乳酸(Lactic acid)是一种能够由可再生碳水化合物转化而来的重要平台化合物，又名丙醇酸^[1]。目前已广泛应用于食品、医药、轻工、化工等行业，但其最重要的工业应用是用于合成生物可降解材料——聚乳酸^[2]。聚乳酸具有良好的生物相容性和降解性，是理想的绿色高分子材料，具有巨大的市场空间，有望替代石油基塑料产品^[3]。因此，高光学纯L-乳酸的生产与应用已成为令人关注的重要研究方向之一。

微生物发酵法生产乳酸的技术已经取得重要进展，并成为乳酸商业化生产的主导技术。自然界中许多微生物都能利用还原糖发酵产生乳酸。单糖尤其是葡萄糖可作为碳源和能源，经EMP途径降解生产丙酮酸，丙酮酸又进一步在乳酸脱氢酶(LDH)的作用下生成乳酸^[4]。产D,L-乳酸的乳杆菌中存在L和D两种依赖NAD的LDH，分别催化丙酮酸生成L-乳酸和D-乳酸^[5]。

目前，乳酸生产菌株主要分为两类，一类是霉菌中的米根霉(Rhizopus oryzae)，另一类是细菌中的乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)。乳酸菌是一类能利用可发酵碳水化合物产大量乳酸的细菌的通称。最早LAB的定义为：革兰氏阳性，无芽孢，接触酶为阴性，缺细胞色素，不好氧，耐酸，营养要求复杂，专性发酵糖，乳酸为其主要终产物等。随着细菌分类学的不断发展，又发现了一些新的、并不完全符合以上限定的LAB，如芽孢乳杆菌属和少数芽孢杆菌属^[6]。米根霉发酵能量消耗大，糖酸转化率较低，而LAB中的芽孢杆菌具有营养要求简单、产酸速度快、发酵温度高(50−60°C)、可实现开放式发酵、适应低pH条件，以及生产成本低等优点，逐渐受到重视^[7]。Tiina等比较了凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans) SIM-7 DSM 14043与德氏乳杆菌Lactobacillus delbrueckii ssp. lactics DSM 20073生产L-乳酸的发酵条件，结果表明Bacillus coagulans SIM-7 DSM 14043对氮源要求低，能够生成高光学纯度的L-乳酸，产酸速度快，L-乳酸的浓度在21−22 h达到91.6 g/L，发酵温度可达到65°C^[8]。本研究所用的菌株Bacillussp. P38是一株可耐受糠醛产L-乳酸的芽孢杆菌，并且可以同时利用葡萄糖和木糖产L-乳酸。利用玉米芯水解液为唯一碳源时，L-乳酸发酵水平超过180 g/L，生产强度达到2.4 g/(L·h)，糖酸转化率达到96%，光学纯度大于99%。其发酵水平、生产强度、转化率在已报道的结果中均处于领先地位^[9]。目前，该菌株产高光学纯L-乳酸的机理尚不清楚。

本研究以产高光学纯L-乳酸生产菌株Bacillussp. P38为研究对象，通过关键酶异源表达、纯化与酶学特性分析，结合Native-PAGE、实时荧光定量PCR等生物学方法，系统地研究了该菌合成高光学纯L-乳酸的机理。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株和质粒：Bacillussp. P38保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏登记号为CGMCC No. 7312，由中国科学院微生物生理与代谢工程重点实验室(中国科学院微生物研究所)提供。植物乳杆菌L. plantarum ssp. plantarum DSM 20174购自德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)。大肠杆菌Escherichia coli DH5α、E. coli BL21(DE3)购自天根生化科技(北京)有限公司。

表达载体pET-28a为本实验室保存。重组质粒pET-28a-ldhL、pET-28a-ldhD、pET-28a-ldhM/L为本研究构建，分别含有来自Bacillussp. P38的L-乳酸脱氢酶基因、D-乳酸脱氢酶基因和苹果酸/L-乳酸脱氢酶基因。

1.1.2 培养基及培养条件：Bacillussp. P38接种于种子培养基(g/L，葡萄糖50，酵母浸出粉10，碳酸钙30)中，45°C、150 r/min摇床培养。L. plantarum ssp. plantarum DSM 20174接种于MRS培养基中，30°C静置培养。含有重组质粒的大肠杆菌接种于LB培养基(含40 mg/L卡那霉素)中，37°C、180 r/min摇床培养。培养基配方参照文献[10]。

1.1.3 主要仪器和试剂：限制性内切酶、T4连接酶、ExTaq酶、Real-time PCR试剂盒等均购自Takara公司。RNA反转录试剂盒、基因组提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。质粒小提试剂盒、纯化试剂盒、RNA提取试剂盒购自美国Omega Biotek公司。Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒购自康为世纪有限公司。

1.2 方法 1.2.1 目的基因的克隆和表达：Bacillussp. P38全基因组序列信息(GenBank登录号：JSVI01000000)显示，该菌株具有3个与乳酸代谢相关的基因：ldhL、ldhD和ldhM/L，分别编码L-乳酸脱氢酶(L-LDH)、D-乳酸脱氢酶(D-LDH)和苹果酸/乳酸脱氢酶(M/L-LDH)。根据基因组信息设计引物(表1)，使用pfuDNA聚合酶分别扩增得到3个基因。将基因片段经合适的限制性内切酶酶切后连接到表达载体pET-28a上，构建得到重组质粒pET28a-ldhL、pET28a-ldhD、pET28a-ldhM/L，重组质粒经双酶切并测序验证正确后分别转化到E. coli BL21 (DE3)中。

分别将含3种重组载体的E. coli BL21(DE3)以1%接种量接种到LB液体培养基中(含40 mg/L卡那霉素)，37°C、180 r/min振荡培养。当OD₆₀₀达到0.6−0.8时，加入终浓度为0.8 mmol/L的IPTG 16°C过夜诱导蛋白表达。

1.2.2 重组蛋白的纯化：由于重组蛋白N端含组氨酸标签His-tag，因此使用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化。菌体的超声波破碎、层析柱的平衡、可溶性蛋白的上样及杂蛋白的清洗等过程参照试剂盒手册进行。目的蛋白用2 mL Elution buffer (pH 7.9 Tris-HCl 4 mmol/L，咪唑60 mmol/L，NaCl 0.1 mol/L)洗脱并通过超滤管脱盐、浓缩后于−80°C保存。收集各阶段的洗脱液进行SDS-PAGE(13%分离胶，4%浓缩胶)电泳和考马斯亮蓝(R-250)染色分析^[10]。

1.2.3 酶活测定：乳酸脱氢酶活性测定采用分光光度法，以丙酮酸钠为底物，NADH为辅酶，利用340 nm处检测NADH的减少量来表征^[12]。具体反应体系(200 μL)为：磷酸缓冲液(pH 7.0) 100 mmol/L，丙酮酸钠20 mmol/L，NADH 0.2 mmol/L，酶液适量，测定温度为37°C。空白对照中不含NADH。

乳酸脱氢酶的一个酶活单位(1 U)定义为：在特定条件下，每分钟内氧化1 μmol NADH所需要的酶量。

1.2.4 重组蛋白的动力学参数测定：在测得以上各酶的最适反应温度和最适pH后，在最适酶活测定条件下，以不同浓度的底物测定酶活，采用Lineweaver-Burk双倒数作图法，计算L-LDH、D-LDH、M/L-LDH对丙酮酸钠的K_m值、V_max值、K_cat值以及K_cat/K_m值^[13]。

1.2.5 Native-PAGE检测LDH在体内的活性：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)活性染色技术用于检测Bacillussp. P38体内LDHs的活性。利用Bacillussp. P38和L. plantarum ssp. plantarum DSM 20174的粗酶液进行非变性聚丙烯酰胺凝胶梯度(4%−12%)电泳。电泳后将每条泳道切成胶条进行染色，其中Marker部分采用考马斯亮蓝法，其他部分浸泡在底物溶液中进行显色。底物溶 液组成为：100 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，0.1 mmol/L氯化硝基四氮唑蓝(Nitrotetrazolium blue chloride)，1 mmol/L NAD，100 mmol/L DL-乳酸钠。染色温度为室温，待酶带清晰后，用蒸馏水漂洗2−3次。

1.2.6 实时荧光定量PCR分析：实时荧光定量PCR用于分析Bacillus sp. P38中乳酸代谢相关基因在不同发酵时期(对数期、稳定期、衰亡期)的转录水平。提取P38三个发酵阶段的RNA，电泳检测样品完整性，并在260 nm波长下测定样品浓度。3个时期的RNA样品分别作为模板进行反转录生成cDNA。以16S rRNA基因为内参，用Premier 5.0软件设计Bacillus sp. P38中各关键酶编码基因和16S rRNA基因序列的高特异性引物(表1)。采用SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa)进行实时定量PCR，每个样品做3个平行且保证3个平行的误差在15%之内。

1.2.7 分析方法：Bacillussp. P38菌体破碎粗酶液里LDHs活性是利用液相手性色谱柱检测L-乳酸和D-乳酸的产量来测定。方法如下：将20 mmol/L丙酮酸、20 mmol/L NADH以及0.1 g/L P38粗酶液在37°C孵育1 h，利用液相手性色谱柱检测L-乳酸和D-乳酸的生成量。测定条件为：手性柱流动相为2 mmol/L CuSO₄，流速0.5 mL/min，柱温25°C，进样5 μL，紫外检测器检测，检测波长254 nm。发酵液中葡萄糖和L-乳酸用SBA-40C Biosensor来检测。Bacillussp. P38生长曲线采用7200 Visible Spectrophotometer在A₆₀₀条件下测定。L-乳酸光学纯度的计算公式如下：

$L-乳酸光学纯度=\frac{{{\rm{(L - lactic acid) }}}}{{{\rm{(L - lactic acid)}} + {\rm{(D - lactic acid)}}}} \times 100{\rm{\% }} $

2 结果与分析 2.1 重组蛋白的纯化

构建的重组质粒pET28a-ldhL、pET28a-ldhD、pET28a-ldhM/L经双酶切和测序验证正确后，分别转化到E. coli BL21(DE3)中进行诱导表达。由于目的蛋白携带His标签，所以通过Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒进行蛋白纯化。纯化后的蛋白利用SDS-PAGE进行检测，得到单一条带(图1)，其中L-LDH为34.4 kD，D-LDH为36.3 kD，L/M-LDH为36.7 kD，与预测目的蛋白大小一致。收集纯化的蛋白进行后续的酶学性质研究。

2.2 体外酶活

在各自最适反应条件下测定L-LDH、D-LDH和M/L-LDH的动力学参数，计算其K_m值、V_max值、K_cat值以及K_cat/K_m值(表2)。经检测Bacillussp. P38中乳酸代谢关键酶L-LDH、D-LDH和M/L-LDH均具有催化活性，其中L-LDH的K_m值最低，为3.73±0.19。L-LDH对丙酮酸的催化效率(K_cat/K_m值)为(7.98±0.80)×10³，远高于D-LDH的(2.96±0.30)×10³。体外酶学性质研究得出L-LDH对丙酮酸的催化效率和结合能力都比D-LDH高，初步说明了Bacillus sp. P38合成高光学纯L-乳酸的原因。

为了研究M/L-LDH的主要功能，分别检测了M/L-LDH作为L-LDH和M-LDH的活性，作为L-LDH时的酶活为2.83 U，作为M-LDH时的酶活为1.47 U。同时以苹果酸为底物进行Bacillus sp. P38全细胞Native-PAGE未检测到苹果酸脱氢酶的活性。为了证明3种酶的产物的光学性质，采用高效液相色谱方法分别对3种酶以丙酮酸为底物、NADH为辅酶时的产物进行检测。结果显示L-LDH、M/L-LDH的产物均为L-乳酸，检测不到D-乳酸。所以，M/L-LDH主要行使L-LDH的功能。同时，L-LDH的K_m值(4.10±0.20)低于M/L-LDH (5.14±0.11)，L-LDH对丙酮酸的催化效率(K_cat/K_m)为(7.98±0.80)×10³ L/(mol·s)远高于M/L-LDH (1.80±0.20)×10³ L/(mol·s)，值得指出的是该酶的主要功能是L-乳酸脱氢酶，其催化产物也证实不产生D-乳酸，所以该酶不会影响Bacillussp. P38菌产生乳酸的光学纯度。

2.3 体内酶活检测

通过全细胞Native-PAGE对体内酶活进行了验证(图2)，Bacillus sp. P38中只检测到L-LDH，而对照菌DSM 20174 (DL-乳酸生产菌)同时检测到D-LDH和L-LDH。说明Bacillussp. P38在乳酸发酵过程中D-LDH无活力或者活力很低(低于Native-PAGE的检测限)，而L-LDH的活力较高。

2.4 发酵过程中乳酸合成相关基因转录水平的变化

虽然通过体内酶活检测并未测定到D-LDH的酶活力，但是其D-LDH的酶活力是否在发酵过程中有所变化，从而影响了P38菌在不同培养阶段所产乳酸的光学纯度？为此我们进一步测定了Bacillussp. P38在发酵过程中合成的乳酸光学纯度的变化情况，结果如图3所示。在发酵初始阶段，培养基中L-乳酸的光学纯度只有81.1%，在对数生长期(2−11 h)内迅速增长到99.36%，稳定期(24 h)达到最大为99.60%。

为了了解发酵过程中关键酶的表达情况，我们通过实时荧光定量PCR检测了不同时期乳酸合成相关基因的转录水平。实验数据分析采用经典的2^(−ΔΔC_T)法。结果如图4所示，Bacillussp. P38中ldhL在对数期的转录水平分别是ldhD和ldhM/L的409.44倍和20.23倍，在稳定期分别是ldhD和ldhM/L的506.18和26.35倍，在衰亡期分别是ldhD和ldhM/L的557.73倍和43.78倍。由于体外酶活证实M/L-LDH主要表现为L-LDH的酶活力。如果将ldhL和ldhM/L的转录水平合并与ldhD比较，在Bacillus sp. P38菌生长对数期时，L-乳酸合成相关的ldhL和ldhM/L的转录水平是D-乳酸合成相关的ldhD转录水平的429.86倍，稳定期是525.64倍，衰亡期是570.51倍。可见L-乳酸合成相关基因的转录水平在Bacillussp. P38中远远高于D-乳酸合成相关的基因，这也很好地解释了Bacillussp. P38高产光学纯L-乳酸的原因。实验结果还表明，同一种乳酸合成基因在对数期的转录水平最高，衰亡期转录水平最低，这也与所产乳酸光学纯度在发酵各阶段的变化相吻合。

3 讨论

Bacillussp. P38是一株具有代表性的产高光学纯L-乳酸的菌株，所产乳酸单体光学纯度高达99.6%。在应用中，该菌所具有的营养要求低、发酵温度高，可实现开放式发酵等优点还可以大大降低生产成本，具有工业大规模生产的潜力。本研究分别从基因、转录和蛋白水平对该菌的乳酸合成进行了比较分析，并结合体外酶学方法揭示关键酶在Bacillussp. P38中的功能，以揭示Bacillussp. P38产高光学纯L-乳酸的机理，为该菌株的工业化应用奠定理论基础。

同型乳酸发酵与异型乳酸发酵是乳酸代谢的两种途径。同型乳酸发酵中乳酸是葡萄糖代谢的唯一产物，经糖酵解途径，l mol葡萄糖可生成2 mol乳酸，理论转化率为100%。但发酵过程中微生物存在其他生理活动，实际转化率在80%以上的即认为是同型乳酸发酵。异型乳酸发酵则经由磷酸戊糖途径生成等摩尔的乳酸、二氧化碳和乙醇(或乙酸)^[13]。产D,L-乳酸的乳酸菌中存在L和D两种依赖NADH的LDH，分别催化丙酮酸生成L-乳酸和D-乳酸。如果使乳杆菌的ldhD缺失，则只生产高光学纯度的L-乳酸(理论上光学纯度可达到100%)，同时可以大幅提高L-乳酸产量。反之，如果使ldhL缺失则生产高光学纯度的D-乳酸^[15]。赵蕊等通过重组NADH氧化酶研究了其对乳酸脱氢酶乳酸氧化活性的影响，得出在NADH经呼吸链代谢掉的生理条件下，LDH催化乳酸氧化的能力会明显提高的结论^[16]。朱龙宝等通过构建过量表达乳酸脱氢酶的重组干酪乳杆菌，提高干酪乳杆菌发酵产乳酸的能力。为了进一步提高其产酸能力，添加4 mmol/L激活剂FBP和8 mg/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)前体物烟酸，结果表明，重组菌L. casei pMG-ldh乳酸积累128.2 g/L，生产强度达到3.04 g/(L·h)，较原始菌株L. casei分别提高了35%和53%，发酵周期缩短6 h^[17]。然而，关于乳酸脱氢酶活力变化对所产乳酸光学纯度的研究国内未见报道。

本研究中Bacillussp. P38的3个乳酸代谢关键酶(L-LDH、D-LDH、M/L-DH)中L-LDH和D-LDH对丙酮酸的相对催化效率差异很大，L-LDH催化活性高于D-LDH，K_m值小于D-LDH，说明不同菌株中的L-LDH和D-LDH对该菌株所产乳酸光学纯度的影响可能是催化效率的差异造成的。Native-PAGE结果表明Bacillussp. P38中只检测到L-LDH的活性，转录水平分析结果显示，ldhL的转录水平在整个发酵阶段都远远高于另外两个基因，这两个结果充分解释了Bacillussp. P38合成高光学纯L-乳酸的原因。同时ldhD的低水平转录也解释了Bacillussp. P38的产物中含有少量D-乳酸的原因。结合Bacillussp. P38各发酵阶段产物光学纯度和基因转录水平进行分析，结果表明3个乳酸代谢关键基因转录水平从对数期到衰亡期逐渐降低。对数期基因转录水平最高，与L-乳酸对数期的光学纯度一致，随后基因转录水平逐渐降低，相应的L-乳酸光学纯度趋于常数。

综上所述，尽管Bacillus sp. P38全基因组中同时编码了L-乳酸脱氢酶和D-乳酸脱氢酶，但L-乳酸脱氢酶对底物催化活性要高于D-乳酸脱氢酶，体内基本检测不到D-乳酸脱氢酶的活性。转录水平上的研究也证实，L-乳酸脱氢酶基因的转录水平远远高于D-乳酸脱氢酶基因的转录，这也初步阐明了Bacillussp. P38合成高光学纯乳酸的机理。