与Car共轭长度呈负相关的结论一致^[12]。随着极性的升高，能量传递效率不呈规律性的变化，表明Car取代基和极性的不同，对能量传递的影响较小，能量传递效率主要与Car共轭体系的大小有关。

图 5 　组装LH2中Car到BChl的能量传递效率分析 Figure 5 　 Analysis of Car-BChl energy transfer in LC-LH2 (CK) and the LC-LH2 with SE, RP and OK incorporated Note: The fluorescence excitation spectra (2) were normalized to the absorption spectra (1) at the 590 nm.

图选项

在体外很难将Car从LH2中拆分出来^[26]，目前主要通过敲除Car合成酶基因^[12]或使用DPA抑制Car合成^{[8, 27, 28]}这两种途径获得Car缺失的LH2。目前研究表明，尽管Car在维系LH2结构稳定中发挥重要作用，但在抑制Car合成条件下，一些菌株(如Allochromatium minutissimum^[28]、Ectothiorhodospira haloalkaliphila^[27]、Chromatiurn vinosurn^[8]等)仍能够合成Car缺失LH2。1989年，Hayashi等^[8]在培养基中添加DPA抑制Chromatiurn vinosurn Car合成，获得了Car缺失LH2，采用超声孵育法将来自Rba. sphaeroides 2.4.1 (野生型)的SE掺入到Chromatiurn vinosurn的Car缺失LH2中，分析了SE构象变化及与能量传递效率的关系。而在另外一些菌种(如Rps. palustris和Rps. acidophilus)中，培养基中添加DPA抑制Car合成，明显地抑制了LH2的合成，虽然也在这些菌种中获得了Car部分缺失的LH2^[29]，但未见到将外源Car体外重组到这种部分缺失Car LH2中的报道。本研究通过100 μmol/L DPA抑制134K20菌株Car合成，得到了Car部分缺失LH2。其Car含量约为正常LH2的35.3%。该LH2仍呈现LH2典型的近红外特征吸收光谱。进一步采用超声孵育条件，将来自不同菌株的SE、RP和OK 3种Car重组到这种Car部分缺失LH2中。这3种Car的重组率在24.0%−29.4%之间。本研究通过Car与部分缺失Car LH2重组的方法，比较研究了这3种Car在重组LH2中的能量传递效率。

现有研究表明，LH2中Car构象与分子内Car-BChl能量传递效率有关^{[6, 8]}，在LH2中Car呈现平面构象时能量传递效率较高，而呈现扭曲构象时传递效率较低。这一结论主要来自两方面实验证据：(1) 来自于不同菌株中某些Car占绝对优势(95%) LH2的比较。例如，Rba. sphaeroides LH2中Car呈现伸展的平面构象，而Chromatium vinosum和Rps. palustris LH2中Car呈现扭曲构象，前者的能量传递效率(75%−100%)^[21]明显高于后者(30%−60%)^[8]。(2) 来自于单一Car的体外重组LH2的比较。例如，Hayashi等^[8]将来自于Rba. sphaeroides的SE组装到来自于Chromatium vinosum的Car缺失LH2中，与Rba. sphaeroides LH2中Car呈现伸展的构象不同，重组SE在Chromatium vinosum LH2呈现扭曲的构象，二者相比，这种SE重组的LH2能量传递效率明显降低。本研究表明：Car部分缺失LC-LH2中，原有的SE (Car)呈平面构象，SE、RP和OK 3种重组的LH2中，重组的这3种Car也呈现较为伸展的平面构象。这一研究结果与文献报道一致^{[6, 8]}，也即相同的LH2蛋白亚基，掺入异源Car的构象也相同。鉴于这3种Car共轭体系、取代基和极性均不相同，而且在重组LH2中均呈现平面构象，因此，在重组的LH2中进一步比较了这3种Car到BChl的能量传递效率。

Car共轭长度对LH2能量传递效率影响的研究已有很多报道。Desamero等^[12]和Frank等^[11]将来自Rba. sphaeroides 2.4.1的SE (N=10)以及合成共轭长度不同取代基团相同的6种SE类似物(N=7、8、9、11、12、13)，通过超声孵育法组装到Car缺失的Rba. sphaeroides R-26.1的LH2中，与2.4.1菌株的LH2相比，重组Car的LH2能量传递效率均降低，其中共轭长度(N)为9时，Car能量传递效率最高，当N>9时，Cars能量传递效率与共轭长度呈负相关，而当N<9时，Cars能量传递效率与共轭长度呈正相关。Polivka等^[30]研究表明，LH2中Car为SE(N=10)时，其能量传递效率约为90%，而替换为含有酮基的球形烯酮Car (SO)时，能量传递效率降低至80%。这提示：与SE相比，SO羰基基团的引入，共轭长度的增加，其能量传递效率降低，但SO极性也增大。Car极性是否影响Car传递效率尚不明确。2014年，Kosumi等^[5]将来自于Rba. sphaeroides 2.4.1 (含SE，N=10)、Rps. acidophila 10050 (含糖苷-玫红品，N=11)和Roseospira goensis (含3,4-双脱氢玫红品，N=12)的LH2进行了能量传递分析，其结果显示，随着Car共轭长度的增加，能量传递效率降低。从极性分析，这3种Car极性由高到低的顺序依次为糖苷-玫红品>3,4-双脱氢玫红品>球形烯，随着Car极性的减小，LH2能量传递效率规律是先降低后升高，没有呈现一致的变化规律。本研究选择了共轭长度分别为11、12和13且极性(取代基)明显不同的3种Car进行体外组装研究，研究结果与文献报道的LH2中Car到BChl能量传递效率与Car共轭长度(N>9时)呈负相关关系的规律一致，但随着极性的变化，能量传递效率规律也没有呈现一致的变化。由此可见，Car取代基和极性的不同，对能量传递活性的影响较小，能量传递活性主要取决于Car共轭长度。

综上所述，将共轭体系、取代基和极性不同的3种Car体外组装到Rba. azotoformans 134K20部分缺失Car LH2中，组装的Car均呈平面构象。Car共轭长度是决定组装LH2中Car-BChl能量传递效率的主要因素，即Car-BChl能量传递效率和Car共轭长度成负相关关系，而取代基和极性影响较小。本研究为阐明不同Car对LH2中Car-BChl能量传递的控制作用以及Car的环境适应性调控机制提供借鉴。