随着经济的快速发展和人口的迅速增长，人类生存环境面临着巨大的挑战，其中水资源紧缺正在逐渐成为制约我国可持续发展战略的主要因素之一。目前在工业化进程中，未经处理而排放的高盐废水对人们生活用水、工农业生产用水及江河湖泊等水体造成极大的污染，如能淡化高盐废水、提高废水利用率可有效缓解当今的用水压力^[1]。因此，高盐废水处理已成为目前的研究热点之一。

耐盐菌是生长在高盐环境中的微生物类群，根据它们对盐度需求和盐度耐受性的不同，可以将其分为轻度嗜盐菌、中度嗜盐菌和极端嗜盐菌^[2]。中度嗜盐菌的最适生长盐浓度为3%−5%，由于它有极强的环境适应能力，在自然界中分布又极为广泛^{[3, 4, 5]}，因此近些年研究者对于中度嗜盐菌在生物技术方面的潜在应用充满了浓厚的兴趣。国外研究者通过筛选驯化耐盐菌和嗜盐菌来降解苯酚、去除硝态氮、含硫化合物等，如Woolard等^[6]将一株从美国大盐湖中分离的中度嗜盐菌用于处理苯酚废水。国内也开展了这方面的研究，曲玲童^[7]从锦州腌渍小黄瓜中筛选到嗜盐微生物，并对该菌的发酵特性进行研究，在含7% NaCl的MRS培养基中32°C发酵培养20 h后，其产酸能力提高16.78%。李耀东等^[8]从青海湖中利用高效液相色谱技术获得5株具有四氢嘧啶高产潜力的野生菌株，其中中度嗜盐菌QHL5产四氢嘧啶最高产量达到0.325 μg/L，为相溶性物质的开发利用提供了依据。嗜盐菌在生物脱硫领域也有着举足轻重的作用，李琳等^[9]从胜利油田筛选分离出6株具有二苯并噻吩降解能力的中度嗜盐菌，其中SL-4菌株在5%的盐度条件下对二丙苯噻吩的降解率可达37.2%。崔小华等^[10]从青岛东风盐场分离到一株嗜盐紫色硫细菌用于脱硫研究，Vallero等^[11]国外学者通过耐盐硫酸盐还原菌处理高盐含硫废水取得显著效果。因此利用嗜盐菌与新型生物工艺相结合处理高盐废水是国内外高盐废水处理领域的一个重要研究方向。

目前，国内外对嗜盐菌的研究主要集中在筛选分类、鉴定、耐盐机制、高盐有机废水处理等方面^{[12, 13]}，将耐盐菌应用于生物脱硫体系的报道较少。鉴于此，本研究从上海外高桥某发电厂冷却水池中分离到一株脱硫率高、耐盐特性较强的微生物，用于生物脱硫实验，为生物脱硫探求新的途径。

1 材料与方法 1.1 样品

从上海外高桥某发电厂冷却水池污泥取样，用于菌种分离。该水池水源来自长江与东海交融处，呈弱酸性、含盐量在1.5%左右。

1.2 培养基

富集培养基(g/L)^[14]：Na₂S₂O₃·5H₂O 10.0，K₂HPO₄ 4.0，KH₂PO₄ 4.0，MgSO₄·7H₂O 0.8，NH₄Cl 0.4，NaCl 1.0，微量元素溶液10.0 mL。

固体培养基：在富集培养基上加入1.8%−2.0%的琼脂。

微量元素溶液成分(g/L)：EDTA二钠50.0，ZnSO₄·7H₂O 22.0，CaCl₂ 5.5，MnCl₂·4H₂O 5.1，FeSO₄·7H₂O 5.0，(NH₄)₆MO₇O₂₄·4H₂O 1.1，CuSO₄ 5H₂O 1.6，CoCl₂·6H₂O 1.6。

1.3 耐盐硫氧化菌的分离与纯化 1.3.1 稀释污泥富集培养：取适量的污泥，倒入无菌水中，振荡使土样充分打散。然后将其接入富集培养基中，接种量约10%，在30°C下振荡培养4 d，以上述菌液为接种液富集2−3次。

1.3.2 平板划线分离：从待纯化分离的菌落中取少量菌样于培养皿中，用接种环在相应培养基平板中划线分离。在30°C恒温培养2−3 d，用于观察菌落特征，并转接入斜面保存，进行进一步的筛选实验。

1.3.3 菌株筛选培养：将分离获得的各菌株用接种环从斜面上挑取一环，接入装有相应培养基(100mL)的三角瓶(250 mL)中，置于回转式恒温摇瓶柜，于30°C、170 r/min条件下培养。接种后第2天溶液出现浑浊、呈乳白色、溶液pH下降。经过3次划线分离后，挑取单菌落接种于斜面培养基上，在4°C保存。

1.3.4 耐盐菌株的分离：把分离获得的细菌接种到氯化钠浓度分别为1%、3%、5%和7%的硫代硫酸钠培养基中，置于30 °C、170 r/min条件下培养。筛选分离出一株中度耐高效硫氧化菌，以备后用。

1.4 菌株生理学鉴定 1.4.1 菌落形态观察：观察菌株生成菌落的形态特点。观察内容主要有大小、形状、表面、质地和颜色等方面。其中，菌落的大小可量取其直径；形状指圆形或不规则形等；表面指凸起或平展、有无光泽以及是否光滑等；质地指粘、脆而言，可用接种针挑取菌落，试验是否容易挑取。

1.4.2 菌株形状观察：将菌株进行革兰氏染色后在光学显微镜下观察。观察内容主要区别革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、观察细菌的形状、菌体排列方式等^{[15, 16]}。

1.4.3 菌体特征观察：用日立H-7650透射电镜做菌体特征观察。步骤如下^[17]：(1) 用2.5% (体积比)的戊二醛固定收集的细胞样0.5 h，与1.25% (质量体积比)水质琼脂混合；(2) 将固定的琼脂制成1 mm的切片，继续固定0.5 h；(3) 把切片用磷酸缓冲液洗涤3次后固定于1% (质量体积比)四氧化锇的磷酸缓冲液中1 h；(4) 用超纯水漂洗切片，在1% (质量体积比)铀酰乙酸溶液中固定1 h；(5) 用乙醇和氧化丙烯进行梯度脱水，将琼脂切片植入环氧树脂；(6) 铀酰乙酸染色后用于电镜观察。

1.5 菌株分子生物学鉴定 1.5.1 基因组DNA的提取：采用从生工生物工程(上海)有限公司购买的小量细菌基因组DNA快速提取试剂盒提取该菌株的基因组DNA。

1.5.2 PCR扩增：细菌16S rRNA基因的PCR扩增。前端引物和后端引物分别为27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。50.0 μL扩增体系：10×Taq buffer 5.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.0 μL，基因组DNA 2.0 μL，10.0 μmol/L前端引物和后端引物各1.0 μL，rTaq酶0.5 μL，ddH₂O 39.5 μL。反应条件：94°C 10 min；94°C 45 s，55°C 45 s，72°C 90 s，共35个循环；72°C 10 min。

1.5.3 16S rRNA序列分析及系统发育树的构建：PCR产物进行B型小DNA片段凝胶电泳。测序工作由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。将菌株CYJN-1的16S rRNA序列采用NCBI的BLAST软件进行同源性比对，用ClustalX 1.81和MEGA 4.0软件构建系统发育树。

1.6 CYJN-1的生长特性研究 1.6.1 不同能源物质对CYJN-1生长的影响：为了确定CYJN-1菌株的最适能源物质，培养基中的硫代硫酸钠被下面的物质代替(g/L)：蛋白胨1.0，葡萄糖1.0，酵母提取物1.0，乳糖1.0，甘氨酸1.0，赖氨酸1.0，单质硫10.0，Na₂SO₃10.0，DBT (二丙苯噻吩，有机硫模式化合物) 0.01mmol/L。接种量5%，30 °C、170 r/min培养2 d，测定细胞浓度，将细胞浓度换算成菌落形成单位(Colony forming unit，CFU)。

1.6.2 不同温度和初始pH对CYJN-1生长的影响：适宜的温度和pH环境同样是硫细菌生长所必需的条件。微生物胞内酶和胞外酶的稳定性均受温度和pH值影响，过高过低直接影响菌种的生存及活力。为了确定细胞生长的最适温度和pH，CYJN-1菌株在不同温度(10、20、30、40、50°C)和不同初始pH值(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)的培养基中170 r/min培养2 d，测定细胞浓度。

1.6.3 不同底物浓度对CYJN-1生长的影响：向培养基中添加不同浓度的硫代硫酸钠，分别为5、10和20 g/L，调节起始pH为7.0。取100 mL培养基置于250 ml锥形瓶中，接种5%的菌液，在30 °C、170r/min条件下培养，每隔一段时间测定细胞浓度。

1.7 CYJN-1脱硫性能的测定

本研究采用Na₂S在空气中的主要氧化产物Na₂S₂O₃作为S²⁻的来源。摇瓶实验中，5%的接种量接种在100 mL含硫培养液中，最适培养条件下每12 h测定细胞浓度、S₂O₃²⁻浓度和SO₄²⁻浓度。

1.8 CYJN-1耐盐特性的研究

在基础培养基中加入一定比例的NaCl，形成不同的盐浓度梯度，梯度范围分别为0、1%、3%、5%和7%，在最适生长条件下测定脱硫菌的生长情况和硫酸盐脱除率。

1.9 检测方法 1.9.1 硫代硫酸钠的浓度的测定：底物硫代硫酸钠的浓度采用碘量滴定法测定^[18]。步骤如下：(1) 配制稀释溶液：取1 mL的培养液用水稀释至50 mL (稀释50倍)。(2) 在典量瓶中放入一份50 mL的溶液，加2 mL 17.5 mol/L醋酸和1 mL 1%的淀粉溶液。(3) 用0.01 mol/L浓度的碘液滴定至出现不消失的蓝色为止，滴定所消耗的碘量来计算S₂O₃²⁻的含量。

计算公式：Y=(V−V₀)×C×M×X×1 000/50，其中：Y：所含S₂O₃²⁻的量，单位为mg/L；C：滴定的碘液浓度，为0.01 mol/L；M：S₂O₃²⁻的分子量为112；50是所加溶液的体积，为50 mL；X是稀释倍数；V−V₀为滴定是所消耗的碘液体积。

1.9.2 硫酸根浓度的测定：所产生的硫酸根用铬酸钡比色法测定^[19]。步骤如下：(1)比色管中加入0.5 mL样品，并加4.5 mL的蒸馏水(测定标准曲线：5.0 mL水样，分别取7支比色管，分别加入0、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL Na₂SO₄，并加水至5.0 mL)。(2) 铬酸钡充分摇匀加2.5 mL，混合后静置3 min。(3) 加0.5 mL 6 mol/L的钙氨溶液，再加5 mL 1 mol/L的乙醇猛振1 min。(4) 慢性定量滤纸过滤，弃去最初5 mL，水做参比在420 nm处测定吸光度。(5) 用所测的OD₄₂₀值来从标准曲线上求出SO₄²⁻的含量。

1.9.3 单质硫的检测：单质硫的检测采用硫平衡法，公式为：C_S⁰=64.13/112.13△C_S2O3^2-−32.13/96.13△C_SO4^2-，其中，△C_S2O3^2-：硫代硫酸盐浓度的减少量；△C_SO4^2-：硫酸盐浓度的增加量。

2 结果与分析 2.1 耐盐高效硫氧化菌的筛选

硫代硫酸钠为筛选硫氧化细菌的唯一能源物质。富集培养2 d后培养液从透明变混浊，瓶底生成浅黄色絮状物，通过化学验证其为单质硫。本研究从上海某发电厂冷却水污泥中筛选得到4株耐盐特性较强的硫氧化菌，分别命名为CYJN-1、CYJN-2、CYJN-3和CYJN-4。在NaCl浓度分别为0、1%、3%、5%和7%的基础培养基中培养24 h，并测定硫代硫酸钠去除率，如图 1所示。可以看出这4株菌在不同盐度下都有一定的耐受性，菌株CYJN-1在0−3%的盐度下24 h内的硫酸盐脱除率在90%以上，在5%−7%的盐度下硫酸盐脱除率却不足20%。总体来看，菌株CYJN-1在不同盐度下的硫代硫酸盐脱除效率和生长状况较比其他3株强。因此，选用硫代硫酸钠去除率最高、耐盐特性较强的CYJN-1菌株进行脱硫潜力的研究。

2.2 CYJN-1菌株生理学鉴定与分析

如图 2和表 1所示，光学显微镜中的硫氧化菌CYJN-1细胞呈短杆状且运动活跃，革兰氏染色鉴定为阴性。菌落呈乳白色、反面颜色一致、菌落直径约为1.0 mm、小而突起、易挑起。采用透射电镜观察发现CYJN-1细胞平均长度为1.55±0.15 μm、宽度为0.65±0.10 μm。细胞有一层薄薄的荚膜，外围有长丝状的鞭毛。鞭毛可助于微生物在贫瘠的生活环境下寻找营养物质，荚膜有助于菌种吸附硫颗粒物表面获取有限的能源物质和抵御恶劣条件的胁迫。另有报道称，一种新型膜蛋白能够有效地促进细菌与能源物质之间的接触，从而使细胞更好地获得营养物质，更利于存活于这类极端环境^{[20, 21]}。预计这些独特的生理构造使菌体更好的适应自然环境下的脱硫体系。

2.3 CYJN-1分子生物学鉴定与分析

Kelly和Wood^[22]在2000年将硫杆菌中的一些种重新分类到新指定的属，其中嗜盐硫杆状菌属(Halothiobacillus)中包括3个种，其分别为那不勒斯菌(Thiobacillus neapolitanus)、盐土植物(Thiobacillus halophilus)和Thiobacillus hydrothermalis。我们对菌株CYJN-1的16S rRNA基因(1 452 bp)进行了测序，将16S rRNA基因序列在GenBank中与其他16株相关菌株进行比对，根据它们的16S rRNA基因序列建立系统发育树，如图 3所示。结果显示：系统发育树分成3组，CYJN-1菌株与盐硫杆状菌属中的菌株位于同一组。CYJN-1与H. neapolitanus (AB308268，99%)、H. neapolitanus(JF416645，98%)和H. neapolitanus (NR025943，98%)都有较高的序列相似性。排硫硫杆菌属和嗜酸硫杆菌属包括在第1组和第3组中，他们与CYJN-1菌的遗传相似性只有91%。因此，结合《伯杰氏细菌鉴定手册》中菌落、细胞形态和生理生化特性可以鉴定CYJN-1菌株为那不勒斯菌(H. neapolitanus)。

2.4 H. neapolitanus CYJN-1生长特性的研究 2.4.1 不同物质对CYJN-1生长的影响：在硫代硫酸钠培养基内，CO₂和S₂O₃²⁻分别是CYJN-1菌株生长的唯一碳源和能源物质，该菌株可以利用培养基中硫代硫酸盐中还原态硫氧化产生的能量化能生长。但菌株不能在任何单一的有机物培养基中异养生长，在硫代硫酸钠培养基中添加不同能源物质也不能促进菌株的生长，表明菌株CYJN-1是严格化能自养硫氧化微生物，如表 2所示。

2.4.2 温度和初始pH对CYJN-1生长的影响：适宜的温度环境是细菌生长所保证酶活性的重要条件之一，不同的温度对硫细菌的生长有明显的影响。从图 4可以看出，30°C和40°C的生长状况明显优于其他温度，CFU为1.4×10⁶ cells/mL，比较得知30°C为菌株最适生长温度。同样，不同的初始pH对菌体生长也有较大的影响，如图 5所示。总体来看，起始pH 4.0−9.0菌体均有生长，说明硫细菌对pH的耐受幅度较宽。菌体生长的最适初始pH为7.0，此时硫细菌CFU达到1.4×10⁶ cells/mL左右，pH在6.0−8.0时菌体仍有较好的生长，说明该菌生长的最适pH环境在中性左右，偏酸或偏碱对菌株生长都有抑制。

2.4.3 底物浓度对CYJN-1生长的影响：不同的底物浓度对CYJN-1的生长有较大的影响，从图 6中可以看出底物浓度为20 g/L时CFU为最高，达到1.55×10⁶ cells/mL，5 g/L时为最低，这是因为可供菌体利用的硫源限制了菌体的生长。对于底物充足的条件，存在着相对于微生物需求的潜在的过剩能源。对微生物来说，底物的消耗不能调整到恰好符合能量的需求，因此有时底物不能完全被利用，造成能量在生物体外流逝。当底物浓度充足时分解代谢和合成代谢的耦合效率降低，所以微生物需要更多的底物来满足自身所需的物质和能量，因此底物过多或过少都影响微生物的正常代谢^[23]。

2.5 H. neapolitanus CYJN-1脱硫特性的研究 2.5.1 CYJN-1菌株初步脱硫实验：以硫代硫酸钠为唯一能源底物的培养基里对CYJN-1进行初步的脱硫实验，其生长曲线和化学指标如图 7所示。可以看出，开始培养12 h内细胞处于适应环境的延滞期，菌株的生长缓慢，生长曲线呈平线状。在随后的12 h内，细胞进入指数增长期，生长旺盛，生长速度极快，细胞数量呈倍数增长，生长曲线徒然上升。此时，单质硫呈现迅速增长的趋势，最高可达0.83 g/L，硫代硫酸钠转化率在94%左右，这一结果高于排硫硫杆菌(Thiobacillus thioparus)的90%^[24]。这是由于细胞在延滞期后快速进入指数增长期，硫代硫酸盐被CYJN-1用作电子供体以获得能量，大部分的硫代硫酸盐中的还原态硫被氧化生成单质硫。因此，研究这一时期的环境和细菌的特点有助于提高脱硫效率和单质硫产量。培养40 h之后因培养基营养物质有限，而细胞数量过多，相互竞争，所以死亡的细胞数和新生的细胞数持平，进入平稳期。在培养过程中，硫代硫酸盐浓度的下降伴随着硫酸盐浓度的上升，这表明菌株CYJN-1以单质硫为中间代谢产物将硫代硫酸盐内−2价的硫氧化成硫酸盐，这与文献报道的硫化物生物氧化的相关途径相吻合^[25]，且与Gao等^[26]报道的硫氧化菌相比其氧化性能强、脱硫率高、自然条件的耐受性等方面也具有一定的优势。

2.5.2 CYJN-1脱硫生成单质硫的观察：在硫代硫酸钠培养基中CYJN-1培养一定时间后在培养基底部可观察到单质硫的积累。将产生的硫通过干燥收集后得到固体为淡单色、有较强的硫磺味、易结块、比商品硫磺更容易磨成粉末。回收硫中含有一定的较比商品硫磺强。通过扫描电镜观察，发现颗粒大小在5−10 μm之间、大小不一、形状不规则。硫氧化菌可吸附于硫颗粒表面，不断进行氧化使得颗粒表面形成了一些细小的沟壑与微坑^{[27, 28]}，如图 8所示。

2.6 H.neapolitanus CYJN-1耐盐特性的研究

因高盐度环境下的盐析作用降低了微生物的脱氢酶活性，水的渗透压随着盐浓度的升高而增加，从而引起微生物细胞脱水进而导致细胞原生质 分离，最终导致微生物细胞破裂死亡^[29]。国内外学者通过对杆菌的研究发现，当环境中的NaCl含量大于1%时，微生物呼吸速率降低，当NaCl含量大于2%时，滴滤池BOD去除率降低^[30]，而当盐度上升到3%时，则抑制了系统中大部分微生物的新陈代谢作用^[31]，且好养和厌氧生化系统的活性微生物数量均呈现下降趋势^[32]。作为生物脱硫的开放体系，脱硫菌的耐盐特性也将成为一个重要指标影响着脱硫特性和应用范围。此外，一些学者发现相比含盐量高低而言，盐含量的急剧变化对微生物的影响更大^[33]。

从图 9和图 10可以看出，盐度从1%增加到5%对脱硫菌生长影响较小，但盐度增加到7%时细胞 很难维持正常的生长，机体生长受到抑制。同时我们可以看出，盐度在0−1%时细胞经过短暂的延滞期后很快进入对数期，24 h时硫代硫酸钠脱除率达到94%以上。盐度增加到3%时延滞期变长，要经过一定的调整之后才能进入对数生长期，24 h内的脱除率为87%，48 h时脱硫率达98%左右。当盐度在5%时延滞期将近30 h，24 h内的脱除率降至20%左右，但48 h时脱除率迅速达到98%。如果盐度继续增加菌株将无法进入生长期，生长速率降低，细胞停止生长直至死亡。

综上所知，H.neapolitanus CYJN-1在一定的盐度范围内既能正常生长，又能高效去除硫代硫酸盐，且与李琳等^[9]报道的耐盐脱硫菌相比该菌适应性强、脱硫率高、盐度变化能力等方面都有较明显的优势。但随着盐度的继续增加，菌株生长的停滞期变长、对数增长期的时间延长，稳定期缩短。停滞期变长是因为接种到和以前盐度不同的培养基上后，微生物不能立即生长繁殖，要经过一定时间的调整和适应，以合成多种酶，并完善体内的酶系统和细胞的其他成分。对数期的时间延长可能是因为高盐环境下，一方面微生物要抵御外在的不良环境，另一方面需要能量合成自身生长所需的物质，这样的能量分配导致用于生长繁殖的能量相对减少，从而造成自身生长速率变小，世代时间变长；同时可能由于延滞期过长消耗了太多的营养成分而不足以满足菌株的生长。

3 结论

本研究从上海外高桥某发电厂冷却水污泥中筛选分离出一株耐盐高效硫氧化菌H.neapolitanus CYJN-1，确定最适生长条件，并对该菌脱硫潜力和耐盐特性进行初步研究。结果表明：

(1) H. neapolitanus CYJN-1为专性好氧、化能自养型革兰氏阴性菌、运动活跃、短杆状、平均长度为1.55±0.15 μm、宽度为0.65±0.10 μm、有鞭毛和较厚荚膜，并以16S rRNA基因序列构建系统发育树表明，该菌为嗜盐硫杆状菌属(Halothiobacillus)中的那不勒斯菌(neapolitanus)。

(2) H. neapolitanus CYJN-1通过氧化还原态的硫获得能量，不能利用任何有机物，是一种严格化能自养型微生物。通过单因素实验发现，该菌在较宽泛的温度和pH范围内都能生长，氧化能力强，具有良好的适应自然环境脱硫体系的特性。其最适生长条件为：起始pH为7.0，温度30°C，底物浓度为20 g/L。

(3) H. neapolitanus CYJN-1初步脱硫实验发现，在最适生长条件下，24 h时硫代硫酸盐去除率可达94%。部分还原态硫氧化生成单质硫，最高生成量为0.83 g/L。产生的单质硫有硫磺味、易结块、比商品硫磺更容易磨成粉末。通过扫描电镜观察，发现硫颗粒大小不一、形状不规则、颗粒表面有细小的沟壑与微坑。

(4) 耐盐性实验表明，H.neapolitanus CYJN-1具有较强适应盐度变化能力。该菌株在0−5% (NaCI，质量体积比)的盐度范围内能够正常生长，但随着盐度的增加，延滞期也有不同程度的延长。其最适生长盐度在3%左右，在此条件下24 h内的硫代硫酸钠脱除率为87%，到48 h时脱除率可达到98%。当盐度达到5%以上时延迟期变长，生长受到抑制。因此，该菌在一定盐度变化范围内有较强的脱硫能力，在食品工业﹑化妆品生产﹑环境污染的生物修复等领域具有广泛的应用价值。

(5) 该研究结果说明脱硫菌H. neapolitanus CYJN-1营养要求低、适应范围广、耐盐特性较强。适用于生物脱硫开放体系，且在含盐废水硫化物去除、生物浸矿、生物冶金等领域都具有潜在的应用前景。