由于石油开采、运输和使用过程中的污染、遗漏以及含油污水、钻井废弃液的肆意排放，石油烃类物质(Total petroleum hydrocarbons，TPHs)引起的污染已对人体健康和生态环境造成了巨大危害，并已成为一项世界性环境污染难题^[1]。石油污染环境的修复研究越来越受到人们的重视，目前针对TPHs污染环境的修复主要包括物理方法(如吸附法、超声波分离法、气浮法)、化学方法(如氧化法和破乳法等)以及生物修复法。其中微生物修复技术由于具有处理费用低、操作简单、无二次污染等优点而被公认为具有广阔的应用前景^[2]。如何获得高效、广谱、稳定、适应性强的TPHs降解菌是微生物技术修复石油污染环境的关键。据报道，自然界中已知的能够降解石油污染物的微生物菌群达二百多种，TPHs降解率最高达47%^{[3, 4, 5, 6]}。野生型菌株对TPHs降解普遍存在作用周期较长、降解效率低等问题，故采用高新技术选育出具有高代谢能力的TPHs降解菌具有重要的现实意义。

目前针对TPHs高效降解菌株的选育主要采用传统的物理诱变(X射线、He-Ne激光、紫外线)、化学诱变(LiCl、亚硝基胍、碱基类似物)或者两者相结合的方式，这些诱变方法通常存在毒性强、效率低、工作量大等不足。等离子体诱变是近年来新兴的一种高效率诱变技术，具有操作简便、条件温和、安全性高、诱变快速、突变率高等特点，可以大大提高菌种突变的强度和突变库容量^{[7, 8, 9]}。将等离子体与紫外线复合使用，既可克服紫外线单独诱变时负突变率高、子代生长缓慢的缺点，又可避免单一诱变所产生的诱变饱和效应，再结合多功能酶标仪高通量筛选技术，能够有效弥补常规诱变育种的不足^{[10, 11]}。

为获得遗传性状稳定的TPHs高效降解菌株，本研究从国内主要油田采出水中分离野生型TPHs优势降解菌，并对其进行紫外线与等离子体复合诱变，然后通过96孔板发酵法替代摇瓶培养法，结合酶标仪紫外双波长光谱法快速测定TPHs含量，建立一种高通量筛选TPHs降解菌株的新方法。本研究结果将为今后石油烃污染环境修复菌种的大规模选育及进一步应用提供参考。

1 材料与方法 1.1 样品及试剂

采出水样品取自国内各主要油田(大庆油田、长庆油田、新疆油田、辽河油田、中原油田)的不同采出水处理站，样品取回后4 °C保存；原油样品由长庆油田采油三厂提供。

配置微生物分离纯化常用培养基所需试剂及提取、检测用试剂皆为国产分析纯。

1.2 培养基

无机盐培养基(g/L)：CuCl₂ 0.000 5，FeSO₄ 0.005，ZnCl₂ 0.005，MnCl₂·4H₂O 0.05，CaCl₂ 0.02，K₂HPO₄ 4.0，KH₂PO₄ 0.5，MgSO₄·7H₂O 1.0，NaCl 1.0，无菌水1 L，用4 mol/L NaOH调节pH至7.5。

石油烃降解培养基：在无机盐培养基中加入灭菌(1×10⁵ Pa，20 min)的原油至终浓度为100 mg/L。固体培养基加入1.5%琼脂。

LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10，氯化钠10，酵母提取物5，加水至1 L，NaOH调整pH为7.4−7.6，高压蒸汽灭菌(1×10⁵ Pa，20 min)后使用。固体培养基需加入1.5%琼脂。

1.3 检测方法 1.3.1 菌数检测及致死率计算：菌数检测采用活菌平板菌落计数法以及血球计数板计数法：致死率(%)=(诱变前总菌数−诱变后总菌数)×100/诱变前总菌数。

1.3.2 TPHs含量测定：(1) 酶标仪双波长紫外光谱法。孔板发酵中TPHs含量的测定利用BioTek公司Synergy 2型多功能酶标仪简化的双波长紫外光谱法完成，TPHs中带有C=C共轭双键的有机化合物在紫外区215−230 nm处有特征吸收，而含有简单非共轭双键和具有n电子的生色基团有机化合物在250−300 nm范围内有较强吸收带，吸收强度与特殊键化合物含量成正比例。TPHs紫外光谱的特征峰值一般位于225 nm及254 nm处。以石油醚为萃取剂(石油醚:发酵液=1:2，体积比)，根据225 nm和254 nm双波长下吸光度差值确定TPHs含量^[12]。

(2) 红外光谱法。TPHs含量的红外光谱法测定参照HJ/T 637-2012^[13]。利用四氯化碳萃取样品中的TPHs (四氯化碳:发酵液=2:3，体积比)，并使其通过含硅胶填料(40 μm，60 A pores) 0.5 g的固相提取小柱，四氯化碳冲洗。将经硅胶吸附后的萃取液转移至4 cm比色皿中，以四氯化碳作为参比溶液，于2 930、2 960、3 030 cm⁻¹处测量其吸光度A_{2 930}、A_{2 960}、A_{3 030}，与标准样品对比计算TPHs的浓度。

1.4 菌株分离

取油田采出水样品各1 mL分别加入到装有49 mL LB培养基的摇瓶中，35 °C、180 r/min富集培养48 h，检测菌体数量的变化。当菌体浓度达到10⁷ CFU/mL左右时，将0.1 mL菌悬液稀释涂布于石油烃降解平板培养基初筛，35 °C恒温培养48 h，选择在石油烃平板培养基上透明圈明显、生长茁壮的单菌落接入装有50 mL石油烃降解液体培养基摇瓶中复筛(每株菌接3摇瓶)，35 °C、180 r/min培养72 h，红外光谱法检测发酵液中TPHs含量，计算TPHs降解率，将降解率最高的菌株分离保存备用。

1.5 菌株鉴定

菌株的形态学鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》^[14]，培养24 h后观察菌落形态。生理生化鉴定利用BioMerieux公司全自动微生物分析仪(Vitek 2 Compact)及其配套的革兰氏阴性菌鉴定卡GN分析完成。分子生物学鉴定利用通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-TACGGCTACCTTACGACTT-3′对菌株PW04的16S rRNA基因序列进行PCR扩增，100 μL PCR反应体系分装两管：10×缓冲液10 μL，MgCl₂(25 mmol/L) 6 μL，dNTPs (10 mmol/L) 2.5 μL，DNA模板(20−50 ng/L) 2 μL，引物(10 μmol/L)各1.5 μL，双蒸水70 μL。PCR反应条件：95 °C 3 min；95 °C 50 s，52 °C 50 s，72 °C 2 min，30个循环；72 °C 10 min。引物合成以及PCR产物的纯化和测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。利用Blast将菌株的16S rRNA基因序列与GenBank数据库中已知的序列进行比较，并采用MEGA 5.05软件构建系统发育树^[15]。

1.6 紫外线-等离子体复合诱变 1.6.1 菌悬液制备：将菌株PW04接种于LB液体培养基中，35 °C培养至对数生长期，1 000×g离心15 min收集菌体，用无菌生理盐水洗涤2次后制成菌悬液。血球计数板计数并调节菌体浓度为1.0×10⁷/mL左右备用。

1.6.2 紫外线诱变：取对数生长期菌悬液5 mL，转入直径9 cm的培养皿中，磁力搅拌。紫外灯(功率15 W，照射距35 cm)分别照射1、2、3、4、5、6、7 min。取诱变后菌悬液0.1 mL稀释涂平板，以不经诱变的菌悬液为对照，培养48 h计算致死率。

1.6.3 紫外线-等离子体复合诱变：取对数生长期菌悬液5 mL于紫外灯下照射2 min，红光下，取0.2 mL均匀涂布于无菌平皿中，无菌风吹干形成菌膜，镜检无细胞重叠，以氦气为工作气体，气流量设定为10 L/min，作用距离3.0 mm，作用功率120 W的等离子体射线辐照处理^{[16, 17]}，处理时间分别设定为10、20、30、40、50、60、70 s。将经过不同辐照时间处理的菌株以2 mL无菌生理盐水洗脱制成菌悬液。以未经诱变的菌株为对照，稀释涂平板，培养48 h，计算致死率。

1.7 孔板培养

取经复合诱变的菌悬液0.1 mL，涂布于LB平板上，根据生长菌落的圆整和丰满度挑取一定数量的菌株转接到96孔种子孔板，种子孔板装有100 μL的LB液体培养基。对照孔接入未经诱变菌株，于35 °C、180 r/min的恒温摇床培养48 h后转入发酵孔板培养。发酵孔板装有700 μL石油降解培养基，接种量为10%，于 35 °C、180 r/min振荡培养72 h^[18]。

1.8 高通量检测

将发酵孔板置于孔板离心机中1 000×g离心30 min；取上清液200 μL加入空白孔板中，另加入100 μL石油醚，35 °C恒温摇床中180 r/min振荡10 min后，每孔移取200 μL加入酶标板中，利用多功能酶标仪检测225 nm和254 nm下的吸光值差，计算发酵孔板中TPHs含量。

1.9 摇瓶培养及遗传稳定性测定

由高通量筛选得到TPHs高效降解菌，为了保证其遗传稳定性，将其连续传代5次，每次传代后经种子摇瓶和发酵摇瓶培养，并测定发酵液中TPHs含量。种子摇瓶装液量50 mL，于35 °C、180 r/min的恒温摇床中培养48 h；发酵摇瓶装液量100 mL，接种量10%，35 °C、180 r/min 培养72 h。红外光谱法测定TPHs含量。

2 结果与分析 2.1 菌株分离

从石油降解平板上挑取透明圈大、生长茁壮的单菌落，将其分别接入石油降解摇瓶中，计算其TPHs降解率结果如表1所示。所分离的菌株对TPHs降解率平均为46.6%，降解率最高可达57.5%，选取TPHs降解率最高的菌株PW04保存备用。

2.2 菌株鉴定结果

菌株PW04在LB培养基中生长时菌落呈乳白色，圆形，凸起，边缘整齐，大小约为(0.8−1.0) μm× (2.0−3.0) μm，革兰氏染色阴性，菌体呈梭棒形。利用全自动微生物分析仪检测菌株PW04生化实验详情如表2所示，菌株PW04与多食鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium multivorum)典型生化谱相似度达95%。以16S rRNA基因序列一致性为基础构建相关种属细菌在内的系统发育树，结果如图1所示，菌株PW04与Sphingobacterium multivorum NBRC14947相似性高达100%。综上所述，由油田采出水中筛选的石油烃优势降解菌PW04可以确定为多食鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium multivorum)。

2.3 紫外线-等离子体复合诱变选育 2.3.1 紫外线诱变选育：S. multivorum PW04菌悬液经不同时间紫外线照射致死率如图2所示。随着照射时间的延长，致死率增加，7 min时全部致死。由于紫外线有较强的杀菌能力，诱变时间短，致死率低时正突变率不高，但是如果诱变时间过长，部分高活性菌株也可能致死，工业诱变育种过程中一般将紫外线致死率控制在60%−80%之间，可保证菌体发生最大程度的突变。菌株S. multivorum PW04辐照2 min时致死率在80%左右，因此选取2 min为紫外诱变处理时间。

2.3.2 紫外线-等离子体复合诱变选育：等离子体处理不同时间致死率如图3所示。随辐照时间增加致死率整体不断上升，0−20 s致死率增加较快，至20 s时致死率约80%，30 s时致死率略有下降后继续上升，当等离子体射线辐照时间为60 s时，致死率近100%，这可能是由于离子注入到一定程度激活了菌体的修复机制，但当注入时间继续增加细胞损伤无法修复。因此，将等离子体诱变辐照时间设定为30 s。

2.4 TPHs高效降解菌的高通量筛选 2.4.1 孔板与摇瓶发酵性能对比：将复合诱变后的菌液稀释涂平板，挑取一定数量的单菌落分别接入种子孔板和摇瓶中，在35 °C、180 r/min培养48 h之后，以10%的接种量将孔板和摇瓶的种子液转接入发酵孔板和摇瓶中，相同条件下培养72 h，96孔板与摇瓶发酵TPHs降解率随培养时间变化如图4所示。

发酵初期，摇瓶发酵培养菌株的TPHs降解率较高，但在培养约36 h后，孔板发酵的TPHs降解率超过摇瓶发酵并持续到约48 h后，孔板发酵菌株TPHs降解率不再增加为止。造成这一现象的原因可能是S. multivorum PW04降解TPHs为需氧过程^[19]，初期摇瓶含氧量相对较高，培养36 h后孔板的溶氧状况较摇瓶好。同时TPHs检测方法的不同也是出现这一现象的重要原因。孔板发酵与摇瓶发酵整体上有较好的相关性，可利用其替代摇瓶发酵验证菌株TPHs降解效率。

2.4.2 TPHs高效降解菌株筛选：复合诱变所得突变株对TPHs降解率结果如表3所示(同一菌株接3个发酵孔，TPHs含量取平均值，发酵孔编号为相邻3个平行实验中TPHs降解率最高孔编号)。从2个96孔板中共筛选出TPHs降解率在80%以上的突变型菌株4株，其中菌株S. multivorum PW04-H10的TPHs降解率最高，达85.1%，与野生型菌株S. multivorum PW04相比，降解率提高了48%。

2.5 菌株遗传稳定性分析

选取TPHs降解率在80%以上的4株突变型菌株：S. multivorum PW04-H10、S. multivorum PW04-F3、S. multivorum PW04-G9和S. multivorum PW04-A6进行传代培养，并通过摇瓶发酵确定每一代菌株的TPHs降解率，结果如表4所示。

经单因素方差分析，突变株S. multivorum PW04-H10、S. multivorum PW04-G9和S. multivorum PW04-A6不同世代对TPHs降解率的差异不显著，说明这3株菌的TPHs降解遗传稳定性较好。而菌株S. multivorum PW04-F3的TPHs降解率在不同世代差异极显著且呈逐渐下降的趋势，说明该突变株遗传稳定性差，菌株退化严重。综上，选取菌株S. multivorum PW04-H10、S. multivorum PW04-G9和S. multivorum PW04-A6进行后续研究。

3 讨论

紫外线诱变是微生物育种中最为常用的方法，但是单纯的紫外线诱变效果并不理想，段盛文等^[20]

利用紫外诱变选育的TPHs降解菌降解率仅为42.85%。因此，有学者采用紫外线-激光复合诱变、紫外线-微波复合诱变等方法对野生型TPHs降解菌进行诱变，以提高其TPHs降解率，通过上述诱变方式获得的突变株其TPHs降解率最高可达75%^{[21, 22, 23, 24, 25]}。等离子体作为一种新型诱变手段，通过适当剂量的中性活性粒子作用于微生物致其细胞结构和DNA损伤修复能力发生改变最终引起突变^[26]。本研究首次对筛选的野生型TPHs降解菌进行紫外线与等离子复合诱变处理，所选育出的突变株TPHs降解率最高可达85.1%，较野生型菌株提高了48%，较其他方式获得的突变株提高约13.5%，实验结果显示所得突变株遗传性能稳定，展现了良好的诱变效果，推测其原因是由于紫外线诱变作用于DNA，使其产生嘧啶二聚体，但微生物本身具有自我修复机制，而等离子体诱变通过其活性粒子作用于微生物细胞，改变其DNA损伤修复机制，突破了紫外单独诱变的局限，故可以筛选出TPHs降解率较高的优秀突变株。

复合诱变过程中产生大量的突变体，常规手段(如摇瓶发酵和红外光谱检测)选育TPHs高效降解突变株操作复杂、成本高，难以实现高通量筛选。以96孔板替代摇瓶发酵，采用酶标仪紫外双波长光谱法快速测定突变株的TPHs含量，该技术微型、高效、低成本，96孔板一次即可培养检测96个样品，实现了突变株的快速筛选。

本文主要集中于TPHs高效降解菌株的诱变及选育工作，还缺乏对紫外与等离子体复合诱变的机理以及TPHs降解机理等方面的研究。此外，遗传稳定性分析只进行到了第五代，这些都需要在今后的实际生产应用过程中做进一步探讨和研究。

4 结论

将紫外线和等离子体两种诱变技术复合使用，通过96孔板发酵处理，结合多功能酶标仪建立的高通量筛选方法，最终选育出3株TPHs高效降解菌株S. multivorum PW04-H10、S. multivorum PW04-G9和S. multivorum PW04-A6，TPHs降解率分别达到了85.1%、82.7%和82.9%。降解率最高的突变型菌株S. multivorum PW04-H10与野生型菌株相比，提高了48%。经单因素方差分析，这3株突变菌对TPHs降解遗传性状稳定，基本实现了选育的目的，可直接应用于石油烃污染环境的修复中。