1977年，日本学者Shima等在小白链霉菌(Streptomyces albulus)的培养液中发现了ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine，ε-PL)^[1]，它是由25−35个L-赖氨酸单体通过α-COOH和ε-NH₂脱水缩合而成的同型氨基酸聚合物^[2]。ε-PL作为一种多阳离子聚合物，对革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌具有较强的抑制活性，同时对酵母等真菌和病毒也具有一定抑制能力^[3]。目前ε-PL主要作为一种优良的生物食品防腐剂被广泛用于日本、韩国、美国和欧洲等国家和地区的食品加工领域。2014年4月，我国也将ε-PL批准为食品添加剂新品种^[4]。

ε-PL发酵一般采用两阶段pH控制策略。Kahar等首先控制发酵pH高于5.0，使菌体大量繁殖，其次控制pH在4.0附近，进行ε-PL的合成，在96 h后补加葡萄糖和硫酸铵，发酵192h，最终产量达到了48.3 g/L^[5]。江南大学陈旭升等根据Streptomycessp. M-Z18的发酵特性，建立了新的两阶段pH控制发酵工艺，发酵192 h产量达30.11 g/L^[6]。目前ε-PL发酵水平已经达到40 g/L以上，正推向产业化阶段。

染菌是发酵工艺中最棘手的问题之一，在纯种发酵过程中染菌现象屡见不鲜^{[7, 8, 9]}，抗生素生产行业中染菌也是最为关注的焦点之一^{[10, 11]}。本研究室在5 L发酵罐上利用Streptomyces sp. M-Z18进行好氧发酵生产ε-PL时也常出现染菌问题，以致影响研究的正常进行。对污染微生物种属上的认识将有利于发酵过程中的防治控制，尤艳华^[12]采用稀释涂布平板法对盾壳霉双相发酵过程中污染微生物进行分离，得到10株细菌；曹文伟等^[13]采用相同方法从红霉素发酵液中分离到45株污染细菌，其中39株为芽孢杆菌属。本文以5 L发酵罐好氧发酵时污染样本为研究对象，建立了一种Streptomyces sp. M-Z18发酵后期污染生物的分离方法。分析污染微生物的种属、来源，为实验室研究、中试及大生产发酵过程污染的防治及研究污染微生物的耐高浓度ε-PL机制奠定基础。

1 材料与方法 1.1 发酵异常样本

实验室5 L发酵罐发酵中后期(第5、6天后)染菌样本1、2、3和4。

1.2 主要试剂和仪器

ε-PL样品，日本JNC公司，纯度98%以上；其他试剂均为国药集团分析纯试剂。PCR扩增仪、凝胶成像系统，美国Bio-Rad公司；聚合酶链式反应(PCR)所用的DNA聚合酶、dNTPs，大连TaKaRa公司。上游引物27F：5′-AGAGTTTGATCGTGGCTC AG-3′，下游引物1429R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 培养基及培养条件

Streptomyces sp.M-Z18菌体生长培养条件参照文献[6]。细菌为牛肉膏蛋白胨、Luria-Bertani(LB)培养基^[14]。

1.4 污染微生物的分离纯化及鉴定 1.4.1 样本的预处理：超净工作台无菌取样到已灭菌的具盖15 mL离心管中，1 600×g离心4 min除去大量链霉菌菌体，上清液于4 °C保存。取上清液进行简单显微镜观察，判定样本中污染微生物的基本形态及种类，同时测定各样本中ε-PL的含量^[15]及pH值。

1.4.2 污染微生物的分离：分别取1 mL 4 °C保存的上清液到LB液体培养基中进行富集培养，于30 °C、200r/min培养。分别于24、72 h取富集培养液，10倍稀释法稀释后取样涂布至牛肉膏蛋白胨及LB培养基上，3个平行。同时分别取4 °C保存的上清液10倍稀释法稀释涂布在贝纳特、牛肉膏蛋白胨、LB培养基上，37 °C培养48h观察菌落特征，并采用平板划线法进行纯化^[14]。

1.4.3 分类鉴定：根据“Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology” (9thedition)^[16]细菌分类标准，借助光学显微镜、扫描电镜等对分离菌株的营养细胞进行观察，扫描电镜样品的预处理主要包括表面清洁、固定、漂洗和脱水等过程：(1)用无水乙醇进行清洗，之后用3%戊二醛溶液固定，再用四氧化二锇固定。(2)干燥除去乙醇，减少表面张力对样品表面的影响。(3)酒精梯度脱水之后，再用磷酸异戊酯过渡，干燥后用扫描电子显微镜观察。根据上述观察的形态特征，结合16SrRNA基因对分离得到的菌株进行鉴定。

1.4.4 分子鉴定：采用细菌基因组提取试剂盒抽提菌株总DNA；用细菌通用引物27F和1492R对菌株总DNA进行16S rRNA基因扩增^[17]。PCR反应使用50 μL体系：1 ng DNA模板3 μL，10×PCR mix 25μL，5 U/μLTaq DNA酶0.5μL，上下游引物2 μmol/L各0.5 μL，ddH₂O 20 μL ^[18]。PCR程序为：95 °C 10 min；94 °C 30 s，54 °C 30 s，72 °C 105 s，共29个循环；72 °C 10 min。PCR结束后经琼脂糖凝胶电泳检测，符合测序要求后将16S rRNA基因片段送上海生工生物技术公司进行测序。利用NCBI中BLAST在线比对所测菌株的16S rRNA基因序列，将其与从GenBank数据库中获得的其他亲缘关系相近种属的16S rRNA基因，采用ClustalX 2.0软件进行多序列匹配排列(Multiple alignments)，用系统发生推断软件包MEGA 6.0进行系统发育分析。在Kimura-2-parameter模型的基础上，用Neighbor-joining(N-J)法构建分子系统树，自举分析(Bootstrap)1 000次重复检测分子系统树的置信度，缺失和不确定的位点在计算中被省略^{[19, 20]}。

1.4.5 分离菌株的验证：将分离菌株与Streptomyces sp.M-Z18按照摇瓶发酵工艺^[6]进行共培养，72 h后平板划线培养观察菌落特征；将分离菌株于M3G培养基中培养24 h后分别接种3 mL到不同pH的RSM培养基中培养^[6]，考察其pH耐受性，培养72 h后620 nm下测定OD。发酵污染一般在发酵中后期，此时发酵pH控制在3.8，ε-PL产量在20 g/L以上。为进一步验证分离菌株的聚赖氨酸耐受性，将其于M3G培养基中培养24 h，取3 mL接种至分别含12、24、36、48 g/L ε-PL pH 3.8的RSM培养基中培养72 h，再用培养液直接点接种平板观察是否有菌落生长。

2 结果与分析 2.1 污染样本基本性质

经过测定，每个污染样本中ε-PL含量在30 g/L左右，pH在3.80左右，从该结果可以分析污染微生物具有一定的耐酸能力和很强的ε-PL耐受能力。在显微镜下观察污染样本结果见图 1，可以看到似球杆状的污染微生物分散在放线菌菌丝中。

2.2 常规分离-稀释涂布平板法

按照1.4.2方法，对污染微生物进行分离。牛肉膏蛋白胨培养基37 °C培养48h的菌落特征均为淡黄色，似细菌培养物，但该单菌落与培养基生长紧密，不易挑起，从菌落特征分析，初步得出不同批次所污染的微生物可能是相同种属的；分别挑选菌落特征大小不一的淡黄色似细菌培养物于牛肉膏蛋白胨培养基平板上划线纯化，37 °C培养48h的菌落特征见图 2A，单菌落呈淡黄色，似细菌；在LB平板上划线纯化培养5 d的菌落特征如图 2B所示，出现中间凹陷，似梅花状，与典型的细菌菌落特征不一致；对梅花状培养物进行番红简单染色见图 2C，发现所分离得到的似细菌培养物不是纯培 养物，而是混生培养物，菌落中链霉菌占了绝大部分，污染微生物的量较少；培养物显微镜观察发现污染微生物细胞分泌似淀粉状物质；电镜观察见图 2D，显示放线菌菌丝不饱满，且有白色附着物，白色附着物可能为污染微生物。有文献报道黏细菌因为其特殊的代谢产物和生长速率，分离比较困难^{[21, 22, 23]}。两者可能有相似之处。

使用传统的稀释涂布法来分离纯化ε-聚赖氨酸发酵过程污染微生物已不能奏效^[24]，必须寻找一种新的分离方法，主要从两方面进行：(1)改变培养条件，使得污染微生物代谢途径改变，胞外分泌物减少或者不产，主要采用了施加盐浓度、pH环境压力策略；(2) 抑制链霉菌生长，污染微生物生长不受抑制，主要采用了在培养基中添加聚赖氨酸(中性pH下链霉菌生长受到抑制)、抗生素、极端pH、更换培养基组成等策略。通过上述两个方面的尝试没有实现对污染微生物的有效分离。

2.3 液体富集法分离污染微生物

观察混生培养物在贝纳特琼脂平板上生长特征时，发现污染微生物与Streptomyces sp. M-Z18表现出生长速率差异，见图 3。有地方出现Streptomyces sp. M-Z18白色菌丝且不生长孢子的培养物，而有的地方是黄色培养物，培养15d左右时不再出现混生培养物难以挑起的现象，分析可能是污染微生物作用于放线菌菌丝，使菌丝断裂、自溶，这与发酵中后期染菌后出现的菌丝断裂，菌体自溶加速现象一致。

刮取图 3底层培养物到贝纳特液体培养基中进行富集培养，48 h后采用10倍稀释涂布平板法进行分离，对平板上单菌落划线纯化得到纯培养物。对4个发酵污染样本重复3次实验，得到的纯培养物分别命名为X-20-1、X-20-2、X-20-3、X-20-4。

2.4 分离菌株的简单鉴定结果

从纯培养物菌落特征初步判定4株菌为同种，因此以X-20-1菌株进行简单鉴定。X-20-1的基本形态特征如图 4A所示，菌落为米白色，挑起时稍黏稠，对X-20-1进行简单染色显示菌体形态为短杆状；革兰氏染色显微镜观察显示为革兰氏阴性菌，见图 4B；透射电镜观察见图 4C，发现X-20-1细菌分泌胞外物质。胞外分泌物使X-20-1与链霉菌胶黏在一起导致两者很难分开，与前期尝试了很多分离方法没有进行有效分离的原因相一致。

2.5 4株菌的分子鉴定

将分离得到4株细菌的16S rRNA基因序列(X-20-1、X-20-2、X-20-3和X-20-4的登录号依次为KP056314、KP222740、KP222742和KP222741)与NCBI数据库中的已知序列进行BLAST比对，确定与4株菌株亲缘关系最近的均为Acinetobacter bereziniae。按照1.4.4所述方法，构建的系统进化树如图 5所示，4株菌的16S rRNA基因与不动杆菌属Acinetobacter bereziniae ATCC 17924的一致性达100%，在系统进化树上处于同一分支。

2.6 分离菌株X-20-1的验证

4株菌均为Acinetobacter bereziniae，因此以X-20-1进行以下实验。按照1.4.5的方法，对Streptomyces sp.M-Z18与X-20-1共培养物平板划线，在LB与贝纳特平板菌落形态见图 6，结果显示，在两种平板上混合共培养后划线的菌落特征分别与没有分开前的菌落特征一致。同时测定两株菌摇瓶共培养结束时pH值为3.0，ε-PL为1.6 g/L，而纯种发酵ε-PL为1.74 g/L，显示X-20-1的污染对Streptomyces sp. M-Z18纯种发酵有一定的影响。

对X-20-1菌株的pH及聚赖氨酸耐受性验证结果见图 7，结果显示X-20-1在pH 3.5−9.0能正常生长，最适生长pH为5.0。在不同pH条件下，X-20-1 在含2.4 g/L ε-PL的培养基中也能正常生长。

分离菌株的ε-PL耐受性结果见图 8，在与发酵条件相同的条件下，X-20-1在添加有不同浓度ε-PL的液体培养基中菌株量的浓度较一致，培养基浑浊明显，结果表明X-20-1能在48 g/L ε-PL下正常生长。

3 讨论

采用稀释涂布平板法、环境胁迫等方法没有实现对ε-聚赖氨酸发酵过程污染微生物的分离，分析原因是污染微生物细胞壁分泌某些似淀粉状胞外附属物，使污染微生物黏附在放线菌菌丝上。最后采用液体富集法实现有效分离，经分子生物学鉴定为不动杆菌属Acinetobacter bereziniae菌。污染微生物的有效分离为后期实验室研究、中试及大生产发酵过程污染的防治，以及研究污染微生物的耐高浓度聚赖氨酸机制打下基础。污染微生物对Streptomyces sp. M-Z18纯种的发酵有一定的影响。分析其原因可能有：X-20-1污染后附着在Streptomyces sp. M-Z18菌丝体上，影响菌丝的正常生长，导致菌丝生长不饱满，污染微生物的附着加剧在低pH条件下时菌丝的自溶；同时X-20-1会与Streptomyces sp. M-Z18竞争某些限制性营养，及污染微生物代谢产生某些胞外蛋白都会干扰生产菌株的正常代谢。生物膜是由细菌和自身分泌的胞外基质组成^[25]，文献[26]报道Acinetobacter bereziniae同属菌鲍曼不动杆菌能够形成生物膜，推测分泌的胞外黏质物可能是生物膜，Thurnheer等^[27]的研究表明大分子在渗透入生物膜时要通过迂曲的途径，同时Raad等^[28]研究表明生物膜是带负电荷的，会吸收带正电荷的大分子形成屏障，推测Acinetobacter bereziniae在pH3.8时能耐受48 g/L以上的聚赖氨酸的机制可能为：生物膜阻碍带正电荷的ε-聚赖氨酸吸附到细胞膜上，而ε-聚赖氨酸吸附到细胞膜上，破坏膜结构完整性是其发挥抑菌作用的基础^[29]。