2015, Vol. 42扩展功能
文章信息
- 杜广祖, 郑亚强, 陈斌, 吴晓丽, 赵倩, 和淑琪, 李正跃
- DU Guang-Zu, ZHENG Ya-Qiang, CHEN Bin, WU Xiao-Li, ZHAO Qian, HE Shu-Qi, LI Zheng-Yue
- 几种植物油对莱氏野村菌分生孢子萌发的影响
- Effect of several botanical edible oils on the conidia germination of Nomuraea rileyi
- 微生物学通报, 2015, 42(4): 690-698
- Microbiology China, 2015, 42(4): 690-698
- 10.13344/j.microbiol.china.140637
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文章历史
- 收稿日期: 2014-08-22
- 接受日期: 2014-11-14
- 优先数字出版日期(www.cnki.net): 2014-11-24
莱氏野村菌[Nomuraea rileyi (Farlow) Samson]，又可称莱氏蛾霉，隶属于野村菌属(Nomuraea)[1]，是重要的昆虫病原真菌之一。具有寄主广泛、流行性强等特点，在田间能够引起多种夜蛾科昆虫病害大面积的发生流行[1]。
分生孢子是虫生真菌引起昆虫病害及其发生病害流行的重要形态，孢子萌发率是决定高孢粉及其不同剂型质量好坏的重要指标，也是能否成功侵染昆虫体表的重要因素之一[2]。影响孢子萌发率的因素很多，如温度、时间、环境及营养条件等因素。孔琼等[3, 4]研究发现莱氏野村菌MZ060806菌株在温度为27℃、湿度为70%、pH值为6.0-7.0时的产孢量和孢子萌发率最高，且对紫外线比较敏感；营养条件方面，最适合MZ060806菌株菌落生长的碳源是蔗糖，有利于菌丝生长的是可溶性淀粉，能明显促进产孢量增加的营养物质是葡萄糖；有关油类对分生孢子萌发的影响，目前文献报道的有绿僵菌[5, 6, 7, 8, 9]、白僵菌[10, 11, 12, 13, 14]等丝孢类虫生真菌以及新蚜虫疠霉、安徽虫瘟霉和飞虱虫疠霉等虫霉菌[15]的研究，而油类对莱氏野村菌分生孢子萌发的影响未见系统研究报道。
近年来，我们在田间调查时发现，莱氏野村菌在甘蓝田大量感染银纹夜蛾(鳞翅目：夜蛾科) [Argyrogramma agnate Staudinger (Lepidoptera：Noctuidae)]幼虫，且在甘蓝田银纹夜蛾种群中流行性很强，在8-9月份发生流行期间，甘蓝田银纹夜蛾平均感染率达80%以上，对该虫种群的自然控制具有重要作用。由此经罹病虫体采集，并对病原菌进行分离、纯化，获得莱氏野村菌Nr0815菌株。该菌株在室内培养生长良好，对该菌株的毒力进行初步测定，发现其对银纹夜蛾具有很强的致病作用，具有良好的开发潜力。因此，本研究以该菌株为材料，研究了莱氏野村菌分生孢子在市售8种植物油中的萌发情况，以期为该菌生物剂型开发提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 供试菌株：莱氏野村菌菌株Nr0815分离自云南省昆明市晋宁县甘蓝上的银纹夜蛾虫体上，室内分离纯化后4℃保存于云南农业大学植物保护学院昆虫病原体实验室中。 1.1.2 供试植物油：均为市售食用植物油商品，分别为大豆油，购自嘉里粮油有限公司；花生油，购自山东鲁花集团有限公司；蓖麻油，购自河南省华龙药业有限公司；芝麻油，购自湖南省长康实业有限责任公司；玉米油，购自山东西王食品有限公司；菜籽油、橄榄油和葵花籽油，购自上海佳格食品有限公司。营养成分详见表 1。| 营养成分 Nutrition content | 大豆油 Soybean oil | 玉米油 Maize oil | 橄榄油 Olive oil | 花生油 Peanut oil | 葵花籽油 Sunflower seed oil | 芝麻油 Sesame oil | 蓖麻油 Castor oil | 菜籽油 Rape oil |
| 能量 Energy (KJ) | 3 700.00 | 3 700.00 | 3 700.00 | 3 700.00 | 3 700.00 | 3 700.00 | 3 700.00 | 3 700.00 |
| 蛋白质 Protein (g) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 脂肪 Fat (g) | 100.00 | 99.90 | 100.00 | 99.90 | 100.00 | 99.90 | 100.00 | 99.90 |
| 饱和脂肪酸 Saturated fatty acid (g) | 16.00 | 15.00 | 14.00 | 18.00 | 12.00 | 15.00 | − | 10.00 |
| 不饱和脂肪酸 Unsaturated fatty acid (g) | 84.00 | 84.90 | 77.00 | 81.90 | 88.00 | 84.90 | − | 89.90 |
| 胆固醇 Cholesterol (mg) | 0 | − | 0 | − | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 碳水化合物 Carbohydrate (g) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 钠 Sodium (Na) (mg) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 维生素E Vitamin E (mg) | − | 20.00 | − | − | 40.00 | − | − | − |
| 植物甾醇 Phytosterol (mg) | − | 580.00 | − | − | − | − | − | − |
| 油酸 Oleic acid (g) | − | − | − | 43.10 | − | − | − | − |
| 亚油酸 Linoleic acid (g) | − | − | − | 37.20 | − | − | − | − |
Note: −: Means unknown (the same below).
萨氏(SDY)培养液(g/L)：除不加琼脂外，其他同SDAY培养基。
1.1.4 主要仪器：HQ45A恒温摇床，中国科学院武汉科学仪器厂；DHG-9035A电热鼓风干燥箱，上海恒一科学仪器有限公司；UV-1800型紫外分光光度计，上海美谱达仪器有限公司。
1.2 实验方法 1.2.1 孢子粉制备：参考刘光英[16]的方法，将莱氏野村菌菌株采用SDAY培养基扩大培养后，用灭菌的0.05% (体积比) Tween-80配制分生孢子悬浮液，接种到装有50 mL含0.05% (体积比) Tween-80萨氏葡萄糖培养液(SDY)的250 mL三角瓶至终浓度为1×106 孢子/mL，于26℃、180 r/min摇床培养3 d，作为液体种子备用。然后将液体种子按10% (体积质量比)接种至大米培养基质上，放入25℃， 16 L:8 D，湿度为80%的光照培养箱中培养，待分生孢子长满后，35℃恒温干燥箱中烘干，收集分生孢子，并参考林健文等[17]的方法测定其含水量，使分生孢子粉含水量控制在5%以内。 1.2.2 萌发率的测定：参照陈祝安等[5]的方法，将菌株Nr0815在SDAY培养基斜面上培养10 d后，分别挑取新鲜的分生孢子粉均匀接种至滴有植物油的无菌载玻片上，然后将载玻片置于培养皿 (D=9 cm)中。放置前，先在灭菌培养皿底铺一张直径为9 cm的圆形滤纸，滤纸上滴3-4滴无菌水，保持100% RH。再将接种处理的载玻片分别置于10、16、23和30℃光照培养箱内进行光照培养 72 h，分别培养12、24、36、48、60、72 h时用光学显微镜(带有显微测微尺，400倍)镜检一次，随机检测5个视野。每个处理3个重复，每种处理统计300个孢子。并统计不同温度下的30个分生孢子芽管长度。孢子萌发速率的计算，依据文献[18]中公式：
| $v = \frac{{{X_2} - {X_1}}}{{X\left( {{t_2} - {t_1}} \right)}} \times 1000\left[ {{T^ - }} \right]$ |
v为孢子萌发速率，即每小时每1 000个孢子群中的孢子萌发数，X为观察的孢子总数，X1为tl时的萌发数，X2为t2的萌发数。
1.2.3 分散性的测定：参考王成树等[19]的测定方法，称取莱氏野村菌分生孢子粉分别溶于8种植物油中，使得孢子终浓度为1×104 孢子/mL。然后在紫外分光光度计上分别测定不同波长(470、580和650 nm)下的吸光度。吸光度越大，表明悬浮的粒子越多，其分散性越好[20]。 1.3 数据统计与分析莱氏野村菌分生孢子在不同植物油中的吸光度、以及各植物油在不同温度下的萌发率和萌发速率数据比较，用SPSS 20.0进行方差分析(Duncan’s新复极差法进行差异显著性检验)。
2 结果与分析 2.1 莱氏野村菌分生孢子在不同植物油中的分散性差异将莱氏野村菌分生孢子溶解到植物油中，观察发现在植物油中的分散效果均较好。通过测定不同波长下的吸光度，发现在3种波长下各植物油的吸光度值间均存在极显著性差异(P<0.01)。其中，通过方差分析，分生孢子在各植物油中于波长为 580 nm和650 nm下的吸光度间的差异性一致，莱氏野村菌分生孢子在玉米油中的吸光度最大，分别为0.50±0.02和0.47±0.02，即分散性最好；在大豆油中的吸光度最小，分别为0.24±0.01和0.23±0.01，即分散性最差(表 2)。
| 植物油种类 Botanical edible oils | A470 | A580 | A650 |
| 大豆油 Soybean oil | 0.32±0.01G | 0.24±0.01F | 0.23±0.01F |
| 玉米油 Maize oil | 0.67±0.01B | 0.50±0.02A | 0.47±0.02A |
| 橄榄油 Olive oil | 0.74±0.03A | 0.43±0.04B | 0.42±0.03B |
| 花生油 Peanut oil | 0.53±0.01D | 0.37±0.01D | 0.34±0.01CD |
| 葵花籽油 Sunflower seed oil | 0.49±0.01D | 0.37±0.01CD | 0.36±0.01CD |
| 芝麻油 Sesame oil | 0.62±0.05C | 0.42±0.06BC | 0.38±0.06BC |
| 蓖麻油 Castor oil | 0.43±0.03E | 0.33±0.03DE | 0.31±0.03DE |
| 菜籽油 Rape oil | 0.37±0.02F | 0.29±0.02E | 0.28±0.02E |
| 显著性差异 Significant difference | F=87.89, P<0.01 | F=25.88, P<0.01 | F=24.12, P<0.01 |
Note: Data (
± s) with different capital letters in the same column are of the significant difference (P<0.01).
从图 1可以看出，不同植物油中的孢子累积萌发率于同一温度下均存在极显著性差异(10℃：F=862.13，P<0.01；16℃：F=214.35，P<0.01；23℃：F=17.13，P<0.01；30℃：F=3155.93，P<0.01)；且均以大豆油中的孢子萌发率最高。大豆油中的孢子在10-30℃时萌发率为(13.56%±0.19%)- (97.56%±4.23%)。其中，玉米油、橄榄油、葵花籽油间的累积萌发率在10℃时无显著性差异(F=1.86，P>0.05)；橄榄油和葵花籽油间(F=0，P>0.05)、芝麻油和蓖麻油间(F=1.32，P>0.05)在16℃时无显著性差异；橄榄油、蓖麻油和葵花籽油间在23℃时不存在显著性差异(F=1.99，P>0.05)。
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图1
不同植物油种类对莱氏野村菌分生孢子萌发率的影响
Fig.1
The effect of botanical edible oils on conidia germination rate of Nomuraea rileyi
注：图柱上方不同大写字母代表同一温度下不同植物油种类间存在极显著性差异(P<0.01). 下同. Note: Different capital letters in the same column in the above figure are of the significant difference among different botanical edible oils at same temperature (P<0.01). The same as below. |
此外，莱氏野村菌分生孢子在同种植物油于不同温度下的累积萌发率均存在极显著性差异(表 3)。且各植物油中的孢子萌发率在23℃时的较高，孢子萌发率为(69.67%±2.00%)-(97.56%±4.23%)；其次为30℃和16℃，孢子萌发率分别为(43.44%±0.38%)- (91.89%±0.69%)和(5.33%±0.33%)-(18.56%±0.84%)；10℃时的孢子萌发率最低，为(0.89%±0.19%)- (13.56%±0.19%)。
| 植物油种类 Botanical edible oils | 累积萌发率 Cumulative germination rate (%) | 显著性差异 Significant difference | |||
| 10℃ | 16℃ | 23℃ | 30℃ | ||
| 大豆油 Soybean oil | 13.56±0.19d | 17.78±0.77c | 97.56±4.23a | 91.89±0.69b | F=1 318.43, P<0.01 |
| 玉米油 Maize oil | 1.33±0.33d | 6.67±0.67c | 69.67±2.00a | 55.89±0.38b | F=3 030.77, P<0.01 |
| 橄榄油 Olive oil | 1.00±0.33d | 5.33±0.67c | 75.44±2.78a | 49.44±0.19b | F=1 861.67, P<0.01 |
| 花生油 Peanut oil | 7.00±0.33d | 16.00±0.67c | 87.44±4.03a | 78.67±0.67b | F=1 204.97, P<0.01 |
| 葵花籽油 Sunflower seed oil | 0.89±0.19d | 5.33±0.33c | 79.11±2.87a | 43.44±0.38b | F=1 883.83, P<0.01 |
| 芝麻油 Sesame oil | 2.56±0.19d | 9.78±0.51c | 80.78±4.35a | 63.11±0.51b | F=925.77, P<0.01 |
| 蓖麻油 Castor oil | 3.33±0.33d | 10.33±0.67c | 72.44±5.87a | 64.56±0.51b | F=437.26, P<0.01 |
| 菜籽油 Rape oil | 9.11±0.19d | 18.56±0.84c | 90.22±4.40a | 71.00±0.33b | F=927.42, P<0.01 |
Note: Data (
± s) with different small letters in the same line are of the significant difference (P<0.01).
从图 2A、B、C可以看出，莱氏野村菌分生孢子在同种植物油中于不同温度条件下的孢子萌发速率间均存在极显著性差异(P<0.01)。其中， 0-24 h间，各植物油于10℃和16℃时的孢子萌发速率均无显著性差异(P>0.05)；橄榄油、菜籽油于23℃和30℃条件下的孢子萌发速率均无显著性差异外(橄榄油：F=0.40，P>0.05；菜籽油：F=0.14，P>0.05)，其他植物油间差异极显著(P<0.01)(图 2A)；24-48 h间，大豆油、花生油和菜籽油于23℃时的孢子萌发速率分别极显著的高于对应的其他3个温度下的萌发速率(大豆油：F=211.99，P<0.01；花生油：F=55.19，P<0.01；菜籽油：F=180.96，P<0.01)(图 2B)。此外，在供试植物油中10℃时孢子的萌发缓慢，48 h后孢子才开始萌发，萌发速率显著低于其他3个温度下的萌发速率。孢子萌发速率呈逐渐上升的趋势，在48-72 h时达到最高值，为每小时每1 000个孢子群中有(0.37±0.08)-(5.65±0.08)的孢子萌发(图 2C)。大豆油和菜籽油中的萌发速率于23℃和30℃下均呈先升高后下降趋势，即在24-48 h时的萌发速率最高；而在玉米油等其他植物油中于23℃时的萌发速率也是逐渐上升，在48-72 h时的萌发速率最高；而30℃时的萌发速率为先升高后下降或不变。
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| 图2 温度和植物油对莱氏野村菌分生孢子萌发速率的影响 Fig.2 The effect of temperatures and botanical edible oils on the speed of conidia germination of Nomuraea rileyi |
从图 2D、E、F可知，莱氏野村菌分生孢子在不同植物油中于同一温度下的萌发速率间也存在着极显著性的差异(P<0.01)。其中，48-72 h，玉米油、橄榄油和葵花籽油中的萌发速率在10℃和16℃时分别无显著性差异(10℃：F=1.86，P>0.05；16℃：F=1.42，P>0.05)；同时，不同植物油在同一温度下于不同时段间的萌发速率也存在着极显著性差异(P<0.01)。大豆油和菜籽油在23℃时于3个时段中的孢子萌发速率间均不存在显著性差异(0-24 h：F=1.38，P>0.05；24-48 h：F=1.46，P>0.05；48-72 h：F=2.40，P>0.05)；在玉米油、橄榄油和葵花籽油中处理后24-48 h、48-72 h时段，野村菌分生孢子萌发速率间也无显著性差异(24-48 h：F=0.27，P>0.05；48-72 h：F=0.50，P>0.05)(图 2E、F)；橄榄油和葵花籽油中的孢子在30℃时处理后0-24 h，24-48 h这2个时段的萌发速率均无显著性差异(0-24 h：F=0，P>0.05；24-48 h：F=0.63，P>0.05)(图 2D、E)。
2.4 不同油类和温度对孢子芽管生长的影响从表 4可以看出，同种植物油中的莱氏野村菌分生孢子在不同温度下的芽管长度间均存在极显著性差异(P<0.01)。其中，各植物油中芽管长度在23℃时均极显著长于其他温度时的芽管长度(P<0.01)，其次为30、16、10℃时的芽管长度均较短；4个温度下均为大豆油中芽管长度较大，分别为(24.89±1.04)、(22.45±1.21)、(19.95±1.17)和(10.36±1.09)。此外，不同植物油中的芽管长度在同一温度下也均存在极显著性差异(P<0.01)。其中，在芝麻油和蓖麻油中的芽管长度于23℃和30℃时均无显著性差异(23℃：F=3.51，P>0.05；30℃：F=2.41，P>0.05)。
| 植物油种类 Botanical edible oils | 芽管长度 The length of germ tube (μm) | 显著性差异 Significant difference | |||
| 10℃ | 16℃ | 23℃ | 30℃ | ||
| 大豆油 Soybean oil | 10.36±1.09Ad | 19.95±1.17Ac | 24.89±1.04Aa | 22.45±1.21Ab | F=356.58, P<0.01 |
| 玉米油 Maize oil | 2.91±0.62CDd | 5.27±0.77Fc | 9.83±0.80Da | 7.58±0.75Eb | F=198.55, P<0.01 |
| 橄榄油 Olive oil | 1.99±0.66Ed | 4.37±0.86Gc | 8.95±0.84Ea | 6.63±0.89Fb | F=161.97, P<0.01 |
| 花生油 Peanut oil | 7.13±0.71Bd | 16.66±1.15Bc | 21.39±1.02Ba | 18.98±1.04Bb | F=427.02, P<0.01 |
| 葵花籽油 Sunflower seed oil | 2.19±0.90DEd | 4.46±0.88Gc | 9.10±1.00Ea | 6.76±0.97Fb | F=124.93, P<0.01 |
| 芝麻油 Sesame oil | 2.43±0.99DEd | 11.70±1.22Ec | 16.45±0.95Ca | 14.06±1.17Db | F=354.27, P<0.01 |
| 蓖麻油 Castor oil | 3.47±0.78Cd | 12.38±0.72Dc | 17.07±0.86Ca | 14.60±0.67Db | F=690.60, P<0.01 |
| 菜籽油 Rape oil | 6.79±0.58Bd | 15.91±0.46Cc | 21.33±1.01Ba | 18.13±0.51Cb | F=952.61, P<0.01 |
| 显著性差异 Significant difference | F=143.77, P<0.01 | F=629.71, P<0.01 | F=656.68, P<0.01 | F=646.03, P<0.01 | |
Note: Data (
± s) with different capital letters in the same column are of the significant difference and different small letters in the same line are of the significant difference (P<0.01).
影响虫生真菌分生孢子萌发的因素很多[1]，其中温度在虫生真菌分生孢子萌发过程中起着重要的作用[21, 22]。本研究发现不同温度条件下食用植物油对莱氏野村菌分生孢子萌发的影响作用不同，10-30℃均能使莱氏野村菌分生孢子萌发，但是不同温度条件下萌发的速率不同。其中，23℃时的萌发速率最高，10℃时的萌发速率最小，这与Pornpoj等[22]的研究结果相同；此外，营养条件也会影响孢子萌发、芽管生长。本研究发现同一温度下不同油类对莱氏野村菌分生孢子的萌发率也存在差异，且大豆油中分生孢子的萌发率和芽管长度均最高。而根据供试8种植物油成分，供试植物油中主要成分为脂肪，包括饱和与不饱和脂肪酸，且相互间无明显差异，因此对于不同油类对莱氏野村菌分生孢子萌发的影响机理还有必要进一步深入研究。
林健文等[17]研究报道了分离自斜纹夜蛾幼虫的莱氏野村菌分生孢子在大豆培养基上的产孢量及孢子萌发率均高于小麦、燕麦等培养基质，本研究仅测定了分离自银纹夜蛾幼虫的莱氏野村菌菌株Nr0815在大豆油中的孢子萌发率，而对于产孢量的测定也将是值得研究的内容。同时，该大豆油对Nr0815菌株孢子萌发具有明显的促进作用，但是否含有可以促进莱氏野村菌分生孢子萌发的物质，需要进一步研究探讨。
昆虫隶属于节肢动物，其表皮一般分为上表皮和原表皮，其中上表皮是表皮的最外层，由脂蛋白组成，主要成份为蜡层、护蜡层和多元酚层组成[23]。本研究观察发现，莱氏野村菌分生孢子在供试的食用植物油中分散效果较好，可以形成单孢悬液，因此莱氏野村菌分生孢子溶于各种植物油可形成分散良好的分生孢子油剂，接种于虫体后其展布性就较好，从而有利于分子孢子的入侵。本研究结果将对选用植物油配制莱氏野村菌油剂提供重要的 依据。
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