大肠杆菌是生命科学研究中一类重要的模式微生物，同时也是生物工程领域最常用的宿主菌。在大肠杆菌生理研究及代谢工程改造过程中，常常需要对染色体上相关靶点序列进行敲除、突变、替换或外源序列插入等遗传操作，以使大肠杆菌可以获得对生产、研究有利的稳定性状^{[1, 2, 3, 4]}。例如，在利用大肠杆菌生产化合物时，通过对代谢通路中相关基因的敲除可以阻断大肠杆菌的代谢旁路、减弱毒副作用，以提高目标产物的产量或质量；通过基因插入将染色体上基因的启动子替换为强启动子，从而强化基因表达水平以增强大肠杆菌的某种代谢能力。

目前，大肠杆菌染色体上基因敲除、整合等操作绝大多数是通过λ-Red同源重组方法实现的^{[5, 6]}。完整的λ-Red重组方法2000年由Wanner等建立^[7]。该方法通过将两侧含有同源序列的线性抗性基因片段转入细胞，使片段在λ噬菌体重组酶Redα、Redβ和Redγ的作用下与染色体序列发生双交换^{[8, 9, 10]}，从而实现了对基因的敲除。在对外源基因片段进行染色体上的插入整合操作时，则需要将外源基因拼接于同源序列与抗性基因之间，然后在λ-Red重组酶的作用下插入到染色体相关位点。相比于基因敲除，基因整合能够赋予大肠杆菌更多新的性状，在大肠杆菌生理研究和代谢工程改造中成为越来越重要的研究手段^[11]。特别是近年来随着耐药性、重组表达、多态性等大肠杆菌生理机制研究的广泛开展，以及合成生物学中对基因表达微调控要求的提高，蛋白表达跟踪、启动子替换等手段必须通过染色体上的基因整合操作才能实现^{[12, 13]}。

然而由于缺乏技术步骤统一、方便高效的操作系统，λ-Red重组在实际操作尤其是在基因整合操作时受到了很大限制^[14]。目前λ-Red重组体系普遍采用了pKD4-pKD46-pCP20的3质粒系统：其中包括用于扩增打靶DNA片段的模板质粒pKD4 (或pKD3、pKD13)、含有λ-Red重组酶的pKD46以及辅助质粒pCP20^{[7, 15]}。该系统采用FRT位点作为抗性基因的消除标记，抗性基因两侧连有相同的FRT位点，该位点可以在pCP20质粒Flp酶的作用下发生重组而消除抗性基因，以进行下一轮基因敲除。但由于抗性消除后染色体被敲除基因座位处留有完整的FRT“痕”，当敲除或整合基因位点数量达到5-6个时，会造成染色体不稳定从而无法实现基因的连续敲除^[16]。另一方面，这套系统最大的问题是无法有效实现基因整合。基因整合需要将目的基因序列与抗性基因拼接，由于pKD4无法进行直接的构建操作，基因整合只能采用如下策略：(1) 尝试改造模板pKD4用于构建，但pKD4拷贝数极低，并只能在特殊的BW25141菌株中复制，因此很难用传统的构建方式实现。(2) 一些人试图在普通质粒上进行拼接，但往往在重组后存在大量假阳性，后续处理繁琐。(3) 交错PCR等不依赖质粒的拼接方式，但效率很低，很难获得高浓度的目的基因片段。以上问题导致在进行外源基因整合时，没有统一的技术步骤，许多方法难以重复。使大肠杆菌基因整合操作很难在普通实验室推广。

随着代谢工程等研究的发展与实际生产的需要，亟需建立一种具有统一技术步骤、快捷、高效的λ-Red操作系统，以有利于相关研究手段进一步应用。本文报道了一种高效的基因整合与敲除方法，该方法以λ-Red重组技术为基础，通过采用Cre/LoxP的抗性消除策略替代Flp/FRT策略，从而有利于实现多基因连续稳定敲除与整合；通过引入多克隆位点并对模板质粒复制起始位点进行改造，实现了基因构建与高效筛选的兼容。从而建立了一个方便快捷、易于推广、100%阳性筛选率且具有统一技术步骤的λ-Red操作系统。

本研究中所涉及到的引物见表 2，引物位置如图 1所示。

图 1 　基因敲除/整合及其卡纳抗性基因去除设计示意图 Figure 1 　Schemes for gene knock-out/knock-in and excision of kanamycin resistance gene 注：A：基因敲除过程；B：基因整合过程. Note: A: Procedures for gene knock-out; B: Procedures for gene knock-in.

图选项

以pKD4质粒为模板扩增卡那霉素抗性基因，同时将多克隆位点和Lox位点序列设计在引物中，以pUC19质粒为模板扩增ColE1复制起始位点片段，以pSB1s质粒(本实验室构建，待发表)为模板扩增复制子pSC101，利用引物通过NotⅠ和AscⅠ限制性酶切位点连接，所获得的质粒pULM (复制子为ColE1)与pCLM (复制子为pSC101)即为含有Lox66/Lox71位点及两个多克隆位点的敲除/整合模板质粒。以质粒pCLM为基础，利用引物pSC101C-F与pSC101C-R将起始位点的甘氨酸突变为缬氨酸，该位点能增加质粒的拷贝数^[17]，从而获得了新的敲除/整合模板质粒pSLM。将glk基因转录子连接至模板质粒pSLM的多克隆位点位置，构建的模板质粒pSLM-glk便于基因的整合。将Cre重组酶基因片段通过NcoⅠ和XhoⅠ连接到链霉素抗性、含有阿拉伯糖启动子和pSC101复制起始位点的表达载体pSB1s上，利用引物pSC101T-F与pSC101T-R将pSC101复制起始位点中的丙氨酸位点突变为缬氨酸，该位点突变能将质粒改造成温度敏感型^[18]，从而获得了辅助质粒pSCre用于抗性基因的消除。分子克隆操作采用分子克隆实验指南进行操作^[19]，转化T1感受态细胞，构建载体通过测序鉴定。

以模板质粒(pULM、pCLM、pSLM、pSLM-glk、pSLM-acs、pSLM-ispDF)为模板，利用打靶片段扩增引物扩增含有LoxP位点的卡那霉素抗性片段(或包括待插入基因片段)，PCR产物分别通过PCR产物纯化试剂盒或凝胶回收试剂盒进行纯化(必要时纯化后以DpnⅠ限制性内切酶37 °C处理6 h以去除模板质粒，并再次通过PCR产物纯化试剂盒回收打靶片段)。

质粒pKD46利用CaCl₂法转化进入宿主菌BW25113，于含有氨苄青霉素的LB培养基中30 °C培养过夜，次日按1:100接种至100 mL LB培养基，30 °C培养至OD₆₀₀为0.2，加入L-阿拉伯糖至终浓度30 mmol/L，诱导1 h (OD₆₀₀不超过0.6)，使Redα、Redβ和Redγ三种蛋白表达。冰上预冷30 min，然后4 000 r/min、4 °C离心10 min，用预冷的无菌水洗涤1次，然后用预冷的10%甘油洗涤3次，浓缩成500 μL感受态细胞，取50 μL感受态用于电转化。

将处理过的打靶DNA片段与感受态细胞混匀，转入预冷的0.1 cm的电击杯，然后进行电击，电击条件为电压1.8 kV，电击时间5 ms，电击完成后立即加入预热的LB培养基，30 °C复苏2 h，涂布卡那霉素+氨苄青霉素抗性平板，30 °C培养过夜。

挑取平板上的重组子于LB液体培养基 (Amp⁺+Kan⁺)，30 °C培养，利用鉴定引物PCR扩增方法鉴定是否整合，挑选阳性克隆。将阳性菌种置于LB液体培养基(Kan⁺) 42 °C培养，以去除质粒pKD46，然后划线LB平板(Kan⁺)，对所得的单菌落进行氨苄青霉素敏感型检测，对氨苄青霉素敏感的菌种即为去除了质粒pKD46的菌种。

将质粒pSCre转化以上获得的卡那霉素抗性的菌种，涂布LB平板(Str⁺)，30 °C培养过夜，表达的Cre酶识别LoxP位点将卡那霉素抗性去除。从平板挑选克隆于LB液体培养基(Str⁺) 30 °C培养，利用0.2% L-阿拉伯糖进行诱导Cre酶表达，通过鉴定引物进行PCR扩增鉴定抗性基因是否去除，将阳性菌种置于42 °C培养，以去除质粒pSCre，然后划线无抗LB平板，对所得的单菌落进行卡那霉素敏感型检测及PCR性状验证。

为了构建一种有利于基因整合操作，并能够实现多基因的连续敲除或整合的模板质粒，在模板质粒pULM中引入如下功能单元：(1) Lox66/Lox71序列作为抗性标记基因的消除位点。Lox66和Lox71在Cre重组酶的作用下发生重组并消除抗性基因。形成的Lox72序列很难被Cre酶进一步作用，从而能够在后续的多基因连续敲除或整合时保持染色体的稳定^[20]。(2) 在Lox66及Lox71两个位点的外侧分别引入两个多克隆位点MCS1和MCS2，从而可以通过限制酶连接或其他方法方便地实现基因拼接(图 2)。

图 2 　模板质粒pULM及多克隆位点示意图 Figure 2 　Map of template plasmid pULM and cloning regions

图选项

以质粒pULM为模板对pgi基因(6-磷酸果糖异构酶)进行敲除。打靶片段采用琼脂糖凝胶电泳纯化和PCR产物纯化两种纯化方式，并经DpnⅠ酶处理。结果显示，经琼脂糖凝胶电泳与PCR产物纯化的DNA片段均有约10³/50 μL感受态细胞的克隆，分别随机挑选20个克隆，用鉴定引物pgi-A2与K1对pgi基因敲除菌种进行鉴定。结果表明：经PCR产物纯化的DNA片段全部为假阳性(阳性率为0， 图 3A)，而经琼脂糖凝胶电泳回收的DNA片段，有2个克隆的基因扩增条带大小为600 bp，与实际大小一致，为成功敲除的阳性克隆(图 3B)。经提取质粒鉴定，假阳性均为模板质粒转入引起。而通过延长DpnⅠ的处理时间，能够一定程度上消除假阳性(琼脂糖凝胶电泳纯化后处理超过16 h，16阳 性/20克隆，阳性率为80%)。

图 3 　菌落PCR对pgi基因敲除菌种的鉴定 Figure 3 　PCR identification of recombinants of pgi gene knock-out 注：A：打靶片段通过PCR产物纯化试剂盒纯化；B：打靶片段通过琼脂糖凝胶电泳纯化. M：DNA marker；1：阳性对照；2-11：随机挑选的重组子. Note: A: DNA fragment used for knocking out the pgi gene was purified by cycle-pure kit; B: DNA fragment used for knocking out the pgi gene was purified by gel extraction kit. M: DNA marker; 1: Positive control; 2-11: Recombinants.

图选项

将pSCre质粒转入pKD46消除的敲除菌株用于消除抗性基因，利用引物pgi-A1与pgi-A2对抗性基因消除菌种进行验证。由于含有卡那霉素抗性基因，因此扩增条带大小为2 024 bp (图 4，泳道1)，消除卡那霉素抗性基因后，条带大小为600 bp (图 4，泳道2-11)，条带大小与实际一致，表明卡那霉素抗性基因已被Cre酶的作用去除。

图 4 　菌落PCR对pgi基因敲除菌种的卡那霉素抗性基因去除后的鉴定 Figure 4 　PCR identification of recombinants of pgi gene knock-out without kanamycin resistance 注：M：DNA marker；1：阴性对照；2-11：去除卡那抗性的重组子. Note: M: DNA marker; 1: Recombinant with kanamycin resistance; 2-11: Recombinants without kanamycin resistance.

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基于质粒pULM和pSCre的Cre-LoxP-MCS系统能够成功实现大肠杆菌基因的敲除和抗性消除，同时构建了多克隆位点也便于基因整合的分子操作。但操作过程中存在较多的假阳性，还无法实现高效率的敲除/整合。为了解决模板质粒造成的假阳性问题，构建了质粒pCLM。将1 ng的pCLM质粒分别电转化BW25113和BW25113 (pKD46)，取1/10体积的复苏细胞涂布具有相应抗性的平板。结果表明，pULM质粒转化BW25113 (pKD46)的转化子数(Kan⁺+Amp⁺平板)约为10⁴/ng DNA (图 5A)，pCLM质粒转化BW25113的转化子数量约为5×10³/ng DNA (Kan⁺平板)(图 5B)，而转化BW25113 (pKD46)菌株时无转化子(Kan⁺+Amp⁺平板)(图 5C)。以上结果证明由于质粒的不相容性，采用同样pSC101衍生的复制起始位点的策略能够有效消除模板质粒转入BW25113 (pKD46)。

图 5 　pCLM质粒与pULM质粒转化比较 Figure 5 　Comparison of transformants of plasmid pCLM and pULM 注：A：pULM转化BW25113 (pKD46)；B：pCLM转化BW25113；C：pCLM转化BW25113 (pKD46). Note: A: Colonies for BW25113 (pKD46) transformed by pULM; B: Colonies for BW25113 transformed by pCLM; C: Colonies for BW25113 (pKD46) transformed by pCLM.

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质粒pCLM所采用的pSC101复制起始位点为低拷贝(5 copies/cell)，在采用常规酶切连接操作时，往往需要制备较多的质粒，造成操作的繁琐，点突变改造的质粒pSLM提高了拷贝数便于分子生物学操作。突变后获得质粒pSLM并通过测序验证(图 6)。采用相同菌体量分别提取相关质粒pULM、pCLM和pSLM，凝胶电泳结果表明pSLM的浓度与pULM基因一致(图 7，泳道1与泳道3)，证明pSLM质粒具有高拷贝特性从而有利于基因操作。此外将pSLM质粒电转化BW25113 (pKD46)时，转化能力与pCLM质粒相似，0.1 ng的DNA仍然无转化子，证明pSLM仍然保持与pKD46不相容特性。

图 6 　模板质粒pSLM示意图 Figure 6 　Map of template plasmid pSLM

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图 7 　模板质粒pULM、pCLM和pSLM浓度的分析 Figure 7 　Agarose gel electrophoresis identification of template plasmid pULM, pCLM and pSLM 注：M：DNA marker：1：模板质粒pULM；2：模板质粒pCLM；3：模板质粒pSLM. Note: M: DNA marker; 1: Template plasmid pULM; 2: Template plasmid pCLM; 3: Template plasmid pSLM.

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以pSLM为模板，敲除pgi基因，经PCR产物纯化与琼脂糖凝胶电泳的DNA片段均长有约5×10²个克隆，分别随机挑选20个克隆，用鉴定引物对pgi基因敲除菌种进行鉴定。结果表明，分别有18个和20个阳性克隆，阳性率分别为90%和100% (图 8)。对PCR产物纯化中2个假阳性克隆进行鉴定时，未发现pSLM特征序列，推测为痕量DNA污染造成。琼脂糖凝胶电泳回收具有DNA纯化作用，因此后续实验均采用该方法进行DNA 回收。

图 8 　菌落PCR对pgi基因敲除菌种的鉴定 Figure 8 　PCR identification of recombinants of pgi gene knock-out 注：A：打靶片段通过PCR产物纯化试剂盒纯化；B：打靶片段通过琼脂糖凝胶电泳纯化. M：DNA marker；1：阳性对照；2-11：随机挑选的重组子. Note: A: DNA fragment used for knocking out the pgi gene was purified by cycle-pure kit; B: DNA fragment used for knocking out the pgi gene was purified by gel extraction kit. M: DNA marker; 1: Positive control; 2-11: Recombinants.

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进一步，选择丙酮酸氧化酶poxB (1 719 bp)、乳糖代谢调控因子galR (1 032 bp)、磷酸化调控因子yliE (2 349 bp)进行基因敲除操作。采用pSLM模板质粒，分别对poxB、galR、yliE基因进行扩增，然后对其进行敲除，采用验证引物进行验证，poxB (图 9A)、galR (图 9B)、yliE (图 9C)敲除后大小与阳性对照大小一致。与敲除pgi基因的结果类似，在约5×10²个克隆中分别挑取20个克隆进行验证，3个基因均被成功敲除，阳性率均为100%。以上结果表明，以pSLM模板质粒为基础，能够实现高效率的基因敲除。

图 9 　菌落PCR对poxB、galR、yliE基因敲除菌种的鉴定 Figure 9 　PCR identification of recombinants of poxB, galR and yliE gene knock-out 注：A：poxB基因敲除；B：galR基因敲除；C：yliE基因敲除. M：DNA marker；1：阳性对照；2：随机挑选的重组子. Note: A: poxB gene knocking out; B: galR gene knocking out; C: yliE gene knocking out. M: DNA marker; 1: Positive control; 2: Recombinants.

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以pSLM质粒为基础构建连接有大肠杆菌葡萄糖激酶glk基因的模板质粒，并将glk基因整合到大肠杆菌染色体的ptsG位点上。获得50个左右的克隆，随机挑选8个克隆，采用引物K1与ptsG-A2进行鉴定，扩增条带大小为600 bp (图 10，泳道1-8)，证明glk基因成功整合至ptsG基因位置，阳性率为100%，并进一步采用pSCre成功消除了卡那霉素抗性基因(图 11，泳道2-9)。

图 10 　菌落PCR对glk基因整合菌种的鉴定 Figure 10 　PCR identification of recombinants of glk gene knock-out 注：M：DNA marker；1-8：随机挑选的重组子. Note: M: DNA marker; 1-8: Recombinants.

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图 11 　菌落PCR对glk基因整合菌种的卡那霉素抗性基因去除后的鉴定 Figure 11 　PCR identification of recombinants of glk gene knock-in without kanamycin resistance 注：M：DNA marker；1：阴性对照；2-9：去除卡那抗性的重组子. Note: M: DNA marker; 1: Recombinant with kanamycin resistance; 2-9: Recombinants without kanamycin resistance.

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为了进一步验证系统在整合操作时适应的片段种类和大小范围，选择大肠杆菌乙酰辅酶A合成酶acs基因与农杆菌萜类合成代谢ispDF基因进行基因整合操作。acs转录子与卡那抗性基因大小为 4 113 bp，ispDF基因与卡那抗性基因大小为3 548 bp。与glk基因整合结果类似，获得50个左右的克隆，随机挑选8个克隆，采用引物poxB-A2与K1进行鉴定，扩增条带大小为600 bp (图 12，泳道2)，证明基因成功整合至poxB基因位置，阳性率为100%。以上结果表明，以pSLM模板质粒为基础，能够实现高效率的基因整合。

图 12 　菌落PCR对acs，ispDF基因整合菌种的鉴定 Figure 12 　PCR identification of recombinants of acs and ispDF gene knock-in 注：A：acs基因整合；B：ispDF基因整合. M：DNA marker；1-2：随机挑选的重组子. Note: A: acs gene knocking in; B: ispDF gene knocking in. M: DNA marker; 1-2: Recombinants.

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通过本研究的优化，建立了一套基于SCLM系统的大肠杆菌λ-Red基因敲除整合策略(图 13)。在该策略中，通过在模板质粒中引入2个多克隆位点，能够方便实现待整合基因与抗性标记基因的拼接，便于制备打靶DNA片段。通过对复制起始位点的改造，节省了整个DNA制备和筛选的时间，并实现了克隆筛选的100%阳性率(表 3)。

图 13 　本文的基因敲除/整合系统示意图 Figure 13 　Schemes for the gene knock-out/knock-in system developed in this study

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Wanner等^[7]建立的λ-Red同源重组体系由于操作简单、成功率高，是大肠杆菌染色体基因敲除整合的首选方式。λ-Red同源重组体系目前普遍采用Wanner等^[7]构建的pKD4 (包括衍生的pKD3、pKD13)为模板质粒。该模板质粒采用不含pir蛋白的R6k为复制起始位点，只能在特殊的宿主菌BW25141中才能复制，可以最大限度地消除同源重组的假阳性。但pKD4没有多克隆位点，基因整合操作需要通过质粒外拼接或对质粒进行改造才能实现。然而由于低拷贝特性且不能在常规菌株中进行构建，pKD4衍生质粒无法同时具备低阳性率和方便改造两种特性，从而限制了该方法在条件有限的常规实验室中进行推广。近年来针对肠杆菌λ-Red重组体系，人们开展了一些体系优化和改造工作，以试图解决操作繁琐等问题。2013年，Chan等^[11]将分别表达λ-Red重组酶和Cre重组酶的两种质粒整合在一起，创建了单一辅助质粒，节省了基因连续敲除操作的时间。但在该系统中模板质粒不含有多克隆位点，并采用了常规p15A复制起始位点，因此不利于基因整合操作，也没针对阳性率进行改进。而本研究的SCLM系统利用pSC101复制子，减少了DpnⅠ酶处理等繁琐的DNA片段制备过程，成功解决了阳性率和改造不能同时进行的问题。采用多克隆位点适合大多数分子生物学实验室进行，也可以通过Gibson等^[21]方法实现快速片段拼接(表 4)。

综上所述，通过对λ-Red重组体系的改造和优化，建立了一套简单、高效率的大肠杆菌λ-Red基因敲除、整合系统。利用该系统进行基因整合时，可以快捷地实现整合片段与抗性基因间的拼接。同时由于该方法阳性率高，减少了不必要的DNA片段处理过程，从而能够快速、高效地进行基因的连续敲除和整合，适合在普通分子生物学实验室中推广。