3,5,6-三氯-2-吡啶醇(3,5,6-trichloro-2- pyridinol，TCP)是杀虫剂毒死蜱和甲基毒死蜱以及除草剂绿草定和绿草定-2-丁氧基乙酯的主要中间代谢产物，其分布遍及土壤、水体、空气和生物体内^{[1, 2, 3, 4, 5]}。同时，TCP也是合成上述农药的中间体化合物，是它们共同的母体结构(图1)。在这些农药的生产过程中，TCP也被排放到生产区域附近而污染土壤和水体环境^[6]。

图1  3,5,6-三氯-2-吡啶醇及其农药母体化合物的结构 Figure 1  Chemical structure of 3,5,6-trichloro-2-pyridinol and its parent compounds

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20世纪60年代以来，许多国家开始禁止或限制使用有机氯农药，有机磷农药一度成为品种最多、应用最广泛的农药。自2007年1月起，我国全面禁止使用和销售甲基对硫磷、甲胺磷、对硫磷、磷胺、久效磷等5种高毒有机磷农药。2008年，我国选出了以毒死蜱、吡蚜酮等为代表的5种高效低毒低残留有机磷杀虫剂作为今后的主导品种，替代了甲胺磷、对硫磷和久效磷等为代表的5种高毒有机磷农药。然而，以毒死蜱为代表的这些农药长期和大规模使用，使得大量残留农药在土壤以及水体中富集。据统计，2008年毒死蜱全球销量达 10万t，国内销量为1.8万t，每年以10%增长，释放到环境中的毒死蜱代谢物TCP，估计将达到 6万t^[7]。随着毒死蜱需求的增长，其释放到环境中的TCP也不断增加。

TCP在不同pH值有不同的存在形态。pH值小于其pKa (pKa=4.55)时，以两性离子形态存在，如图2所示。而在中性pH时，TCP是带有电荷的分子，具有较高的水溶性和迁移性，比母体化合物更易淋溶或渗漏到深层土壤及水体环境中^[8]，在低浓度下就能够对水生生物和陆生生物产生中等毒 性^[9]，从而对土壤和水体环境带来较大的污染^{[10, 11, 12]}。

图2  TCP在pH小于pKa时的存在状态 Figure 2  The section of TCP under the condition of pH＜pKa

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TCP在环境中蓄积后，对环境中的真菌和细菌生长有较强的抑制作用，阻止微生物对TCP和毒死蜱的降解。Baskaran等指出，TCP对环境微生物的毒性比毒死蜱更高，TCP 对土壤细菌群落的毒性是毒死蜱的2.5倍^[13]。当TCP的含量超过50 mg/L时会对TCP本身的降解产生抑制作用，同 时抑制其他有机化合物的降解，进一步加重环境中TCP以及其他有机污染物的累积残留，影响环境系统自我修复的功能^[14]。

TCP对人体有害，如果被吞咽，能够引起眼部损伤^[9]。Meeker等在研究毒死蜱及其代谢产物对人体的影响时指出，当人体受到毒死蜱的毒害后，它们在人体内代谢产生的TCP会使男性精子的质量下降，同时产生的TCP还会造成体内睾丸激素的下降^{[15, 16]}。Hunter等研究发现，怀孕母鼠肝脏中TCP含量是其胎儿肝脏中TCP的5倍，而胎儿大脑中的TCP含量却是怀孕母鼠肝脏中的2−4倍，说明胎儿的神经系统更容易受到TCP的影响^[17]。

环境中TCP的进一步降解是毒死蜱完全脱毒的关键，因为在毒死蜱的降解过程中，生成的二乙基硫代磷酸酯相对容易发生生物降解，而TCP在环境中较难降解，所以毒死蜱的彻底脱毒取决于TCP的降解。

微生物是TCP降解的主要驱动力。1997年，Feng等首次从环境中筛选到一株有氧条件下能以TCP作为唯一碳源和能源的TCP降解菌株Pseudomonas sp. ATCC 700113，70 h可以降解 40 mg/L TCP，完全降解100 mg/L的TCP需要3周时间^[18]。1998年，Robertson等研究毒死蜱在甘蔗田中的降解动态时发现，毒死蜱降解产物TCP的快速降解是土壤微生物作用所致^[19]。目前为止，从不同地域不同环境中分离筛选到TCP降解菌株，部分毒死蜱降解菌能够继续分解TCP为其他产物，如Bacillus latersprorus DSP、Alcaligenes faecalis DSP3、Sphingomonassp. Dsp-2、Paracoccussp. TRP、Bacillus pumilus C2A1、Synechocystis sp. PUPCCC 64、Cupriavidussp. DT-1等^{[10, 20, 21, 22, 23, 24, 25]}。另外，也有一些仅能降解TCP但是不能降解毒死蜱的菌株被筛选和鉴定。如Racke等对土壤中TCP的降解进行研究，发现微生物能显著提高TCP的降解速率，表明TCP的矿化主要是微生物作用的结果^[26]。Feng等分离出一株有氧条件下能以TCP作为唯一碳源和能源的TCP降解菌株Pseudomonassp. ATCC 700113，后来将该菌株命名为M285，70 h可以降解40 mg/L的TCP^[18]。Li等通过富集培养的方法分离的一株TCP降解菌株Ralstoniasp. T6，可以在 12 h内降解100 mg/L的TCP^[3]。Cao等分离的菌株Cupriavidus pauculus P2对TCP降解速度最快，10 h内可以将100 mg/L 的TCP完全降解^[27]。

由于TCP对环境中的真菌和细菌生长有较强的抑制作用^[28]，所以目前报道的能矿化TCP的菌株大多降解低浓度的TCP，一般在4−30 d才能完全降解50−100 mg/L的TCP。菌株Pseudomonas sp. ATCC 700113能在3 周内完全降解100 mg/L的TCP，但是不能降解高于200 mg/L的TCP^[18]。Burkholderiasp. KR100 在144 h可以完全降解 100 mg/L的TCP，但却不能降解高于300 mg/L 的TCP^[2]。

也有少量可以耐受或降解高浓度TCP的菌株被报道，如Alcaligenes faecalisDSP3在10 d内可以完全降解100 mg/L 的TCP，该菌株的生长和降解不受TCP 浓度的影响，即使TCP 的浓度达到 800 mg/L该菌株也能较好生长^[10]。Ralstoniasp. T6可以在80 h内完全降解700 mg/L 的TCP^[3]。菌株Cupriavidus pauculus P2在70 h内可以将800 mg/L的TCP完全降解^[27]，这是目前能降解最高起始浓度TCP的菌株。

不同的微生物对TCP的降解途径有所差异，归纳起来，TCP主要有3种类型的降解途径。(1) 烷基化反应途径。如图3A所示，TCP经微生物作用生成3,5,6-三氯-2-甲氧基吡啶(TCMP)或3,5,6-三氯-2-甲基吡啶(TMP)^[29]。如Racke等对土壤中毒死蜱的微生物降解研究表明，毒死蜱首先水解生成TCP，进而降解为TCMP，最终矿化为水，二氧化碳和铵离子^[9]。(2) 还原脱氯途径。如图3B所示，在缺氧或厌氧条件下，TCP脱掉环结构上的2个氯原子生成氯吡啶酚。如菌株Bacillus latersprorus DSP可将TCP还原生成6-氯-2-吡啶酚，最后被矿化^[24]。Singh和Walke

图3  微生物降解TCP的3种途径 Figure 3  Three possible pathways for TCP microbial degradation 注：1：TCP的烷基化反应；2：TCP的还原脱氯途径；3：TCP的氧化脱氯途径. Note: 1: The alkylationpathway of TCP; 2: The reductive dehalogenation of TCP; 3: The oxidative dehalogenation of TCP.

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推测3-氯-2-吡啶酚是毒死蜱微生物降解的产物之 一^[30]。Lu等在研究菌株Cupriavidus sp. DT-1降解TCP过程中检测到3个中间代谢产物，分别鉴定为5,6-二氯-2-吡啶醇、6-氯-2-吡啶醇和2-吡啶醇，并认为TCP降解首先是一个连续还原脱氯的过程，TCP分子上的3个氯原子可以被连续脱去然后生成2-吡啶醇^[22]。(3) 氧化脱氯途径。如图3C所示，Bhuimbar等研究发现，Micrococcusspp.和Bacillusspp.可以将TCP转化为二氯二羟基吡啶，最后产生3,6-二羟基吡啶-2,5-二酮^[31]。Cao等将菌株Cupriavi dus pauculus P2在降解TCP过程中产生的绿色代谢产物鉴定为3,6-二羟基吡啶-2,5-二酮^[32]。Li等发现，菌株Ralstoniasp. T6可以将TCP降解的绿色中间代谢产物3,6-二羟基吡啶-2,5-二酮进一步转化为5-氨 基-2,4,5-三羰基戊酸(ATOPA)^[33]。

目前关于毒死蜱降解机制和代谢途径的研究，多数仅集中在毒死蜱到TCP这一步转化，而对于TCP进一步降解的代谢途径及编码TCP降解酶的基因报道不多。2010年Math等从奶牛瘤胃的宏基因组文库中克隆一个长1 800 bp的TCP降解基因(tcp3A)，它编码的TCP水解酶与NCBI 数据库中酰胺水解酶的序列相似性最大，为24%−26%。将该基因连接在表达载体pET-28a上，然后转化到Escherichia coli，获得的重组菌株可以降解TCP^[34]，但是在TCP降解产物、降解机理及代谢途径方面，并没有进一步的报道。

Cao等^[32]通过转座子突变的方法建立了菌株Cupriavidus pauculus P2的突变株文库，从中筛选到3株丧失TCP降解能力的突变株，通过SEFA-PCR，分别扩增出突变株中Tn5转座子插入位置的上下游序列，将其测序后进行分析和拼接，得到一个包含5个基因的基因簇，将基因tcpA1和tcpB1异源表达显示，与菌株Ralstonia eutropha JMP134中2,4,6-三氯苯酚的脱氯作用非常相似^{[35, 36]}，TcpA1和TcpB1共同负责TCP的脱氯，生成3,6-二羟基吡 啶-2,5-二酮，如图4所示。

图4  菌株P2中TcpA1和TcpB1在TCP脱氯反应中的作用 Figure 4  The proposed functions of TcpA1 and TcpB1 during TCP dechlorination in Cupriavidus pauculus P2

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Li等从菌株Ralstoniasp. T6中分别克隆到2个与TCP降解相关的基因簇tcpRXA和dhpRIJK，基因簇tcpRXA编码的产物可以将TCP转化为3,6-二羟基吡啶-2,5-二酮，而基因簇dhpRIJK编码的产物可以将3,6-二羟基吡啶-2,5-二酮进一步转化为5-氨基-2,4,5-三羰基戊酸(ATOPA)，并最终被矿化，如图5所示^[33]。

图5  菌株T6中TCP的降解途径 Figure 5  Proposed metabolic pathway for TCP in Ralstonia sp. T6

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随着高效低毒农药在市场中需求量的增加，毒死蜱等的大量使用将导致环境中大量TCP的产生。TCP具有较高的水溶性和迁移性，容易进入深层土壤及水体环境，从而引起广泛的污染。微生物是TCP降解的主要驱动力，对TCP降解微生物的研究将有助于对TCP污染环境的修复。TCP降解相关的酶及其编码的基因在菌株Cupriavidus pauculus P2^[32]和菌株 Ralstoniasp. T6^[33]中被发现，但是，在这2个菌株将TCP降解为3,6-二羟基吡啶-2,5-二酮的过程中，与Bhuimbar等^[31]的研究不同的是，并没有发现包括1个或2个氯原子的中间代谢产物，其详细的降解机制及降解中所涉及的酶还有待进一步的研究；同时，5-氨基-2,4,5-三羰基戊酸在TCP降解菌株中的进一步代谢有待阐明。

目前，环境中残留农药的微生物降解是环境微生物学领域研究的热点之一，在各种去除污染的措施中，通过微生物对污染环境进行的生物修复因其高效、安全、成本低、无二次污染等优点而具有良好的发展前景。微生物对环境污染物的生物修复作用能否最终实现，不仅依赖于其本身的降解能力，还依赖于农药的性质、环境因子(温度、盐度、pH、氧化还原电位、营养可利用程度)以及降解细菌与土著微生物之间的竞争能力等其他因素。但是，目前对于TCP污染环境的生物修复的研究，大多集中在TCP降解菌株降解特性的研究及其分子降解机制的研究，仍停留在实验室研究阶段。对于将来大规模的污染环境中TCP的生物修复，应通过各种方法和措施优化降解环境，强化降解条件，提高微生物对TCP的降解能力和降解速度，从而更有效地修复污染环境。

目前，菌株Cupriavidus pauculus P2的全基因组测序已经完成，随着研究的深入，TCP完整的代谢途径及其降解机制将被阐明，TCP新降解基因的发现、以及降解酶构象和动力学的研究等，将会有新的进展，这将为微生物应用于污染物的实际修复提供理论指导，大大有助于对毒死蜱和TCP的污染产品或地区开展高效而彻底的生物修复工作。