石油是国家发展的重要能源保障，但也存在突出的环境问题。石油的开采、运输、储存、加工及各种泄露渗漏事故的发生会对环境造成污染和破坏，威胁人类和其他生物的生存和发展，并已成为全球范围内亟待解决的重要问题。当今石油污染状况日趋严峻，全世界每年通过落地原油及事故泄漏等途径排入到环境中的石油污染物约为8×10⁶ t。我国是石油生产和消费大国，全国共有油井总量约为2×10⁵口，每年约有6×10⁵ t原油汇入环境，造成我国3.3×10⁶ hm²的土壤面积受到石油污染。每年因石油污染带来的环境污染和破坏造成约有2 000亿元的经济损失，是我国进行可持续发展战略的一大 障碍^[1]。

伴随着石油污染生物修复技术的广泛应用，人们在污染生物修复领域逐渐认识到直接投加高效降解菌的效果难以长时间维持，而且由于土壤中90%−99%的微生物无法进行分离培养^[2]，传统的分析技术无法反映污染物群落的真实情况，对不可培养的微生物在污染物生物降解中的作用也无法确认。随着分子生物学技术的发展，无论是cDNA基因文库的建立，还是多态性分析的进步，都为污染环境的生物修复提供了全新的技术支持。自1985年Pace等^[3]第一次利用rRNA测序技术分析环境中微生物群落以来，分子生物学手段在生物修复技术中的应用已成为一个研究热点。目前，分子生物学技术已逐渐广泛应用于提取、确认、测序功能基因和监测环境中微生物群落结构的动态变化等修复研究之中，特别是在石油烃修复研究中已逐渐从传统的分离培养向分子生物学技术转变^{[4,5,6,7,8,9]}。利用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)技术可以更全面准确地获取样品中的遗传信息，开展降解机理的研究，在掌握降解基因的基础上可以构建降解基因工程菌株或降解途径互补的混合菌剂，提高生物修复效率。利用多态性研究方法，可以用来分析实际环境样品中微生物群落多样性、种群动态等，获得比传统培养法更完整和准确的信息。

1 环境中主要石油烃降解微生物及其特征

自然界中能够降解石油烃类化合物的微生物种类有数百种，七十多个属，主要是细菌、真菌和藻类三大类型的生物，多存在于土壤环境中和水体环境中^[10]。细菌在海洋生态系统中占主导地位，而在淡水和陆地生态系统中真菌则是更重要的微生物种类^[11]。水环境中能较好地降解石油烃的细菌有假单胞菌属、无色杆菌属、节杆菌属、微球菌属、诺卡氏菌属、不动杆菌属、短杆菌属、棒杆菌属、黄杆菌属，真菌有假丝酵母菌属、红酵母菌属、掷抱酵母菌属等^[12]。在受污染的水体中除细菌和酵母菌外，还有许多丝状菌。在土壤中，真菌的种属比细菌多，土壤中主要降解石油烃的降解菌除上述水体中的菌外，还有分枝杆菌属。藻类也是降解石油烃污染物的微生物种群之一，如颤藻属(Oscillatoria)等^[13]。这些藻类能对多种石油烃进行降解，包括苯、酚和萘等。张海荣等^[14]从大港油田区石油污染盐碱化土壤和油泥中筛选出10株耐盐碱石油烃降解菌，经鉴定分别为苍白杆菌属、葡萄球菌属、迪茨菌属、棒状杆菌属、无色杆菌属、微杆菌属、芽孢杆菌属，耐盐碱能力实验表明石油烃降解菌在不同微生物种属中广泛存在，并具有较好的耐盐碱特性。李兵等^[15]从辽河油田低温石油样品中筛选出一株低温石油降解菌LHB16，经鉴定为嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)，LHB16菌株能够有效地降解石油烃(尤其是长链烷烃)。Daane等^[16]从污染的底泥以及高盐沼泽中分离出以多环芳烃为唯一碳源和能源的菌株，对石油烃具有较好的降解效果。Stauffert等^[17]研究了反硝化细菌在石油污染降解中的作用，发现反硝化变形杆菌在石油污染中大量存在，沉积物生物扰动分析表明它们在石油烃的降解中起关键作用。也有研究报道了在硫酸还原菌DeltaproteobacteriumN47中发现与多环芳烃降解相关的代谢基因^[18]。

自然环境中的微生物极其丰富，但没有受石油污染前，其自然群落结构或微生物种群并不适合石油污染环境。当其生存环境被污染后，微生物群落结构会发生变化，能适应石油污染的种群继续发展，而一些不能适应石油污染的种群可能会受到抑制，或被完全淘汰。在未受石油污染的生态系统中，石油降解菌不足土壤中微生物总数的0.1%；而在受石油污染的生态系统中可达到100%，降解菌数升高几个数量级^[19]。微生物降解石油烃类化合物的能力取决于微生物群落和种属组成。研究表明，当菌群处于石油污染环境中时，能降解和利用烃类化合物的微生物数量会急剧增长。Atlas^[20]报道在正常环境下石油烃降解菌一般只占微生物群落的1%。而当环境受到石油污染时，降解菌的比例可以提高到10%。石油污染能够诱导降解石油的微生物种群的生长，在受石油污染地区的降解菌的比例和数量明显上升，污染程度越重降解菌数量越多，说明石油污染能够使石油降解菌发生富集^[21]。

由于石油成分的复杂性，其降解需要多种微生物共同作用，一种微生物降解有机污染物产生的代谢产物可能是另一种微生物生长所需要的底物，这种混合微生物降解模式比单一微生物降解模式更具优势^[22]。Sathishkumar等^[23]从石油污染土壤中分离出57株石油降解菌，其中4株IOS1-7、BPS2-6、HPS2-5和BPS1-8分别属于芽胞杆菌属(Bacillus sp.)、棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)和假单胞菌属(Pseudomonas sp.)降解能力较强。将4株具有较强降解能力的细菌与57株降解菌组成的菌群一起研究它们在不同pH和温度条件下的降解效果，结果发现当温度为35 °C、pH为7.0时各个菌株和菌群的降解效果最好，其中菌群的降解率最高(77%)，其他4株纯菌(IOS1-7、BPS2-6、HPS2-5和BPS1-8)的降解率分别为69%、64%、45%和41%。说明对于原油这种复杂成分的有机污染物的降解，降解菌群较单菌具有优势。韩慧龙^[24]从河南中原油田长期石油污染土壤中，利用自主设计的土壤环流诱导驯化反应器，筛选得到可以具有石油降解能力的细菌13株，真菌2株以及酵母菌1株，针对石油为混合复杂化合物的特点，将分离得到的具有较强降解能力的细菌阴沟肠杆菌和真菌刺孢小克银汉霉菌组合成真菌-细菌协同修复体系，提出了真菌-细菌协同修复的构想，证明真菌对复杂化合物具有较好的降解能力，产生的简单的代谢产物成为体系中细菌的降解底物进行进一步降解，达到彻底降解环境中石油污染物的目的。

2 微生物分子生态学研究方法

研究表明，一些条件下地理环境条件的差异对微生物群落的影响大于污染物的影响^[25]。但是由于微生物测定还存在很多问题，不可能对土壤中的微生物逐一培养和鉴定。现在，分子生物学技术可以直接从环境土壤中提取总DNA、克服传统细菌培养弊端，能在种、属或更高分类单元水平上对石油降解菌进行鉴定，可以在降解石油烃功能基因多样性和定量的分析、降解酶活性的测定、筛选和构建高效的石油降解工程菌等过程中发挥重要作用^[26]。

2.1 基于PCR的基因指纹图谱技术 2.1.1 变性/温度梯度凝胶电泳(DGGE/TGGE)：变性梯度凝胶电泳(Denatured gradient gel electrophoresis，DGGE)是由Lerman等在20世纪80年代初期发明的，起初主要用来检测DNA片段中的点突变^[27]。Muyzer^[28]在1993年首次将其应用于微生物群落结构研究，并证明该技术在揭示自然微生物的遗传多样性和种群异化方面具有独特的优越性，因此被广泛应用到分子微生物生态学研究领域。后来又发展出其衍生技术——温度梯度凝胶电泳(Temperature gradient gel electrophoresis，TGGE)，目前该技术已成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一^[29]，广泛应用于海洋、土壤、高温热泉、琥珀、根际、沙丘等环境微生物生态的研究。

PCR-DGGE/TGGE在污染土壤修复领域应用十分广泛，该技术可以揭示微生物群落结构的动态变化，并给出相应的菌株信息。此外，该技术准确性高、重现性好。Gao等^[30]研究了不同土壤盐碱度和原油浓度下微生物的群落变化，通过DGGE分析在盐渍化和原油污染土壤中活跃的细菌种类，发现放线菌、γ-变形菌、厚壁菌门、异常球菌-栖热菌门在降解石油烃过程中占主导地位。任瑞霞等^[31]采用DGGE和磷脂脂肪酸分析法两种方法对沈抚灌区水改旱田石油污染土壤的微生物群落结构进行了对比研究，结果发现两种方法得出的结论一致。 Bacosa等^[32]研究了海啸沉积物中微生物降解多环芳烃的潜力和微生物群落结构，结果表明10种微生物中有7种能够有效降解芴(去除率100%)和菲(去除率95%)，只有4种能够降解部分芘，PCR-DGGE分析显示每个样品中微生物都由优势菌种主导，包括可以降解多环芳烃的鞘氨醇单胞菌、假单胞菌属、鞘氨醇杆菌，以及以前未知的降解菌(如藤黄单胞菌)。通过对切下条带进行序列分析或通过与独特的探针杂交鉴定群落组成，可方便地了解环境被干扰后的微生物群落变化或某种指示微生物的命运^[18]。

2.1.2 限制性片段长度多态性(RFLP)：限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphy)分析就是利用限制性内切酶特性及电泳技术，对特定DNA片段的限制性内切酶产物进行分析，从而分析微生物的遗传多样性或用于微生物的种群分类。如何晶晶等^[33]以不依赖于培养的16S rDNA-PCR-ARDRA技术系统评价了我国最大的石油污水罐区-沈抚灌区污灌对土壤细菌遗传多样性的影响，并对微生物群落中的优势菌群进行了研究。该技术的主要缺点是工作量偏大、重复性差，不适宜大量土壤样品的高效性分析。

末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)又可称为16S rRNA的末端限制性片段分析技术，它是RFLP方法的进一步发展^[34]。该技术已成功用于各种微生物群落分析比较、微生物群落多样性及结构特征等，如丁晨^[35]采用T-RFLP 技术和16S rRNA基因克隆文库技术检测产甲烷富集培养过程中古菌和细菌的群落结构变化趋势。Yuan等^[36]使用T-RFLP技术分析了胜利油田注水井(S122ZHU)的微生物多样性，基因T-RFLP图谱的Shannon-Wiener多样性指数表明细菌与古菌在注水井中的种类数要比生产井中的高。Katsivela等^[37]用T-RFLP检测石油污染土壤在14个月的生物修复中群落结构的变化 ，发现肠杆菌属和苍白杆菌属在实验期内都有明显检出，而产碱杆菌属仅在前10个月内有检出。Kaplan等^[38]在对石油烃污染土壤的修复过程中，利用16S rRNA末端限制性片段分析方法对微生物群落进行了跟踪。

2.1.3 单链构象多态性分析(SSCP)：单链构象多态(Single strand conformation polymophism，SSCP)就是指构成DNA双链之一的单个碱基发生变化影响到其空间构象，进而影响到电泳图谱的现象^[39]。SSCP分析技术可以用非变性聚丙烯酰胺凝胶区分相同大小但不同二级结构的PCR产物，是对16S rRNA基因扩增产物进行分析的另一种简便有效的方法。Lee等^[40]在1996年首次报道将SSCP技术应用到环境样品微生物群体多样性分析，验证了不同菌株间条带的特异性。Holly等^[41]用SSCP技术研究发现在植物根际土壤中大量存在古菌Crenarchaeot，该类微生物以往一直被认为只存在于极端嗜热环境中。Mnif等^[42]采用SSCP技术结合克隆测序技术分析了突尼斯油田生产水域的微生物多样性，发现随着时间变化，ASHTART47和ASHTART48油田中微生物多样性发生了显著的变化，而DOULEB油田微生物多样性较为稳定。

2.1.4 核糖体基因间隔序列分析(RISA)：RISA分析法对rrs和rrl基因(intergenic spacer，IGS)之间间隔序列进行长度多态性分析，间隔序列大小随种群而变化，一般在50 bp−1.5 kb之间。引物目标区域在邻近区域内部，因此rrs部分基因可以被共扩增，随后对特定条带测序可以对种群某个种进行分类学鉴定^[43]。不同扩增的IGS片段可以根据大小用聚丙烯凝胶电泳分开。Petric等^[44]采用RISA与实时PCR技术联用分析发现，生物刺激和生物强化后多氯联苯污染场地的土壤中微生物群落结构发生明显改变，放线菌、α-和γ-变形菌具有明显的群落优势，其中放线菌的优势最为明显。然而RISA法灵敏度较低，可检测到的微生物种类多样性偏少，如Rosano-He rnández等^[45]采用RISA法研究墨西哥坎佩切海岸受石油污染底泥微生物群落结构，研究发现该技术可获得的微生物多样性较低，仅能检测到5个种群的17种菌。

研究表明，由于16S rRNA基因的异质性，可能会导致高估样品中微生物的种类^[46]。Pei等^[47]发现在883个原核基因组(代表568个不同的物种)中，425种物种的每个基因组含有2−15个16S rRNA基因的副本，235种物种的基因组中发现了16S rRNA基因序列之间的差异。Sun等^[48]对2 013组完整测序的细菌和古细菌的基因组进行分析，发现952组基因组(585种物种)具有基因异质性。对16S rRNA基因异质性引起的微生物多样性过度估计进行评价，结果表明，在独特的水平，全长16S rRNA基因可以产生高达123.7%高估；而在3%的水平，16S rRNA基因V6区域中的过度估计为112.9%。进一步研究表明，基因异质性往往集中在特定区域，对细菌来说，V1和V6区域多样性最高，相比之下，V4和V5区域多样性程度最低。可见，由于16S rRNA的多样性，导致PCR扩增产生偏差，因此16S rRNA序列分析技术在应用时会使得测量的数值被人为的提高^[49]。

2.2 荧光原位杂交技术(FISH)

荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization，FISH)技术是一种非放射性原位杂交方法，它采用特殊荧光染料标记核酸探针，在细胞内与特异的互补核酸序列杂交，通过激发探针的荧光来监测信号^[50]。该技术不依赖于PCR，避免了PCR扩增造成的偏差，其精确性、特异性更高，而且还具有显微技术的可视性，能够监测和区分环境中不同的微生物，评价微生物群落结构的变化，同时提供形态学、数量、空间分布以及细胞环境方面的信息^[51]。

FISH技术最初的应用是在微生物多样性较差的体系，如原位鉴定细菌的共生体，或者鉴定有磁趋向性的便于分离的细菌。目前FISH技术被广泛用于废水生物处理过程中微生物群落以及特定微生物种群的动态^[52]。如Zeng等^[53]利用FISH技术对胜利油田采油厂回注水中硫酸盐还原原核生物(SRPs)进行检测，结果表明SRPs在胜利油田回注水中具有极高的种群多样性，广泛分布于4个细菌门和1个古菌门，其中优势菌属为脱硫弧菌属(Desulfovibrio)和脱硫肠状菌属(Desulfotornaculum)，同时也检测到了Archamglobus属的SRPsA，证明了古菌类SRPs是回注水中一个不容忽视的硫酸盐还原微生物种群。Genovese等^[54]模拟石油泄漏 后石油烃在海底沉积物中埋藏，采用酶联-荧光原位杂交技术(CARD-FISH)、定量PCR和16S rRNA基因克隆库分析微生物变化，发现石油的添加影响土著专性好氧石油烃降解菌(OMHCB)，1个月以后食烷菌解环菌属和海杆菌生物群落增加了1/3，最后沉积物中已观察不到土著OMHCB。张君等^[55]采用FISH技术分析油藏中的产甲烷古菌的变化规律，研究表明在模拟油藏条件下，培养30 d后，产甲烷菌的含量逐渐升高，前期由其他微生物代谢产生的乙酸等产物作为产甲烷菌所需的代谢底物被消耗，培养50 d后，产甲烷菌的生长又促进了其他微生物的生长，总菌数增加。FISH技术还可用于监测土壤中重金属污染、有机物污染及修复过程中微生物群落以及特定微生物种群的动态^[56,57]。

2.3 高通量测序技术(NGS)

高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，因此称其为下一代测序技术(next generation sequencing，NGS)，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deep sequencing)。其特点是高通量、低成本，可以同时对多个单独的DNA分子进行测序，这一改进比起每条序列需要单独分析的Sanger法提供了极大的方便^[58]。Lladó等^[59]采用焦磷酸测序技术研究了工业木榴油污染土壤中真菌和细菌的生物多样性，结果表明污染土壤中占主导作用的细菌群体是阿尔法变形杆菌，镰刀菌属和足放线病菌属是主要的真菌。Hamady等^[60]展示了一种可以平行同时分析多个样品的策略，在对不同的样品进行PCR扩增时在引物的5′末端加上由8个碱基组成的标记(barcode)，再根据barcode将不同来源的序列区分开来，在同一次测序反应中 同时分析了286个环境样品，这一方法在分析多个环境样品微生物群落多样性领域得到了极为广泛的应用。

2.4 稳定同位素示踪技术(SIP)

稳定同位素示踪技术(stable-isotope tracerprobing，SIP)是近年来发展起来的一种研究石油烃生物降解作用机理的新方法，它将人工合成的同位素标记特定的化合物，追踪标记物的变化规律，目前该项技术广泛应用于环境微生物学、生态学、生物医学等领域^[61]。Gutierrez等^[62]采用DNA-稳定同位素示踪技术研究了微生物对石油烃降解的作用机理，确定了几种降解脂肪烃(食烷菌、海杆菌)和多环芳烃(类单胞菌、解环菌、嗜冷杆菌)的微生物。DNA-SIP技术采用稳定性同位素如¹³C-标记底物培养环境样品，之后提取环境微生物基因组总DNA并通过超高速密度梯度离心将¹³C-DNA与¹²C-DNA分离后，进一步采用分子生物学技术分析¹³C-DNA，将能揭示复杂环境样品中同化了标记底物的微生物作用者，将特定的物质代谢过程与复杂的环境微生物群落物种组成直接耦合，可以发掘重要功能基因，揭示复杂环境中微生物重要生理代谢过程^[63]。

3 石油烃降解基因的研究 3.1 石油烃降解基因的测定及应用

石油烃生物降解的关键步骤是降解微生物功能基因的表达，产生特异的降解石油烃的酶，参与石油类污染物的代谢转化。烷烃和芳香烃是复杂石油污染物的主要组成物质和造成生态毒性的主要来源，对烷烃和芳香烃的降解是生物修复石油污染土壤的主要目标。编码烷烃和芳香烃降解酶的基因研究已成为国内外研究的热点。目前好氧降解的生物修复过程中主要涉及的烷烃降解基因为能编码降解C5−C12长度的烷烃单加氧酶基因alkB和细菌细胞色素P450基因^[64]；对芳烃的降解基因有tmoA-，C12O、C23O类，编码降解萘和菲的酶的nahAc和phnAc基因^[65]。微生物石油烃的厌氧降解中编码苯甲基琥珀酸合成酶的α、β、γ三个亚基的基因^[66]及编码烷基琥珀酸合成酶(ASS)的基因assA1和assA2^[67]成为目前厌氧降解的重点。石油降解基因通常作为生物标志物广泛被用于土壤、地下水、海水、沉积物，甚至是恶劣极地环境下的降解基因的多样性分析，并用来衡量该地区的土著微生物对石油烃生物降解潜能，从而对石油烃的生物处理能力及自然降解过程做出很好的评价^{[68,69,70,71]}。

烷烃和芳香烃降解基因多样性的研究发展非常迅速，主要集中在烷烃基因的结构形态、多样性、全长序列、表达调控研究方面。Adetutu等^[72]在研究澳大利亚一石油炼制厂区污染土壤alkB降解基因多样性和降解微生物降解潜能时，采用焦磷测序的方式研究土壤降解微生物的丰度，并设计针对噬油假单胞菌GPo1、红球菌属、伯克氏菌、绿脓假单胞菌、不动杆菌扩增的特异性引物，对扩增产物进行DGGE实验检测土壤中主要存在的菌属。Kao等^[73]采用实时聚合酶链反应，DGGE技术联合生物培养技术对中国台湾南部环境样品中对编码苯酚羟化酶、甲苯单加氧酶、萘双加氧酶、甲苯单加氧酶、甲苯双加氧酶和联苯双加氧酶的基因进行了定量，并对降解基因的DGGE群落分布进行分析。针对环境样品总DNA的16S rDNA和针对特定石油降解基因的特异性扩增PCR技术为基础的DGGE、基因定量、克隆杂交测序在石油污染土壤中主要烷烃和芳香烃降解基因多样性及丰度研究上有重要的应用价值和科研意义。

简并引物的设计和杂交技术的应用为综合评价石油污染土壤中降解菌的基因类型、检测新的石油降解基因提供了技术上的突破。石油烃降解基因的测定还存在很多问题，不同生物分类的石油烃降解基因的序列存在很大差异^[74]，通常设计的引物只是针对某种菌属的微生物降解基因设计的特异性，难免对研究地区的石油降解基因的多样性分析不全面，如Whyte等^[75]只是针对恶臭假单胞杆菌GPo1、红球菌Q15、不动杆菌ADP-1设计特异性引物，采用群落杂交方法对南北极土壤中alkB降解基因多样性进行研究。作为一项重要进展，Kloos等^[76]根据降解基因alkB的红素氧还蛋白的全部长度序列与GenBank上已知具有降解烷烃能力的微生物序列进行同源性的配对比对，设计了能够包含大多数降解烷烃降解基因alkB的简并引物，并对土壤样品DNA进行扩增引物的克隆和测序。van Beilen等^[77]设计针对扩增降解烷烃基因P450简并性引物，并将其导入到恶臭假单胞菌GPo12中监测其在烷烃基质中的生长状况。Tuomi等^[78]针对高度保守的萘降解基因nahAc设计简并引物，对芬兰南部3个受石油污染的土壤样品进行多样性检测。马迎飞^[79]根据双加氧酶的大亚基片段设计简并引物对降解菌株的PAHs降解基因进行检测，对双加氧酶的活性检测确定了极地地区的双加氧酶的活性受温度、石油浓度等条件的制约和诱导。

针对石油污染物的复杂成分和降解代谢基因的多样性，国内外目前使用的简并引物大都借鉴原有设计的引物进行扩增，对设计的简并引物是否都试用不同环境条件下的样品检测有待进一步确认。此外，在微生物石油烃降解基因的多样性分析中，假基因和引物二聚体的干扰作用也非常常见。如澳大利亚的Wasmund等^[80]研究地汶海域沉积物中alkB降解基因时采用简并引物进行扩增克隆，通过描述该地区alkB降解基因克隆数与蛋白操作单元之间的关系时发现简并引物扩增产物测序没有达到任何文库的渐进线，说明样品中的alkB降解基因多样性高于测序所获得的结果。实时荧光定量PCR技术采用的多数为针对特定降解细菌种属的降解基因，在引物设计上难免会漏掉土壤中潜在的降解石油烃的微生物降解基因。简并引物 的目的基因扩增主要应用于基因类型的多样性检测，但在基因的定量检测中应用很少。而且，设计合成的简并引物扩增产物长度大都满足不了定量RCR的使用条件。Park等^[81]比对33种萘降解菌序列，设计4对针对萘降解基因NahAc扩增的简并引物用于研究受萘诱导下降解基因的多样性变化，并用定量PCR进行基因定量检测。发现简并引物只有nahAc-7F/R具有很好的扩增性。因此，如何设计包含更多降解微生物降解基因同源序列信息的 简并引物，并且能用于实时荧光定量PCR的定量检测，来监测所研究地区的降解石油烃功能微生物多样性和降解基因的丰度，全面反映微生物的降解潜能是石油污染土壤的生物治理中需要进一步解决的一个难点。

我国在烷烃和芳香烃降解基因多样性研究方面也取得众多成果，第三海洋研究所的Wang等^[82]采用简并引物进行alkB基因扩增，随后将目的基因克隆，限制性内切酶切割测序的方法研究厦门海域alkB基因的多样性，并设计了5对针对主要烷烃降解菌的特异性引物进行定量PCR，建立了降解基因克隆文库分析。常州大学Liang等^[83]基于杂交测序原理采用高通量的基因芯片技术设计包括能杂交检测烷烃、芳香烃及其他石油烃衍生的有机污染物降解基因的芯片，对我国5个主要油田的石油污染土壤中功能降解基因进行广度检测。目前虽然基因芯片技术在测定降解基因多样性上已经非常先进，但是对于那些功能调节依赖蛋白质磷酸化-去磷酸化等方式，而与其是否表达或表达量高低无关的代谢酶，核酸类基因芯片技术的应用就会失去意义。此外，对主要的降解基因的定量也无法用基因芯片技术来实现。因此，开发一种既能全面分析石油污染土壤中石油降解基因多样性，又能对该样品中微生物降解潜能进行准确预测的技术非常必要。

3.2 基因芯片技术

DNA微阵列技术(DNA microarray)又称DNA芯片(DNA chip)或基因芯片(gene chip)，是利用单链DNA或RNA分子(目标分子)与固定在固体支撑物上的互补分子(探针)可以进行杂交而发展起来的技术^[84]。基因芯片是以玻璃片、尼龙膜或硅片为载体，用高速机器人将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段有序、高密度地排列固定在载体上制成。这些被固定到载体上的已知序列的核苷酸片段就是探针。待测的样品核酸分子(未知序列，称为目标分子或靶分子)经标记，与固定在载体上的DNA阵列中的点按碱基配对原则进行杂交。通过放射自显影或激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描、检测杂交信号强度而获取所测样品分子的数量和序列信息，最后用计算机软件进行数据的比较和分析，获得目的材料中有关基因表达强弱的表达谱，从而对基因的序列和功能进行大规模、高通量的 研究^[85,86,87]。

微生物群落结构和种群鉴定所用到的芯片主要有3种：(1) 系统发育的寡核苷酸芯片(POAs)，芯片中含有用于分类的寡核苷酸探针(如16S rRNA基因)，该芯片主要是用于微生物群落组成和结构的系统发育分析；(2) 群落基因组芯片(CGAs)，芯片中含有不同菌株或种群的全基因组序列，该技术可以根据可培养的成分描述微生物群落结构；(3) 功能基因芯片(FGAs)，芯片中含有编码特定生化过程关键酶的基因探针，该技术可用于检测自然环境中微生物群落的生理状态和功能活动。Liang等^[88]采用GeoChip芯片研究了东北地区石油污染土壤的微生物群落功能结构，研究发现，功能基因丰度和多样性随着污染物浓度的增加呈下降趋势。污染土壤的细菌、古细菌和真菌总量分别下降了10%、40%和80%。一些功能基因(如pgl、rbcL、nifH和nor)和纤维素酶、几丁质酶、漆酶等编码基因的丰度显著降低。相反，一些编码降解邻苯二酚、联苯等酶的基因丰度显著增加。通过基因芯片的设计，对我国不同地区油田石油烃降解微生物的测定结果表明不同区域的降解微生物有显著不同，微生物群落受石油烃污染程度、地理位置及土壤的地球化学性质影响^[83]。尽管目前针对16S rRNA的基因芯片还处在基础研究阶段，但随着16S rRNA、DNA技术的广泛应用，该技术在修复进程的快速检测、修复现场的信息化和标准化管理方面将具有广阔的应用前景。

4 总结与展望

分子生物学方法可以不依赖于培养直接获得微生物的信息，为微生物群落结构的研究提供了一条新的途径。在自然界中存在大量可挖掘和利用的抗逆性、高降解能力等优异基因的微生物资源，但通过传统方法却不能分离和检测，而分子生物学技术可以克服此障碍，检测到更多的微生物种群，并可在分子水平对其生态功能进行分析、操作。

传统分子生物学方法存在PCR扩增偏差、引物偏向的缺陷，尽管FISH方法不依赖于PCR，避免了PCR扩增造成的偏差，然而引物的不匹配同样会造成对分析结果的错误估计；高通量测序技术克服了传统PCR局限性，为微生物分子生态学的研究提供了更广泛的应用前景。现代分子生物学技术在揭示功能微生物在生物修复中的作用机制、探索微生物之间的关系、阐明土壤修复机理等方面具有重要作用。

将传统的技术与不断完善的现代分子生物学技术结合，探讨石油污染土壤微生物多样性，对于了解在石油污染生物降解过程中起重要作用的微生物菌群以及理解、评价和进行原位生物修复具有重要意义。将微生物分子生态学技术应用于石油烃污染及修复中，应注意以下几个方面：

(1) 石油降解微生物具有种类多、随环境变化大的特点，实际污染区域所处的环境往往差异很大，有必要在利用分子生物技术建立微生物种群动力学模式的同时，进一步结合研究对象所在的地层或污染环境的地质及地球化学的相关情况，完善技术方法同现场环境的接合性，这样有助于提高实验的稳定性及提供处理效率不佳时的解决方法。

(2) 应进一步加强对石油烃生物修复过程中功能基因的研究，针对修复过程中的微生物变动十分复杂这一情况，抓住降解基因这一解决问题的关键点，通过对主要烷烃降解基因如alk，及新的降解基因如针对长链烃降解基因的研究，结合DGGE分析及醌图谱分析等手段实现微生物群落的测定和对修复过程中功能基因即降解基因的追踪。

(3) 加强高通量测序技术和宏蛋白组学、代谢组学在石油烃污染修复中的研究，从不同层次和角度全面分析微生物分子生态学的群落结构和功能代谢，为石油污染微生物修复的应用提供更全面的科学依据。