为了满足日益增长的蔬菜市场需求，各地建设了大批的设施蔬菜生产基地，而这类生产方式因其高水肥投入的特点，造成了土壤质量衰退、氮素投入大量损失和以N₂O为代表的土壤温室气体排放量增加等环境问题^[1]。粮田土壤在改造成为设施菜田之后，土壤理化水文特性均有深刻的改变。雷宝坤等调查发现设施菜田中土壤碳、氮含量相对附近粮田有所增加，但同时碳氮比和土壤pH下降，氮磷钾养分富集、有盐渍化趋势^[2]。Zhou等利用稀释涂布法、Biolog系统以及脂肪酸分析研究了不同来源的未耕作土及6种菜田的土壤微生物群落多样性，发现番茄菜田的微生物群落特征与其他土地有显著的不同，不同农田系统中的土壤微生物群落与土壤地球化学元素、湿度和有机质等显著相关^[3]。Lin等研究了土壤由水稻-小麦轮作体系转为设施菜田后的土壤微生物特征，发现随着土壤酸化以及盐分积累，微生物活性显著降低，微生物量和磷脂总量也有了大幅下降^[4]。这些研究加深了人们对设施菜田土壤退化问题的担忧。

另一方面，很多研究已报道了高投入的设施菜田土壤具有氧化亚氮气体排放量高的特征^{[5, 6]}。氧化亚氮(N₂O)是一种强有力的温室气体，它的温室效应是同分子CO₂的约300倍。在过去一百年间，随着工农业的发展排放量急剧升高，它对全球气候变化的影响不容忽视。据估计平均每年土壤过程贡献了56%−70%的全球N₂O排放(10.3−12.8 Tg N/a)^[7]。N₂O的来源与微生物代谢过程密不可分。设施菜田的施肥管理方式对土壤微生物及其功能具有显著的影响。宋贺等对寿光设施菜棚的定位实验指出，减氮(RN)以及添加秸秆处理(RN+S)相对传统施肥处理(CN)显著改变了两类反硝化基因的结构，并且降低了NO以及N₂O在反硝化产物中的比例^[5]。Min等对比了江苏宜兴设施菜田与当地同源小麦-大米轮作粮田的年度N₂O排放量，发现传统施肥管理的设施菜田N₂O排放量(8.1 kg/hm²)是同源粮田 (1.13 kg/hm²)的7倍以上^[8]。然而，粮田改变用途为设施菜棚后，其土壤的菌群结构与微生物功能会发生怎样的变化，相关的对比研究报道较少，尤其是这种改造如何影响土壤的反硝化能力及N₂O产生模式还未见报道。因此，本研究对一个新改造的设施菜棚的土壤与棚外粮田同源土壤细菌数量和结构进行了比较，还测定了两种土壤分别在厌氧和好氧条件下培养时产生的气体动力学特征，以及在该培养过程中土壤氮的转化。本研究揭示了两种不同管理模式对土壤的菌群反硝化能力的影响，探讨了设施菜田N₂O排放的机制。

本实验的样品采集地点在山东省寿光市古城街道罗庄村(36°55′N，118°45′E)。2004年建成第一代蔬菜大棚，2012年翻新升级为第二代蔬菜大棚。该棚每年种植两季番茄。棚内的土壤来自该棚周围种植小麦的粮田。棚内土壤和棚外粮田的土壤理化性质见表1。

DGGE电泳使用Dcode电泳系统，美国Bio-Rad公司；Light cycler 96定量PCR仪，瑞士Roche公司；气相色谱，美国Agilent公司(GC-7890A)；自动连续在线培养检测体系，Robot系统，挪威生命大学研发^[9]。真空氦气清洗系统，上海金城公司。

设施菜田传统施肥处理(CN)的土壤管理方式：在每季番茄移栽前，投入风干鸡粪作为有机肥，施用量分别为秋冬季146 kg N/hm²、冬春季 211 kg N/hm²。随后进行翻耕。追肥时间根据作物的生长发育情况决定，每次施用尿素量约 120 kg N/hm²，每次灌溉量约为50 mm，磷、钾肥施用量分别是180 kg P₂O₅/hm²和460 kg K₂O/hm²。小区面积为7.8 m×5.6 m，3次田间重复。

棚外粮田(FM)土壤管理方式：在播种前，施入375 kg/hm²磷酸氢二铵作为底肥，相当于 80 kg N/hm²。追肥时间根据作物的生长发育情况决定，每次施用尿素量约为70 kg N/hm²，每次灌溉量约为30 mm。

土壤采集于2013年3月14日进行，此时菜田已施用鸡粪，处在第一次灌溉后与第二次灌溉之间，是全年N₂O排放高峰期^[10]。使用五点混合法取传统施肥各小区和棚外粮田表层0-20 cm土壤 100 g左右，过2 mm筛，用于DGGE分析的土样储存于-80 °C。用于土壤培养的土样避光储存于4 °C。

土壤总DNA提取采用Griffiths等^[11]的方法，DNA样本经过琼脂糖凝胶电泳验证片段长度，微量紫外分光度计(Biodrop)检测DNA纯度及总量。

土壤总菌16S rRNA基因V3区特异性扩增引物为：上游引物P3 (5′-CGCCCGCCGCGCGCG GCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和下游引物P2 (5′-AATACC GDGGCTGDTGG-3′)^[12]，其中P3引物包括序列为5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG-3′的40 bp GC夹。具体体系以及程序参考Huang等^[13]研究。

土壤总菌特异性扩增引物为：Uni331F (5′-TCC TACGGGAGGCAGCAGT-3′)和Uni797R (5′-GGAC TACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3′)^[14]，目的片段长度约466 bp。20 μL定量PCR扩增反应体系：模板DNA 20 ng，2×Mix (含Taq酶) 10 μL，引物各 0.5 μmol/L，用无菌水补齐体积。扩增反应程序：95 °C 3 min；95 °C 30 s，60 °C 30 s，72 °C 60 s，80 °C读板收集荧光信号，共40个循环；95 °C 5 s，随后从65 °C以每循环0.5 °C递增到95 °C。

反硝化细菌nirS基因特异性扩增引物为：nirS- cd3A (5′-AACGYSAAGGARACSGG-3′)和nirS-R3Cd (5′-GASTTCGGRTGSGTCTTSAYGAA-3′)^[15]，目的片段长度约为473 bp。20 μL定量PCR扩增反应体系：DNA 20 ng，2×Mix (含Taq酶)10 μL，引物各0.5 μmol/L，用无菌水补齐体积。扩增反应程序：95 °C 3 min；95 °C 30 s，58 °C 30 s，72 °C 30 s，80 °C读板收集荧光信号，共40个循环；95 °C 5 s，随后从65 °C以每循环0.5 °C递增到95 °C。

反硝化细菌nosZ基因特异性扩增引物为：nosZ-2f (5′-CGCRACGGCAASAAGGTSMSSGT-3′)和nosZ-2r (5′-CAKRTGCAKSGCRTGGCAGAA- 3′)^[16]，目的片段长度约为267 bp。20 μL定量PCR扩增反应体系：DNA 20 ng，2×Mix (含Taq酶)10 μL，引物各0.5 μmol/L，用无菌水补齐体积。扩增反应程序：95 °C 3 min；95 °C 30 s，58 °C 30 s，72 °C 60 s，80 °C读板收集荧光信号，共40个循环；95 °C 5 s，随后从65 °C以每循环0.5 °C递增到95 °C。

用细菌16S rRNA基因(27F/1492R)^[17]和反硝化细菌nirS基因(nirS-cd3A/nirS-R3Cd)、nosZ基因(nosZ-2f/nosZ-2r)引物对土壤总DNA进行PCR扩 增^[18]，将对应的扩增产物割胶纯化回收。纯化产物采用pGEM-T Easy vector (Promega)连接后，转化到DH5α感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)中，以含Amp抗生素(50 mg/L)以及表面涂布有 100 μL 0.1 mol/L IPTG和25 μL 0.05 g/mL X-Gal的LB平板37 °C培养后，挑选阳性克隆。提取阳性克隆质粒，送英潍捷基公司测序验证后，测定质粒DNA的浓度并制备定量PCR标准曲线。

取300 ng PCR产物于变性剂梯度范围为33%-54%，浓度为8%的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，电泳条件为：恒温60 °C，1×TAE缓冲液，电压200 V，时间240 min。结束后用SYBR green I染色，凝胶成像系统拍照。

取两种土样各10 g放入120 mL血清瓶中，每组3个重复，随后在瓶口加上橡胶塞和铝盖进行密封。放入20 °C恒温水浴中培养，使用ROBOT系统^[9]自动采集分析各瓶中气体浓度。培养80 h后，取出血清瓶，利用真空氦气清洗系统将瓶内气体置换为氦气，随后立即放回ROBOT系统继续测定，其中厌氧阶段的最初1 h，采气间隔为18 min；1 h后采气间隔约为4.5 h。整个培养采样持续时间为300 h。

土壤硝态氮、铵态氮的测定方法参考《土壤农化分析》^[19]；土壤亚硝态氮测定方法按照国标HJ634-2012方法，简要操作步骤如下：称取过筛的土壤10.00 g于200 mL的聚乙烯瓶中，加入50 mL氯化钾溶液(2 mol/L)，调节pH值至8.0。20±2 °C恒温振荡提取20 min。转移大约40 mL提取液于 50 mL聚乙烯离心管中，在3 000 r/min条件下进行离心分离5 min。然后将上清液转移至50 mL三角瓶中待用。同时做空白实验，以亚硝酸盐标准液建立标准曲线，也可参考文献^[20]。pH值测定的水土比为5:1，摇匀静置1 h后，用pH计测定。

采集的顶空气体通过蠕动泵导入到气相色谱仪进行气体组分分析。气相色谱检测条件为：载气流量 He (99.999%) 4.110 mL/min，柱温 50 °C,CO₂和N₂经 Haysep Q柱预分离后分别进入PLOT和Molsieve 柱后采用热传导检测器(250 °C)检测，N₂O经Haysep Q和PLOT柱后采用电子捕获检测器(330 °C)检测。同时在NO Analyzer中得到NO浓度数据。随后将气体浓度数据换算成每瓶内气体积累量，再计算两种土样N₂O/(NO+N₂O+N₂)的产物比。

利用Quantity one进行DGGE胶的数字化，数据采用SPSS 21.0进行单因素方差分析(显著水平为0.05)以及土壤菌群主成分(PCA)分析。作图采用OriginPro 8.5，图表中数据格式为：平均值±标准误。

细菌16S rRNA基因V3区的特异性引物DGGE电泳图谱结果如图1A所示。棚内传统施肥的土壤与棚外粮田土壤图谱带型有显著区别，除了部分主要条带丰度与棚外粮田接近外，菜田土壤出现了多条新的主要条带。同一种土壤的细菌群落测定重复性较好。主成分分析(图1B)结果表明，棚外粮田样品与棚内菜田样品在PC1方向分成两簇，而棚内菜田样品在PC2方向上有所分开，但并不显著。结果表明土地利用方式的改变，使得土壤细菌群落的组成发生了变化。

图 1 　棚外粮田与设施菜田 16S rRNA 基因 DGGE 指纹图谱(A)；棚外粮田与棚内菜田细菌群落 DGGE 指纹图谱带型的主成分分析(B) Figure 1 　DGGE gel profile for 16S rRNA gene of farmland and greenhouse soil (A), denaturing gradient gel electrophoresis banding patterns of soil bacterial communities in different soil origin (B) 注： FM1， FM2， FM3：棚外粮田(FM)； CN1， CN2， CN3：传统施肥组(CN). ○：棚外粮田土壤样品(FM)； ■：棚内菜田土壤样品(CN). Note: FM1, FM2, FM3: Farmland (FM); CN1, CN2, CN3: Conventional N treatment (CN). ○: Farmland (FM); ■: Greenhouse (CN).

图选项

同时还测定了两种土壤样品在好氧条件下和厌氧条件下微生物呼吸形成的CO₂累积量，结果如图2A所示，无论是好氧还是厌氧状态，棚内菜田土壤的CO₂积累量均高于棚外粮田土壤。此结果从另外一个侧面反映了两种土壤微生物数量的差异。

为了了解两种土壤在有氧和无氧条件及其条件转变过程中的呼吸与反硝化气体的形成特征，对两种土壤进行了培养实验。前80 h为有氧条件，之后转变为厌氧条件。培养过程中气体浓度的测定结果表明，棚内菜田的CO₂产生量较大(图2A)；棚外粮田土壤在好氧阶段CO₂产生速率和产生量均较小，但在厌氧阶段的前5 h，CO₂产生速率远高于棚内菜田土壤，而随后产生速率趋小，约24 h后CO₂总积累量小于棚内菜田土壤(图2B)。

图 2 　粮田与菜田土壤培养过程中的 CO2排放(A)及厌氧阶段前 35 h 内 CO2排放(B) Figure 2 　CO2 revolution of two types of soil during the incubation process (A) and first 35 hours of anaerobic incubaion (B)

图选项

N₂O浓度的测定结果如图3A所示。好氧阶段均未检测到N₂O产生，转入厌氧阶段后，棚内菜田土壤以较快的速度产生了最多的N₂O气体；棚外粮田土壤的N₂O产生速率和总量明显较低。棚内菜田土壤的产生速率约为棚外粮田土壤产生速率的10倍。这表明棚内菜田土壤N₂O产生能力相对于棚外粮田有了显著的提升。棚外粮田土壤在整个厌氧阶段瓶内NO浓度持续上升，而棚内菜田土壤瓶内NO浓度在达到高点后有所下降(图3B)。棚外农田土壤在厌氧培养阶段N₂积累量高于棚内菜田土壤(图3C)。两种土壤在厌氧阶段N₂O/(N₂+N₂O+NO)产物比结果(图3D)显示棚外粮田土壤N₂O/(N₂+N₂O+NO)产物比在整个培养过程中仍显著低于棚内菜田土壤，说明经过土地利用方式的改变，菜棚土壤N₂O产生能力显著增加。

图 3 　土壤培养过程中反硝化气体的产生 Figure 3 　Gas revolution of two types of soil during the incubation Note: A: N2O; B: NO; C: N2; D: N2O/(N2+N2O+NO).

图选项

在厌氧初期，棚外粮田与棚内菜田的氮素气体排放模式也有很大的区别(图4)。在前1 h内棚外粮田N₂排放速率和总量高于棚内菜田(图4A)，而N₂O、NO却几乎没有产生(图4B、C)；相对的，棚内菜田迅速排放了N₂O、NO等气体(图4B、C)，因此N₂O/(N₂+N₂O+NO)产物比也高于棚外 粮田(图4D)。

图 4 　厌氧培养阶段前1 h反硝化气体的产生 Figure 4 　Gas revolution of two types of soil during the first 1 hour of anaerobic incubation including N2(A), N2O(B),NO(C) and N2O/(N2+N2O+NO) ratio (D)

图选项

两种土壤在培养后亚硝态氮均有显著的提升(表3)，尤其是棚外粮田土壤在培养结束后亚硝态氮含量达到30.39±2.01 mg/kg干土，是培养前的14倍以上。两种土壤的铵态氮含量在培养后均有显著增加(表3)，特别是棚内菜田铵态氮含量增加较多。

棚外粮田初始pH为7.77 (表3)，属于微碱性土壤，培养结束后略有降低。棚内菜田土壤pH在培养前为6.15，培养实验结束后，菜棚土壤pH有了显著的提升，接近中性。

寿光菜田土壤日益衰退，大量硝酸盐淋洗入地下水，严重威胁着生态环境的稳定和食物供给的可持续发展^[21]。土壤的持续酸化也加快了温室气体如N₂O的排放趋势^[22]，为了缓解其衍生的一系列生态问题，许多研究聚焦于田间碳氮管理。宋贺等对本研究所用的同一实验田研究表明，通过降低氮素投入和施用秸秆，N₂O排放和硝酸盐淋洗问题得到了改善^[5]。然而土壤管理影响土壤微生物活性的机制尚缺乏深入研究。

与棚外粮田相比，菜田土壤细菌群落组成显著不同、细菌总量较高；尽管这种差异并未影响nirS和nosZ基因在两种土壤整体群落中的相对丰度，但反硝化基因的表达量可能不同，如Uchida等对长期干旱土壤淹水带来的脉冲式N₂O排放的研究发现，这种N₂O排放仅在RNA水平上与反硝化功能基因(nirK、nirS以及nosZ)的丰度显著相关^{[2, 3]}。

土壤CO₂产生反映了土壤有机质的降解的速 度^{[2, 4]}。本研究结果发现，虽然两种土壤有机碳含量差别不大，棚内菜田土壤的CO₂产生显著大于棚外粮田土壤的产生，表明了该土壤较高的微生物活性。棚内适宜微生物生长的气温、高施肥量以及频繁的土壤干湿交替，相应改变了土壤微生物主导的地球化学元素循环过程^[25]。如棚外粮田亚硝态氮含量显著增高、棚外粮田与棚内菜田土壤的气体产生模式有很大的区别。特别地，我们发现在有氧条件转变为厌氧条件的早期，棚外粮田土壤的CO₂和N₂产生速率和总量与棚内菜田土壤有显著不同的模式。菜田土壤微生物可以主动适应突发的厌氧胁迫，其反硝化酶系能在外界氧化还原态改变的同时迅速激活，利用好氧呼吸时积累的大量NADH维持反硝化过程的进行，以确保自身厌氧呼吸的正常进 行^[26]，然而硝酸盐呼吸过程相关的碳代谢酶系的从头合成使得CO₂排放推迟。对在醋酸盐含量有限的连续培养系统中生长的Alcaligenes faecalis的研究表明，自好氧转入厌氧状态，N₂O排放也同时开始，并且在一定时间保持稳定速率，然而CO₂产量以及菌体含量却下降^[27]；相对地，粮田土壤微生物对突发厌氧胁迫响应是被动的，由于Nir以及Nor等反硝化下游酶系激活迟缓^[28]，为了维持正常的厌氧呼吸，绝大多数土壤微生物不得不利用产能效率较差，但激活较早的Nar还原酶将土壤硝态氮还原为亚硝态氮^[26]。这种策略造成了较大的NADH缺口，此时微生物可以通过快速矿化土壤碳素以保证足够的NADH进入硝酸盐呼吸链产生质子梯度^[29]，因此粮田土壤在厌氧初期表现为快速的CO₂排放及NO、N₂O的零排放和土壤亚硝态氮的大量累积。两种土壤的响应模式的不同可能与它们的细菌群落结构差异密切相关。

另一方面，N₂O/(N₂+N₂O+NO)产物比表明，棚内菜田微生物在厌氧条件下产生了更高比例的N₂O气体，这暗示经过高水肥投入，棚内土壤在厌氧条件下N₂O还原能力有所下降，这可能与大棚菜田有较低的pH有关。例如，Qin等的研究表明土壤的酸化能够导致氧化亚氮还原酶的活性降低^[30]；Bergaust等发现Paracoccus denitrificans细菌的氧化亚氮还原酶在较低pH下酶的组装困难，因而导致酶活性的低下^[31]。

此外，铵态氮数据表明，棚内菜田土壤可能进行了更高水平的异化硝酸盐还原成铵过程(DNRA)，而这个过程由于不能将N₂O进一步还原为N₂，因此也导致N₂O积累^[32]，但DNRA在我们所研究的土壤N₂O生成中的贡献率还需要进一步确认。

综上所述，设施菜田长期有别于棚外粮田的管理方式造成了两者土壤细菌群落的显著差异，提升了土壤细菌总量，并且导致土壤pH的改变，因而有了更高的厌氧N₂O排放和N₂O比例。设施菜田土壤微生物进行了与棚外粮田不同的硝酸盐呼吸过程，同时DNRA过程的存在也可能是N₂O产生量差异的主要原因之一。

致谢：感谢挪威生命科学大学的 Lars Bakken 和 Asa Frostegard 教授及 Lars Molstad 先生协助构建 ROBOT 系统。