硫酸盐还原菌^[1](Sulfate-reducing bacteria，SRB)是电厂循环冷却水系统中主要的厌氧型微生物之一，其形态、种类多样化，其中，脱硫弧菌属(Desulfovibrio)和脱硫肠状菌属(Desulfotomaculum)是SRB普遍存在的两个属^[2]。在电厂循环冷却水系统中，适宜的水温(一般20-40 °C)、pH值、溶解氧、空气、水中的大量菌种、丰富的营养物质(C、N、P等)及充足的含盐量等环境因素都为SRB的生长繁殖提供了有利条件，而SRB的生长繁殖会导致水管道中(及管壁上)产生污垢、黏泥甚至腐蚀，进而影响电厂设备的经济安全运行^[3]。加入杀菌灭藻剂(指可以杀死微生物的化学物质)是有效抑制或杀死循环水中SRB的措施^[4]。然而，早期实践过程中杀菌灭藻剂的投加存在很多不规范现象，往往单一药剂长时间使用，或投加剂量、时间不合理，使SRB产生一定程度的抗药性^[5]。针对SRB及其他细菌产生抗药性的问题，部分工厂盲目加大杀菌灭藻剂用量，此措施不仅会造成运行成本提高，而且较大浓度的杀菌剂亦有可能对环境造成严重的污染^[6]。而有些电厂则采用复配型杀菌灭藻剂，即两种或两种以上杀菌灭藻剂交替或同时使用，目前此种方法杀菌灭藻效果良好，但复配是否科学、合理，需要清晰地了解SRB的抗药机制，因此，研究细菌的抗药性及其机制在电厂循环水处理中具有一定的理论价值和实用价值。

1 细菌对杀菌灭藻剂抗药性的概念

目前，有关细菌对杀菌灭藻剂的抗药性的定义并不统一、明确，其中最被人接受的定义为：由于某一类(种)杀菌灭藻剂的长时期连续使用而使靶标菌群对杀菌灭藻剂的敏感性降低，进而使细菌能在更大浓度的杀菌灭藻剂下存活或生长，细菌获得的这种特性称为细菌对杀菌灭藻剂的抗性^[7]。细菌对某种杀菌灭藻剂产生抗药性后，对于结构近似或作用性质相同的杀菌灭藻剂也可显示抗药性，这种特性称为交叉抗药性。

细菌对杀菌灭藻剂的抗性可以分为固有抗药性和获得抗药性^[8]。细菌的固有抗药性与细菌的种属遗传有关，如革兰氏阴性细菌对青霉素的抗药性。而获得性抗药是细菌比较常见的抗药方式，是由于细菌本身发生了某些改变、突变或是从其他细菌中获得了某种决定性的基因，使原来不具有抗药性的个体产生了某种程度的新抗药性，如硫酸盐还原菌对季铵盐类的抗药性^[9]。

2 细菌对杀菌灭藻剂抗药现状

20世纪50年代Chaplin^[10]首次分离得到对季铵盐类杀菌灭藻剂有抗药性的菌株后，研究者开始重视细菌对杀菌灭藻剂的抗药性，世界上许多学者先后报道了多种细菌对常用的杀菌灭藻剂的抗药性。表1列举了1952年后多位学者发现的可产生抗药性的杀菌灭藻剂。

在其他细菌抗药性研究方面，1978年Gilbert等^[19]通过研究发现，铜绿假单胞菌对氯酚杀菌灭藻剂的最低抑菌浓度(MIC)增高5倍，提出氯酚抗药性细菌存在的可能性。之后1993年Brözel等^[11]对铜绿假单胞菌培养，发现从最低抑菌浓度36 g/L到80 g/L下均能生长，指出铜绿假单胞菌对氯酚杀菌灭藻剂抗性的存在。1985年，Sondossi等^[12]实验发现对甲醛杀菌灭藻剂产生抗性的铜绿假单胞菌，并于第2年通过不断试验诱导得到了抗甲醛杀菌灭藻剂的铜绿假单胞菌^[20]。1991年Brozel和Cloete^[15]报道了循环水中的微生物对异噻唑啉酮类杀菌灭藻剂产生抗药性，Brozel还发现铜绿假单胞菌对异噻唑啉酮产生抗药性并不是由于基因突变，而是一个适应过程。1995年Russell^[21]提出细菌对杀菌剂的抗药机制可以分为两种类型，即固有抗药性和获得抗药性。之后Russell^[17]又发现质粒介导金黄色葡萄球菌对有机阳离子杀菌灭藻剂(如氯己定或季铵化合物)的抗药性，而编码的质粒也减少了革兰氏阴性菌对杀菌剂的敏感性。2010年陈艺彩等^[22]分析工业中腐败微生物菌株抗异噻唑啉酮的水平，并对其种属进行分类鉴定后，发现工业微生物污染大多数是由细菌抗药性所引起。同一年，邹义春等^[23]研究铜绿假单胞菌I类整合子携带磺胺抗药基因(qacE△1-sul1)和阳性基因时发现，耐药基因普遍存在于铜绿假单胞菌中，而阳性基因对戊二醛、氯己定、碘伏存在抗性差异。

人们在研究细菌的单一抗药性时还发现细菌对2种杀菌灭藻剂也会产生交叉抗药性。1972年Carson等^[24]就首次指出铜绿假单胞菌对戊二醛、二氧化氯和季铵盐类杀菌剂(QACs)的交叉抗药性，之后关于细菌对杀菌灭藻剂的交叉抗药性研究也逐渐增多。1996年Dukan和Touati^[25]研究发现次氯酸和过氧化氢均可诱导产生oxyR自由基防御系统，导致大肠杆菌对过氧化氢、次氯酸、甲醛和卡松的交叉抗药性。1998年Chapman^[26]对多种杀菌灭藻剂产生抗药性的细菌进行了深入调查研究，指出大多数抗药性菌株均属于伯克氏菌属和假单胞菌属，并且发现假单胞菌属对季铵盐和过氧化氢可以产生交叉抗药性。2008年Martin等^[27]还发现抗二氧化氯的枯草芽孢杆菌对过氧化氢也具有抗药性。此外，还发现抗季铵盐的葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌以及抗三氯生的沙门氏菌对多种抗生素均具有抗药性^[28]。本课题组自2009年以来致力于电厂污垢细菌(SRB，粘液形成菌，铁细菌)的抗药性研究^[29]，并与2012年开展电厂污垢细菌对溴氯海因新型杀菌剂的抗药性研究，结果表明3类细菌均可对溴氯海因产生抗药性；本课题组检测了抗药菌的谷胱甘肽表达量，结果表明3种抗药菌的谷胱甘肽表达量明显高于非抗药菌的表达量，这些结果暗示进入细胞内部的杀菌剂可能是由于谷胱甘 肽——抗氧化成分的增多而失去杀菌效果，此外本课题组提出将溴氯海因与季铵盐类菌剂或戊二醛类杀菌剂进行复配来处理抗药菌可以明显提高细菌的致死率^[30]。近期本课题组的研究发现粘液形成菌对双季铵盐的抗药性是由杀菌剂诱导引起，同时粘液形成菌对双季铵盐、氯锭具有交叉抗药性^[31]，本实验还正在研究SRB对双季铵盐与氯锭的抗药性。

3 SRB对杀菌灭藻剂的抗药现状

在SRB抗药性的研究方面，1997年刘宏芳和董泽华^[9]通过稳定性试验得出SRB对非氧化型杀菌灭藻剂十二烷基二甲基苄基氯化铵(简称“1227”)的抗药性是由药物诱导所致，同时提出抗“1227”的SRB对甲硝唑没有交叉抗药性。2011年李光等^[32]通过研究驯化后的抗Cr(Ⅵ)的SRB在pH、培养温度影响下，对Cr(Ⅵ)去除率的影响时发现，抗Cr(Ⅵ)的SRB在较宽pH值和温度范围内都有较高的去除效率，这说明抗Cr(Ⅵ)菌群与正常菌群相比对温度、pH不敏感。同一年，庄文等^[33]对油田中SRB的酸化腐蚀机制进行研究得出，生物竞争排斥技术(Bio-competitive inhibition technology，BCX)是抑制SRB酸化腐蚀的有效措施，并且BCX技术在国外已开始应用。2013年海霞等^[34]研究油田污水中的细菌抗药性时发现，油田中常见细菌即SRB、铁细菌(FB)和腐生菌(TGB)对杀菌灭藻剂具有抗药性。有研究发现SRB一旦建立了适合自身生长的微生态环境后，就很难去除^{[35, 36]}。由此，人们意识到自然界中微生物的灭活是很困难的，与加入大量杀菌灭藻剂相比，不如开发新技术阻碍生物膜形成，因此，阻碍细菌生物膜的技术逐渐受到关注，周晓慧^[37]、温绍霞等^[38]、李晓霞等^[39]均对生物膜与细菌抗药性的关系进行研究，其中李晓霞等发现，大多数细菌具有自发形成生物膜能力，同时这种能力与头孢哌酮/舒巴坦的抗药性呈正比^[39]。

4 常用杀菌灭藻剂的杀菌机制与细菌对其的抗药机制

目前，电厂中常用的杀菌灭藻剂主要分为氧化性与非氧化性两种。不同杀菌灭藻剂其杀菌机制不同，从而导致同种细菌对不同杀菌灭藻剂的抗药机制也各不相同，因此细菌的抗药机制应根据不同杀菌灭藻剂的杀菌机制来分别进行研究。如前所述，电厂中细菌污垢的抗药性问题已普遍存在，但其机制研究相对滞后，而医药方面细菌的抗药性研究已深入到分子及基因水平，因医药抗药性方面的机理研究对循环水中细菌抗药机理研究具有一定的指导意义，表2显示了细菌对氧化性与非氧化性杀菌灭藻剂的杀菌机制的区别，下面也对两种杀菌灭藻剂的杀菌机制及细菌对其的抗药机制进行了详细、全面的阐述。

4.1 氧化性杀菌灭藻剂

氧化性杀菌灭藻剂大体可分为五大类：即溴基杀菌灭藻剂、氯基杀菌灭藻剂、二氧化氯、过氧化物和臭氧，其中最常用的是氯基杀菌灭藻剂。氧化性杀菌灭藻剂杀菌机理主要是强氧化性的杀菌灭藻剂先作用于细胞膜，使膜构成成分遭到损伤而引起新陈代谢障碍同时改变细胞膜的渗透性，之后膜内生物活性物质(酶类、脂蛋白、脂多糖、遗传物质等)发生氧化作用，使其受到破坏，改变细胞通透性，导致细胞溶解、死亡^[40]。研究表明氧化型杀菌灭藻剂不仅会破坏细胞内的磷酸脱氢酶，还氧化细胞内其他含巯基的酶等^{[41, 42]}。

细菌对氧化性杀菌灭藻剂的抗药机制主要包括以下3个方面：

(1) 细菌外膜(细胞壁和细胞膜)结构的改变。细菌细胞壁中均含有磷壁酸和肽聚糖，革兰氏阳性菌的细胞壁成分简单，杀菌灭藻剂可自由通过。而革兰氏阴性菌细胞壁中的脂多糖排列紧密对亲水性物质穿过细胞壁起到一定的阻碍作用，同时细胞外膜上特异性和非特异性的孔道蛋白关闭或消失均可阻止小分子亲水性物质进入。Winder等^[43]研究发现膜蛋白组成的改变导致铜绿假单胞菌对氯己定的抗性。Gandhi等^[44]也报道沙雷氏菌对氯己定的抗性与膜蛋白的改变有关。

(2) 作用位点的改变。由于杀菌灭藻剂是在固定的作用位点处发挥杀菌作用，因此，当杀菌灭藻剂的作用位点发生改变时，杀菌灭藻剂即使进入细胞，也对细菌没有影响，从而失去了杀菌效果。McMurry等^[45]研究发现三氯生是一种对细菌具有特异性作用位点的杀菌灭藻剂，可抑制大肠杆菌的Enoyl-酰基载体蛋白还原酶的活性，该酶由fabI基因编码，当大肠杆菌的fabI基因发生突变或过量表达时，大肠杆菌表现出对三氯生的抗药性。

(3) 细菌生物被膜结构的抵抗作用。细菌生物被膜(或称细菌生物膜Bacterial biofilm，BF)是指细菌黏附于接触表面，形成微菌落，同时向细胞外分泌大量多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等，从而将自身包裹在其中而形成的细菌聚集膜状物，这个膜状物就称为细菌的生物被膜。细菌生物被膜是一种与浮游细胞相对应的存在形式，其具有显著增强的抗药性。原因有以下几点：

1) 延长杀菌灭藻剂通过膜的渗透时间(受多 糖-蛋白质复合物的厚度、分子筛分作用和粘稠性影响)；2) 改变膜的渗透性(代谢物质的积累使渗透压发生改变)；3) 吸附抗杀菌灭藻剂的钝化酶，促进杀菌灭藻剂水解；4) 膜上多糖-蛋白质的复合物及其他还原性物质可与杀菌剂发生中和作用^[46]。

4.2 非氧化性杀菌灭藻剂 4.2.1 季铵盐类杀菌灭藻剂：烷基二甲基苄基氯化铵(简称“ADBAC”)属于阳离子型杀菌灭藻剂，是季铵盐类杀菌灭藻剂的典型代表，其杀菌机制为ADBAC属于阳离子型杀菌灭藻剂，其与细菌细胞壁上的负电荷之间形成静电极键，从而使细胞壁发生畸变，改变了细胞壁的通透性，破坏了细胞半渗透膜组织，使菌体细胞内的组分漏出而死亡。另外，杀菌灭藻剂吸附到菌体表面后，其亲油长链可以包住有脂质的细胞膜，并以主动运输的方式深入菌体细胞的类脂层与蛋白层，导致酶失活和蛋白质变性。佟会等^[47]等研究发现季铵盐杀菌灭藻剂与大肠杆菌的内源性物质结合形成中性的离子对，经由主动运输通过细胞膜。黄金营等^[48]合成了一种新型的长链烷基甲硝唑季铵盐，经研究发现此新型杀菌灭藻剂对SRB的杀菌性能优于“1227”，原因是其吸附在细菌细胞膜表面，改变了膜的渗透性。

细菌对双季铵盐类杀菌灭藻剂抗药机制可以从改变细胞膜上的蛋白和细菌膜结构两方面来说明。由季铵盐类杀菌灭藻剂的杀菌机理可知，此类杀菌灭藻剂以主动运输的形式进入细胞内部，需要膜上转运蛋白的转运作用，所以当转运蛋白发生突变，即细菌的外排系统发生改变时，细菌就对此类杀菌灭藻剂产生抗药性。从细菌膜方面来说，细菌膜中胞外基质与菌株之间的狭窄空间可成为阻止杀菌灭藻剂进入胞内的屏障。研究表明金黄色葡萄球菌的QACs外排系统是由两个基因系统编码，其中qacA和qacB编码高水平的抗药性，而qacC和qacD编码低水平的抗药性，同时也有研究发现，铜绿假单胞菌也具有3个与QACs外排系统相似的外排系统：MexA-MexB-OprM、MexC-MexD-OprJ和MexE-MexF-OprN^[46]。

4.2.2 有机硫化物类杀菌灭藻剂：异噻唑啉酮是一种新型的有机硫化物类杀菌灭藻剂，一般为绿色或橙黄色透明液体，其结构特点决定它几乎能在水中无限制溶解，在低浓度(0.5 mg/L)条件下异噻唑啉酮就能很好地抑制细菌生长繁殖^[49]。其杀菌机制为异噻唑啉酮对细菌细胞膜具有穿透能力，同时它又属于亲电活性的杀菌灭藻剂，因此当异噻唑啉酮与细菌接触后，可通过细胞膜上的通道蛋白进入膜内，之后很快与细菌细胞的亲核组分(如含-SH的蛋白质、酶或氨基酸)进行非特异性结合，发生亲电加成或取代反应，断开细胞中的肽键、抑制细胞的呼吸作用与三磷酸腺苷(ATP)合成，导致细菌生长繁殖受抑制或死亡。Brozel等^[15]对铜绿假单胞菌外膜蛋白(T蛋白)进行研究时发现，当T蛋白转录或表达受到抑制时，铜绿假单胞菌对异噻唑啉酮性就会产生抗药性。

异噻唑啉酮是我国大范围使用的杀菌灭藻剂，已有学者报道了细菌对异噻唑啉酮的抗药性^[15]。由于异噻唑啉酮是通过膜上的通道蛋白进入到膜内并且破坏内部结构，因此细菌的抗药机制是通过破坏膜上的通道蛋白，从而使杀菌灭藻剂进入不到细胞内，宏观上细菌就产生了抗药性。如Brözel等^[50]研究铜绿假单胞菌外膜蛋白(T蛋白)发现，当T蛋白表达或转录受抑制时，铜绿假单胞菌对异噻唑啉酮产生抗药性。

4.2.3 醛类杀菌灭藻剂：醛类杀菌灭藻剂可以将生物粘泥剥离下来，并使粘泥发生生物降解，尤其对SRB产生的粘泥处理效果很好。醛类杀菌灭藻剂上的自由醛基可与细胞壁上肽聚糖(是醛类杀菌灭藻剂发挥杀菌作用的主要作用位点)发生烷基化作用，直接或间接作用于细菌的蛋白质分子和碱性磷酸酶的不同基团，使其失去生物学活性，从而导致细菌死亡。

醛类杀菌灭藻剂的抗药机制可以从两方面进行说明：一方面，由于醛类杀菌灭藻剂的杀菌机制主要与细胞壁上的肽聚糖有关，所以当肽聚糖发生改变时，醛类杀菌灭藻剂进入细菌内部后，无法与肽聚糖发挥作用，因此细菌就产生了抗药性；另一方面，细菌可产生一种或几种钝化酶或水解酶来修饰或水解进入细胞内的醛类杀菌灭藻剂，使之失去生物活性，如甲醛及甲醛释放物。Chapman^[51]研究发现，在细菌正常生命活动中，细胞内生成的甲醛脱氢酶(FD)可以将醛类杀菌灭藻剂氧化生成甲 酸盐。

5 结束语

目前，细菌对医学药物产生抗药性的研究比较多，但细菌对杀菌灭藻剂的抗药性研究较少，尤其是对SRB的抗药性及其机制的研究更加稀少，这与其在电厂循环冷却水系统中引起的危害形成鲜明对比。因此SRB对杀菌灭藻剂的抗药机制的研究迫在眉睫，此研究有助于人们依据细菌不同的耐药机制将不同杀菌灭藻剂进行科学合理的复配，提高其杀菌效果，同时可降低杀菌灭藻剂使用量，有效地控制杀菌灭藻剂引起的污染。