纤维素是自然界最为丰富的可再生资源之一，然而纤维素难以降解却导致其利用率具有一定的局限性^[1]。近年来对纤维素降解方面的研究已有不少报道，而最经济﹑环保的方法是生物降解，即通过微生物等产生的纤维素酶来催化降解纤维素^[2]。

纤维素酶是一类广泛用于医药﹑食品﹑棉 纺﹑环保及可再生资源利用领域的酶制剂^[3]。迄今为止，国内外已有较多学者对降解纤维素的微生物做了大量的工作，产纤维素酶的菌种有很多，目前研究较多的是真菌、细菌和放线菌^[4]。长久以来，人们对真菌降解纤维素的研究较多，如木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium)等^[5,6,7]。细菌所产生的纤维素酶一般最适pH为中性至偏碱性^[8]，随着中性纤维素酶和碱性纤维素酶在棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中的成功应用，细菌纤维素酶制剂已显示出良好的应用前景。

本研究以滤纸为唯一碳源的选择性培养基进行富集，并采用CMC-Na平板培养基和LB培养基分离纯化，通过滤纸崩解实验和酶活测定获得4株能产纤维素酶的细菌，其中KZ-2产纤维素酶相对较高。本文进一步根据菌体的形态学、生理生化特征及16S rRNA基因序列分析等方面对KZ-2进行了鉴定，并对其产酶特性和酶学特性进行了初步试验。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样品采集：腐烂玉米秸秆采自长春郊外农田，放入桶中加少量水后，室温放置15 d。

1.1.2 培养基：富集培养基(g/L)：NaNO₃2.5，KH₂PO₄ 1.0 CaCl₂ 0.050 7，MgSO₄ 0.3，NaCl 0.1，FeCl₃ 0.01，滤纸片10，蒸馏水1 L。固体培养基(g/L)：NaNO₃ 2，K₂HPO₄ 1，KCl 0.5，MgSO₄ 0.5，FeSO₄ 0.01，CMC-Na 10，琼脂10，蒸馏水1 L。滤纸崩解培养基(g/L)：酵母提取物1.5，胰蛋白胨1.0，NaCl 1.0，蒸馏水1 L。每支试管分装7 cm深度，并放1 cm×6 cm滤纸条，1×10⁵Pa灭菌20min。LB培养基(g/L)：酵母提取物5.0，胰蛋白胨10.0，NaCl 5.0，琼脂15.0，pH 7.0，蒸馏水1 L。产酶发酵培养基(g/L)：CMC-Na 10.0，蛋白胨5.0，酵母粉10.0，NaCl 10.0，pH 5.0，蒸馏水1 L。

1.2 方法 1.2.1 菌种的富集：称取腐烂玉米秸秆2 g，加入盛有20 mL无菌水的50mL三角瓶中，30 °C摇床120 r/min振荡1 h制成菌悬液，静置15 min，吸取上清液2 mL加入含有200 mL富集培养基的三角瓶中，30°C、120 r/min摇床培养60 h。

1.2.2 菌种的分离与纯化：将上述菌悬液按照梯度稀释的方法，制成不同浓度的菌悬液，取10⁻¹−10⁻⁶不同稀释度菌液涂布至CMC-Na平板上，30 °C培养4 d，测量菌落直径。根据不同形态特征的菌落，选择生长情况良好的菌落，接种至LB液体培养基中，30 °C、120 r/min培养24 h。将菌悬液划线接种于LB培养基平板上30 °C培养24 h，分离出单菌落。

1.2.3 滤纸条崩解效果测定：挑取纯化后菌落分别接种到滤纸条崩解培养液中，30 °C、120 r/min振荡培养7 d。观察滤纸条的崩解情况。

1.2.4 酶活的测定：(1) 葡萄糖标准曲线的绘制：按DNS法绘制标准曲线^[9]。

(2) 粗酶液的制备：接种1 mL种子培养液至装有100 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，于30 °C、120 r/min培养5 d，收集菌液至50 mL离心管中，4 °C、4 000 r/min离心20 min，所得上清液即为粗酶液。

(3) 羧甲基纤维素酶活测定：取粗酶液0.5 mL于试管中，加入1.5 mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(0.05 mol/L，pH 7.0)配制含1%的CMC-Na底物溶液。50 °C保温50 min，然后加人2 mL DNS试 剂，煮沸显色5 min，在540 nm波长下测定吸光度值，并从葡萄糖标准曲线上查出相对应的葡萄糖含量，计算酶活力单位。酶活力单位定义：每毫升酶液在1 min内催化底物生成1μg葡萄糖所需要的酶量，即1 U/mL。

酶活力计算公式：X=(B×n×1000)/(0.5×t)

式中：B：从标准曲线查出净葡萄糖的浓度(g/L)；n：总体积；0.5：测定时吸取酶液的毫升数。

(4)滤纸酶活(FPA)测定：将滤纸剪成长条，规格为(1 cm×6 cm)，放入20 mL具刻度试管中，加入0.5 mL粗酶液和1.5 mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，50 °C恒温水浴50 min后取出，加入2 mL DNS试剂终止反应，摇匀后于沸水浴中处理5 min，取出冷却，按DNS法进行还原糖测定。

1.2.5 菌株生长情况：取1mL培养液加入9 mL无菌水，以不接菌的培养液为参照，在600 nm测定吸光值。通过OD₆₀₀值评价菌株的生长情况。

1.2.6 菌种的鉴定：(1) 细菌形态观察及生理生化鉴定：将分离出的单菌落制成菌悬液后接种于LB液体培养基，30 °C培养24 h后，取1 mL菌液，用pH 7.0的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，用戊二醛固定后做电子扫描观察菌体形态。LB琼脂平板上划线接种，30 °C恒温培养24 h，观察细菌生长情况及菌落特征，革兰氏染色，光学显微观察染色特征。参考《伯杰氏细菌鉴定手册》^[10]和《常见细菌鉴定手册》^[11]进行部分生理生化特征鉴定，主要包括吲哚试验、V-P试验、明胶水解及部分生化鉴定等。

(2) 菌株分子生物学鉴定：提取KZ-2菌株基因组作为PCR扩增模板，通用引物为27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAC-3′和1495R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反应体系(50 μL)：模板DNA 1 μL，引物27F (10 μmol/L)和1495R (10 μmol/L)各2 μL，2×PCR MasterMix 25 μL，双蒸水 20 μL。PCR条件：94 °C 5 min；94 °C 1 min，55 °C 1 min，72 °C 2 min，30个循环；72 °C 10 min，4 °C保存。目的片段电泳回收后送到北京华大基因测序，得到的序列用BLAST软件在GenBank数据库中进行比对。

1.2.7 产酶条件研究：(1) 培养时间对菌株产纤维素酶的影响：将筛选出的菌株接种于产酶发酵培养基，分别培养24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144﹑156 h，以不加菌的培养液作参照，30 °C、120 r/min培养，测量稀释10倍后液体培养基中菌株KZ-2的OD₆₀₀值，并按DNS法测定其酶活力，确定该菌在此条件下的最佳产酶时间。

(2) 培养温度对菌株产纤维素酶的影响：将筛选出的菌种接种于产酶发酵培养基，分别置于15、20、25、30、35、40、45 °C不同培养温度下培养，于摇床120 r/min培养5 d，测量稀释10倍后液体培养基中菌株的OD₆₀₀值并按DNS法测定其酶活力。

(3) 初始pH对菌株产纤维素酶的影响：用磷酸缓冲液分别配制成pH值3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5九个pH梯度的发酵产酶培养基，接种后于摇床30 °C、120 r/min培养5 d，测量稀释10倍后液体培养基中菌株的OD₆₀₀值并按DNS法测定其酶活力。

(4) 初始NaCl浓度对菌株产纤维素酶的影响：将产酶发酵培养基的NaCl含量分别调到0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%和3.5%七个不同浓度梯度，接种后于摇床30 °C、120 r/min培养5 d，按DNS法测其酶活力。

1.2.8 KZ-2菌株酶学性质初步研究：(1) pH对酶活力的影响：用pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配置1%的CMC底物溶液，加入粗酶液反应，在50 °C下测定CMCA酶活力与FPA酶活力。

(2) 温度对酶活力的影响：调节温度分别为25、30、35、45、50、55、60°C，在最适pH条件下反应50 min，测定不同温度下的CMCA酶活力与FPA酶活力。

(3) 金属离子对酶活力的影响：在最适温度和pH条件下，向酶反应体系中各加入0.2 mL、0.01 mol/L的KCl﹑CuCl₂、MgCl₂、FeCl₃、ZnCl₂，然后测定CMCA酶活力与FPA酶活力。

2 结果与分析 2.1 菌株的筛选

将稀释10⁻⁶的富集菌悬液涂布于CMC-Na平板培养基培养4 d后长出不同形态特征的菌落，选择生长状况良好的菌落平板划线于LB培养基分离得到4株菌株。分别将纯化过的菌株制成菌悬液，取1 mL菌液加入到装有100 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，30 °C、120 r/min培养5 d后，然后测定CMCA酶活力与FPA酶活力。筛选结果见表1。其中KZ-2滤纸崩解能力最强且酶活也最高。以此作为后续研究对象。

2.2 菌株的鉴定 2.2.1 菌株的形态特征及生理化特征：LB液体培养基培养24 h电子显微镜下观察结果如图1所示，菌体为棒状。KZ-2菌株在LB琼脂平板中培养24 h后，形成2.5 mm左右的菌落，菌落扁平圆形，表面有光泽，边缘整齐，湿润，显白色乳状，不透明。KZ-2生理生化特征研究结果表明，该菌为革兰氏阴性菌，兼性厌氧，吲哚实验和明胶水解显阴性，V-P反应显阳性，具体特征如表2所示。

2.2.2 菌株KZ-2的16S rRNA基因鉴定：以KZ-2菌株DNA为模板扩增该菌的16S rRNA基因，产物电泳纯化后送至北京华大基因测序，拼接处理后得到部分16S rRNA基因序列(共910 bp)，于GenBank数据库中序列经行BLAST比对后，发现16S rRNA基因与KZ-2相似性最高的类群为Enterobacter aerogenes，相似性达95%。利用MEGA 5.0的Neighbor-Joining构建系统发育树，结果如图2所示。结合KZ-2的菌落形态特征、生理化鉴定结果以及16S rRNA基因分析，初步鉴定KZ-2菌株为肠杆菌属的成员，并为潜在新种

2.3 菌株KZ-2产酶条件研究 2.3.1 培养时间对菌株生长和菌株产酶的影响：如图3所示，该菌的各个生长阶段比较明显。菌体生长的延滞时间较长，48 h后逐步进入生长对数期，当发酵达72 h左右时，菌体生长达到稳定期，144 h后细菌开始衰退。由产酶量曲线可知，产酶量与细菌生长基本保持同步，二者关系表现为偶联型，即菌体快速生长过程中酶量也迅速增加，菌体生长稳定期时产酶量基本保持稳定，对该菌培养120 h CMCA酶活力和FPA酶活力均达最大值。因此对该菌培养120 h后能较好地反映该菌的产酶量。

2.3.2 培养温度对菌株产酶的影响：如图4所示，在温度为25−35 °C时菌生长良好，其产酶量也较高，当温度低于25 °C或高于35 °C时细菌生长受到抑制，导致产酶量也降低。

2.3.3初始pH对菌株产酶的影响：如图5所示，当培养基的初始pH小于4.5时，KZ-2的生长严重受到限制，此时产纤维素酶量也较低；当pH大于4.5时，菌体生长基本保持稳定，在初始pH为5.5时出现峰值。由产酶曲线可知当初始pH为4.5−5.5时CMCA酶活较高，之后随着初始pH的升高而迅速降低，当pH值高于6.5后基本保持不变；当初始pH在5.0−6.5时FPA酶活酶较高，当pH值大于6.5时其值也降低，但是没有CMCA降低明显。

2.3.4 初始NaCl浓度对菌株产酶的影响：结果见图6。实验表明初始NaCl浓度对KZ-2的生长具有一定的影响，在初始初始NaCl浓度在1.0%−2.0%时该菌生长情况良好，且此时产酶量也较高。

2.4 菌株KZ-2纤维素酶学性质 2.4.1 pH对酶活力的影响：由图7可以看出KZ-2所产的粗酶液在pH 6.0−8.0之间都能保持较高的酶活，在pH 7.0 时酶活最高。由此说明KZ-2所产的纤维素酶最适pH为中性。

2.4.2 温度对酶活力的影响：结果如图8所示，KZ-2所产的纤维素酶在30-45 °C时缓慢升高，在45-55 °C时酶活相对保持稳定，在50 °C时有最高活性，当温度高于55 °C后酶活迅速下降。

2.4.3氯化盐对酶活力的影响：在pH 7.0、50 °C反应温度下，加入0.01 mol/L的KCl、CuCl₂、MgCl₂、FeCl₃、ZnCl₂溶液各 0.2 mL，然后测定酶活。酶活力如图9所示，KCl和FeCl₃对酶活力有促进作用，CuCl₂和ZnCl₂对酶活力有抑制作用，而MgCl₂对酶活力并无太大的影响。

3 讨论

纤维素降解菌的筛选方法有很多，现在较为常用的方法是滤纸条培养基法和刚果红鉴别培养基平板法^[12]。滤纸是聚合度和结晶度均居中等的纤维材料，因此能够较真实地反映天然纤维素的情况，

如果所筛菌株能在以滤纸条为唯一碳源的培养基上生长，认为该菌株可能具备产纤维素酶的能力。本研究以滤纸为唯一碳源的选择性培养基进行富集，从腐烂玉米秸秆分离纯化得到一株产纤维素酶菌株肠杆菌(Enterobacter sp.) KZ-2，16S rRNA基因序列发现，与其同源性最高的菌株为产气肠杆菌，该类微生物的研究目前主要集中于致病机理、发酵产氢气和发酵产乳酸等方面^[13,14,15]，其产纤维素酶的报道较少。结合生理生化实验，将该菌初步命名为肠杆菌KZ-2(Enterobactersp. KZ-2)，并对其产纤维素酶特性和酶学特性进行初步研究。以往文献报道的产中性纤维素酶的主要菌种是长梗木霉、腐殖菌、芽胞杆菌等^[16]，而Enterobacter sp.能产中性纤维素酶却未见文献报道，这一发现为进一步开发工程菌株提供了新的菌源。

纤维素分解细菌所产生的酶有很多重要的应用价值，但产酶水平偏低，可能与酶本身特点、液体发酵培养基成分有关。目前有不少纤维素降解菌产酶条件的报道，于婷婷等^[17]通过单因素实验确定培养时间、培养温度、摇床速率和初始pH对一株细菌产纤维素酶的影响，该菌在最佳产酶条件下最大CMCA酶活和FPA酶活分别为54.97 U/mL和23.10 U/mL；刘健国等^[18]通过正交实验确定一株纤维素降解细菌最佳氮源，并确定该菌在最佳产酶条件下，CMCA最大酶活为38.96 U/mL。本实验通过调节温度，设计不同的初始pH值、初始NaCl浓度对KZ-2产酶条件进行了研究，并测定稀释10倍后菌液的OD₆₀₀值以评价菌体生长与产酶量的关系。该菌在最佳产酶条件范围内连续培养5 d，CMCA酶活和FPA酶活分别为80.93 U/mL和80.03 U/mL。

酶学性质的初步研究显示，KZ-2产生纤维素酶反应的最适pH为7.0，在pH 6.0−8.0之间都能保持较高的酶活；最适反应温度以50 °C为宜，且具有较好的温度稳定性，与刘森林等^[19]筛选的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的酶学性质相似。KZ-2菌株所产纤维素酶的这些性质使其在棉织品的水洗整理工业中具有良好的开发前景，值得进一步研究。