细菌和藻类都属于自然界中数量极其庞大的物种，广泛存在于土壤、水体等环境中，对生物圈中物质循环和能量流动起着重要作用，两者共存于同一环境时也将发生直接或间接的相互作用。1972年，美国科学家Bell和Mitchell引入“藻际环境(Phycosphere)”这一概念，意在描述藻类生物分泌胞外产物促进周边细菌生长的一种微环境区域^[1]。在藻际环境中，藻与细菌都可以产生各自的胞外产物，如氨基酸、多肽、糖类、维生素和毒性因子等，对共存的对方既可能有促进，也可能有抑制的作 用^[2]。这些相互作用对藻与细菌的生理功能、群落组成、抵抗逆境、生态功能的发挥、藻华的产生和消退、重要代谢物的生成等方面具有重要影响。研究细菌与藻类的相互作用不仅有助于深入认识两者在自然界中发挥生态功能的方式和机理，也将有利于改造和利用这些生物，如环境治理和生物质能源等产业。近年来一些综述文章已经介绍了淡水水华、海洋赤潮、水产养殖和污染治理等过程中菌-藻相互作用的形式和特点^{[3, 4, 5, 6, 7, 8]}。

藻类生物包含了原核和真核两大类，因此 菌-藻之间的相互作用涉及到种类繁多的生物。同其他物种之间的相互作用类似，菌-藻相互作用也具有宿主专一性、代谢物的交换与信号传导等特点^{[9, 10, 11]}。研究表明来源于细菌的维生素对许多真核藻类的生理功能起到重要作用，而维生素B₁₂ (VB₁₂)由于其独特的性质、来源和功能在细菌-真核藻类相互作用研究中受到了越来越多的关注^{[12, 13, 14, 15, 16]}。本文将主要介绍近年来细菌-真核藻类相互作用中维生素B₁₂的功能研究，并讨论该领域近期的发展方向。

VB₁₂是一种水溶性含钴的咕啉类化合物，又称钴胺素(Cobalamin)，最初被应用于恶性贫血的控制，在20世纪四五十年代被首次从肝脏中分离得到并鉴定出结构，于1972年实现人工合成^[17]。VB₁₂是结构最复杂的维生素，由中心咕啉环、中心环轴向上配基部分(R)和含有核苷酸环的向下配基组成(图 1)^[18]。由于R配基的不同，VB₁₂具有多种存在形式，在生物体中具有重要辅酶功能的VB₁₂主要为腺苷钴胺素(Adenosylcobalamin)和甲基钴胺素(Methylcobalamin)^[19]。

图　1 VB12的结构与甲硫氨酸的生物合成途径 Figure　1 Structure of Vitamin B12 and the biosynthetic pathway of methionine 注：A：VB12的结构，R可为甲基、腺苷或氰等不同基团；B：甲硫氨酸合成途径，甲硫氨酸可由VB12-非依赖型甲硫氨酸合成酶METE或VB12-依赖型甲硫氨酸合成酶METH催化完成，下游生成产物主要为蛋白质和甲基化反应供体S-腺苷甲硫氨酸(S-AdoMet). Note: A: The structure of Vitamin B12, the upper ligand R can be CH3 (Methylcobalamin), 5¢-deoxyadenosine (Adenosylcobalamin), or CN (Cyanocobalamin). B: The biosynthetic pathway of methionine, methionine formation is catalyzed by VB12-independent METE or VB12-dependent METH, and methionine is mainly used to synthesize proteins and S-AdoMet.

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目前已知的VB₁₂依赖型酶有二十多种^{[17, 19]}，主要包括：以腺苷钴胺素为辅酶的异构酶，如甲基丙二酰辅酶A变位酶MCM (methylmalonyl-CoA mutase)、谷氨酸变位酶(Glutamate mutase)、核糖核苷酸还原酶(Ribonucleotide reductase)等；甲基钴胺素依赖型的甲基转移酶，如甲硫氨酸合成酶METH (Methionine synthase H)。这些VB₁₂依赖型酶在不同物种中分布并不均匀：在细菌中可以发现几乎所有VB₁₂依赖型酶；高等动物中只含有2种，即甲基丙二酰辅酶A变位酶MCM和甲硫氨酸合成酶METH；而高等植物却不含有任何已知的VB₁₂依赖型酶^[20]。

VB₁₂是在自然界中唯一一种只能由细菌(包括真细菌和古细菌)合成的维生素，该合成过程需要20种以上的酶参与，在不同的细菌中会有所不同，如Pseudomonas denitrificans可在有氧条件下合成VB₁₂，而Salmonella typhimurium只能在厌氧条件下合成VB₁₂^[21]。某些细菌只具有部分合成途径，如大肠杆菌只能在添加了前体物钴啉醇酰胺(Cobinamide)的情况下才能够合成VB₁₂^{[22, 23]}。由于产VB₁₂细菌是自然界VB₁₂的唯一来源，这些细菌对其他需要VB₁₂的生物将具有重要影响^[24]。

目前报道真核藻类生物中以VB₁₂作为辅酶的酶有3种：VB₁₂依赖型甲硫氨酸合成酶METH、核糖核苷酸还原酶RNRII和甲基丙二酰辅酶A变位酶MCM^[25]。这些VB₁₂依赖型酶的存在使得产VB₁₂细菌在真核藻类的生长繁殖过程中起到重要作用，也奠定了两者相互作用的生化基础。

在甲硫氨酸合成途径中，一些真核藻类还存在一种VB₁₂非依赖型甲硫氨酸合成酶METE，在无VB₁₂条件下也可催化生成甲硫氨酸和四氢叶酸(图 1B)^{[25, 26]}。METE和METH两者并无明显的同源性且具有不同的催化机制^[26]：METE直接催化甲基由CH₃-H₄PteGlu_n转移到homocysteine的反应，底物CH₃-H₄PteGlu_n上的Glu基团数至少为3；而METH催化的反应中需要结合VB₁₂作为甲基转移过程中的中间体，底物CH₃-H₄PteGlu_n上的Glu基团数可以为1，在完成反应后，METH-VB₁₂需要额外的还原体系和AdoMet使酶重新活化。

基因组学的研究结果表明，甲硫氨酸合成酶METE和METH在真核藻类的分布与VB₁₂的依赖性有着直接的联系^[25]：对15种真核藻类基因组序列的分析揭示出约一半藻类基因组中只含有METH基因，这些藻类的生长严格必需VB₁₂；莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)等一些藻类同时含有METH和METE，在无VB₁₂的条件下也可由METE合成甲硫氨酸，在生长中并不需要VB₁₂；只有两种藻类(Coccomyxa sp.和Cyanidioschyzon merolae)只含有METE而不含有METH，在生长中也不需要VB₁₂。由此可以看出，如果藻类基因组只含有METH，则这种藻类(Emiliania huxleyi除外)的生长必需VB₁₂；而如果这种藻类含有METE，其生长则不需要VB₁₂。值得思考的是，METH在真核藻类基因组中的存在频率明显要高于METE，暗示着VB₁₂依赖型的甲硫氨酸合成方式在这些生物的进化过程中具有很高的保守性，在生理生化功能上可能扮演着更重要的角色^[25]。

以上研究表明，约一半真核藻类在生长中严格需要外源VB₁₂^{[12, 20]}，而海洋有害藻华中大部分藻类也都是VB₁₂缺陷型^[16]。近年来，藻类如何获得足够的VB₁₂已经成为藻类生物学研究中的一个重要问题。

由于地理位置和测量技术的不同，自然环境中可溶性VB₁₂的含量在不同文献中的差异较大。例如，在地中海和东北太平洋等海洋环境中可溶性的VB₁₂含量为0−10 pmol/L，而在美国长岛和南加州一些海湾地带VB₁₂含量分别可达5-87 pmol/L和0-30 pmol/L^{[27, 28]}。尽管某些区域VB₁₂含量可以满足一些藻类生长对VB₁₂的最低需要，而大部分地区的VB₁₂实际上处于检测线以下的水平^[15]，这意味着在不同微观环境中VB₁₂的浓度将是一种藻类生长的限制因子。而Co这一微量元素的含量也是VB₁₂形成的制约因素之一。Sañudo-Wilhelmy等的研究表明VB₁₂可以显著促进大体型浮游藻类 (>5 μm)的生长，VB₁₂和氮素往往是这些藻类生长共同的限制因子^[28]。Koch等发现额外添加VB₁₂或与其他限制因子(N或Fe)联用都可以显著促进浮游藻类的生物量，并且改变生物群落的结构^[29]。这些结果表明VB₁₂对水体藻类生长、初级生产力以及物种群落结构都有重要影响。

作为自然界VB₁₂的唯一来源，产VB₁₂细菌对真核藻类的生长将具有重要作用。研究结果已经表明，某些真核藻类可以在与产VB₁₂细菌的共生中获得充足的VB₁₂。Croft等在VB₁₂依赖型的前沟藻Amphidinium operculatum的培养物中分离到具有产VB₁₂能力的盐单胞菌Halomonas sp.，两者可以相互交换光合产物和VB₁₂，形成稳定的互惠共生体 系^[12]。Wagner-Dobler等在利马原甲藻Prorocentrum lima中分离到共生细菌Dinoroseobacter shibae，并测定了该菌的基因组序列，结果表明该菌具有合成VB₁和VB₁₂的能力，并提供这些维生素用以维持藻类宿主的生长能力^[30]。

实验室共培养实验也证实，VB₁₂依赖型真核藻类可与产VB₁₂细菌形成互惠的共生体系：细菌提供VB₁₂给藻类，而藻类提供光合产物给细菌作为碳源。如Kazamia等发现VB₁₂依赖型藻类Lobomonas rostrata可以与产VB₁₂的百脉根根瘤菌Mesorhizobium loti在无外加碳源和VB₁₂的培养基中长期共生^[31]，说明两者可以互相利用对方产生的有益代谢物，而外源添加的碳源或VB₁₂反而会扰动两者的平衡。在上述研究的基础上，Grant等结合实验数据和数学模型分析VB₁₂是简单的来自细菌的裂解释放还是受到相互作用的调控这一问 题^[32]。结果表明共生体系中VB₁₂的产量远高于细菌单独培养时的产量，模型分析同样支持VB₁₂的产生受到藻类共生的调控。这些结果暗示着两者共生时将存在着一些分子识别和调控机制。

温度是生物最为敏感的外部环境因子之一，环境温度超过正常温度范围时，生物体内生理生化反应、个体生长和发育将受到危害，严重条件下会有致死效应。以莱茵衣藻为例，在超过正常生长温度(25 °C) 10 °C的条件下，细胞生长速度和生物量严重下降，而在高温40−42 °C条件下会很快死 亡^{[33, 34]}。藻类的耐热研究将有助于深入了解藻类抵御逆境和响应气候变化的生理生化机制，也有利于增强藻类抗逆的能力来提高有益产物的产量。

在关于莱茵衣藻耐热的研究中，我们发现某些产VB₁₂细菌(多为根瘤菌^[18])在与莱茵衣藻共生时可以显著地增强衣藻的耐热能力，并初步阐明了其机理：在高温逆境下莱茵衣藻METE基因的表达受到严重抑制，而METH基因仍然保留部分表达量；在VB₁₂存在情况下只有METH可以维持酶活并满足甲硫氨酸合成的需要，从而提高莱茵衣藻的耐热能力^[14]。这表明VB₁₂不仅对真核藻类的生长有作用，在抵抗逆境中也发挥着重要作用。研究还发现，在增强莱茵衣藻耐热能力的功能上，产VB₁₂细菌多来自于α-Proteobacteria，暗示着两者的共生具有一定的宿主专一性^[14]。这些结果为进一步深入研究产VB₁₂细菌-真核藻类相互作用的分子机制奠定了新的基础。

与上述结果类似的是，甲硫氨酸合成途径在多种生物的正常生理活动和逆境反应中都起着重要作用。大肠杆菌在高温和氧化逆境下METE将迅速失活，菌体表现为甲硫氨酸缺陷型的表型^{[35, 36]}，而METE关键氨基酸的突变(C645A)可使蛋白耐受氧化并可提高菌体抗高温和醋酸盐的能力^[37]；植物体内约20%的甲硫氨酸将用于合成蛋白质参与各种生理功能，其余80%将用于合成生物体内主要的甲基供体S-腺苷甲硫氨酸，用于DNA、RNA和蛋白质等分子的甲基化反应^[38]；在高温处理下一些植物METE基因的表达也会被抑制^[39]；VB₁₂可显著影响动物体内蛋白质组学图谱^[40]和DNA的甲基化特 征^[41]。这些结果也提示着我们在VB₁₂分子机制研究中应注重甲硫氨酸下游产物的生理生化功能。

VB₁₂在参与酶促生化反应时，也会对细胞内其他代谢途径或基因表达进行调控。研究表明，在多种真核藻类中，VB₁₂的存在可以显著抑制METE的表达^{[12, 25]}。Bertrand等研究了甲藻Phaeodactylum tricornutum和Thalassiosira pseudonana在不同VB₁₂浓度情况下的转录组和蛋白质组，发现在低VB₁₂情况下，甲藻具有多种方式应对VB₁₂的缺乏：提高VB₁₂转运蛋白表达量CBA1，降低对VB₁₂的需求和减少甲硫氨酸合成酶活性^[42]。Helliwell等对莱茵衣藻的研究表明，VB₁₂除了抑制METE以外，还将抑制S-腺苷同型半胱氨酸水解酶S-adenosylhomocysteine hydrolase (SAHH)和丝氨酸羟甲基转移酶Serine hydroxymethyltransferase 2 (SHMT2)的表达^[43]。然而，VB₁₂如何调控这些基因的表达还有许多待解之谜。在原核生物中，VB₁₂可以通过结合核糖开关(Riboswitch)对目标基因的表达进行调节^[44]，而在真核藻类中，目前还没有发现VB₁₂特异型的核糖开关^[43]。

一些研究也证实细菌与真核藻类共生中一方的基因表达将受到对方的调控。Teplitski等研究了莱茵衣藻分泌物对具有产VB₁₂能力的苜蓿根瘤菌的影响，结果表明衣藻分泌物中含有细菌群体感应分子(N-acyl-l-homoserine lactone，AHL)类似物，并可以调节细菌的群体感应功能^[45]。我们的实验结果表明在高温条件下衣藻METE基因的表达将受到野生型根瘤菌的严重抑制，而不受VB₁₂合成突变体的抑制。这些结果为全面分析共生双方如何相互调控基因表达提供了研究基础。

综上所述，我们可以看到VB₁₂由于其独特的性质、来源和功能在细菌与真核藻类相互作用中具有重要的作用，相关研究成果将有助于我们了解自然环境中细菌与藻类之间的互惠共生的原理和生态学意义，以及物种间协同进化的认识。以此为重要内容的细菌-真核藻类相互作用研究有望成为一种模式体系，用以从共生双方分子互作的机理、代谢产物的交换、遗传上的协同调控以及共生的生态效应等角度，拓展原核生物与真核生物特别是微生物与低等浮游植物之间分子相互作用的新研究领域(图 2)。结合近期的研究进展，我们认为有几个方面应得到重点关注。

图　2 细菌-真核藻类相互作用的研究模式 Figure　2 The research mode of bacteria-algae interaction

图选项

在许多研究证实产VB₁₂细菌与真核藻类之间互惠共生的同时，应关注到在自然环境中两者共生的真实形式。特别是在不同环境条件情况下，应加强研究这些相互作用对彼此双方适应环境因子和气候变化的作用。此外，由于生态系统的复杂性，也应将这种共生放在多物种与环境相互作用的背景下，研究各因子之间的相互作用网络与相关生态效应。

产VB₁₂细菌与真核藻类的相互作用的分子机理研究方兴未艾。许多细节问题亟待解决，如：细菌与藻类共生过程中VB₁₂的分泌和转运，甲硫氨酸下游产物在藻类生理生化过程中的作用，高温逆境下宿主专一性及其机理，共生双方之间的信号传导与新基因的功能鉴定等。一些基因组信息已知、遗传操作技术成熟的物种，如根瘤菌和莱茵衣藻等，应在图 2的模式中成为研究主体，这些机制研究将极大丰富我们对细菌与藻类之间分子相互作用的认识。

转录组、蛋白质组、基因甲基化组、单细胞拉曼光谱检测等方法是近年来快速发展的技术，在生物学研究的各领域有着广阔的应用前景。在产VB₁₂细菌与真核藻类共生研究中，应注重这些新方法与传统微生物学、分子生物学技术的有机结合，以加快取得重要的研究进展。

应加强以上基础研究与实际应用的结合。由于VB₁₂在细菌与真核藻类相互作用中的重要性，相关研究成果应在有害水华的预警和防治、水产养殖、藻类培养技术的优化、藻类产量和抗逆水平的提高等领域寻求积极的应用。