几丁质酶(EC 3.2.1.14)是一类重要的水解酶，能够催化几丁质水解产生N-乙酰氨基葡萄糖单体或低分子量几丁寡糖^[1]。近年来，几丁质酶因在制备几丁寡糖、处理海洋废弃物以及农业生物防治等方面具有大的应用潜力而备受关注。几丁质酶广泛存在于细菌、链霉菌、真菌、植物、昆虫甚至脊椎动物中。微生物来源的几丁质酶具有生产速度快、产量高、性能稳定等优点，已成为几丁质酶研究的主要来源。迄今，已有许多不同微生物来源几丁质酶的报道，其中细菌几丁质酶的研究较为广泛和深 入^[1,2]。目前已报道产几丁质酶的细菌主要有弧菌(Vibrio)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、单胞菌(Monoucleosis)和芽孢杆菌(Bacillus)等^[1,3,4]。海洋环境中含有丰富的几丁质，如虾壳、蟹壳、贝壳等，这些物质如果不经过处理，会造成严重的环境污染，其中酶法水解是几丁质降解的一条重要途径^[5]。但目前的研究还存在几丁质酶产生菌发酵产酶水平低、产酶周期长等问题，限制了其工业化生产。海洋中的微生物是几丁质酶的重要来源，与其他环境来源的几丁质酶相比，多数海洋几丁质酶具有耐受更高盐度、pH以及温度等能力^[6]。这些极端环境的耐受特性有助于其工业应用，因此从海洋环境中筛选产几丁质酶的微生物对几丁质降解具有重要意义

类芽孢杆菌属(Paenibacillus)最初归类在芽孢杆菌属(Bacillus)，直到1993年由Ash等^[7]应用PCR探针技术将原属于芽孢杆菌的11个种分出来，才建立了新属。类芽孢杆菌属(Paenibacillus)倾向产生膨胀的、椭圆形的芽孢。近年来，已有一些类芽孢杆菌属菌株产几丁质酶的报道。2007年Patel等^[8]通过Plackett-Burman设计优化发酵条件，将萨拜娜类芽孢杆菌(Paenibacillus sabina) JD2产几丁质酶水平提高2.74倍，达到1.38 U/mL。2008年Ahmadi等^[9]从伊朗分离获得了嗜几丁类芽孢杆菌(Paenibacillus chitinolyticus)，发酵3 d几丁质酶活力为0.1 U/mL。2010年Singh^[10]分离出一株产几丁质酶的类芽孢杆菌(Paenibacillussp.) D1，通过统计优化产酶达到1.55 U/mL。Belen等^[11]通过氮源优化使帕布利类芽孢杆菌(Paenibacillus pabuli)菌株发酵活力提高到0.2 U/mL。本实验室从中国南海水样中筛选得到一株能够产几丁质酶的海洋细菌，鉴定其为巴伦葛兹类芽孢杆菌。目前，国内外还未见巴伦葛兹类芽孢杆菌产几丁质酶的研究报道。本文系统研究了巴伦葛兹类芽孢杆菌的选育、产几丁质酶的发酵条件优化，旨在发掘新的产几丁质酶菌株，提高几丁质酶的酶活力，为将来几丁质酶的生产和应用提供理论依据。

BT100-2J恒流蠕动泵，保定兰格仪器厂；TU-1800PC紫外可见分光光度计，北京普析通用有限公司；硅胶板60F₂₅₄，德国Merck公司；DK-S24电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；GL-20B冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂。

海水样采集自中国南海；制备培养基所用的几丁质购自山东潍坊科海甲壳素有限公司；酶活力测定用几丁质购自美国Sigma公司；胰蛋白胨及酵母粉购自英国Oxoid；乙二醇几丁质购自日本Wako公司；荧光增白剂28(Fluorescent Brightener 28)购自美国Sigma公司；低分子量标准蛋白质购于宝生物工程(大连)有限公司；其他试剂若无特殊说明均为分析纯。

筛选培养基(g/L)：胶体几丁质5.0；(NH₄)₂SO₄ 2.0；MgSO₄·7H₂O 0.5 K₂HPO₄ 0.3；KH₂PO₄ 0.7；FeSO₄ 0.1；琼脂15.0；pH自然。

摇瓶发酵培养基(g/L)：粉末几丁质5.0；(NH₄)₂SO₄ 2.0；MgSO₄·7H₂O 0.5；K₂HPO₄ 0.3；KH₂PO₄ 0.7；FeSO₄ 0.1；pH自然。

种子培养基：同摇瓶发酵培养基。

种子液制备：将单菌落用接种环接入到装有100 mL发酵培养基的三角瓶(500 mL)中，45 °C、200 r/min培养过夜，即为种子液。

将水样用无菌水稀释后，涂布于筛选培养基平板上，于50 °C培养箱中培养。挑选有明显透明圈的菌落，划线分离纯化。将划线后长出的单菌落接入摇瓶发酵培养基中进行产酶复筛，45 °C恒温揺床200r/min培养3 d，离心后取发酵上清液测定酶活力。将酶活力较高的菌株保存并鉴定。

按照分子生物学操作手册提取目标菌株的DNA，利用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，扩增结果委托华大基因进行测序，测序结果在NCBI数据库上进行序列比对。根据比对结果，利用ClustalX和MEGA软件构建菌株系统发育树。同时按照伯杰细菌鉴定手册^[12]及文献^[13]的方法，对目标菌株做培养特征分析和生理生化鉴定。

参照杨绍青等^[14]的方法并稍有改动，取200µl胶体几丁质溶液(1%)于1.5 mL离心管中，50 °C水浴预热10 min，然后向离心管中加入200 µl适当稀释的酶液。50 °C反应30 min后加入600 µl DNS试剂终止反应，最后煮沸10min显色。12000 r/min离心5min，取上清液540nm下测吸光度值。酶活力单位(U)定义为：在上述反应条件下每分钟释放1 µmol N-乙酰氨基葡萄糖所需要的酶量，同时以N-乙酰氨基葡萄糖制作标准曲线。

蛋白含量的测定参照Lowry等的方法^[15]，以牛血清蛋白制作标准曲线。

试验采用单因素条件对巴伦葛兹类芽孢杆菌产几丁质酶的发酵条件进行优化，包括碳源、氮源、发酵温度、培养基pH值、表面活性剂以及培养时间。分别选取0.5% (质量体积比)粉末几丁质、胶体几丁质、虾蟹壳粉、粉末壳聚糖、蔗糖、可溶性淀粉、CMC、葡萄糖为碳源，考察不同碳源对发酵产酶的影响。最佳碳源确定后考察碳源添加量对产酶的影响。在碳源优化的基础上，选取0.2%(质量体积比)蛋白胨、牛肉膏、酵母浸提物、硫酸铵、硝酸铵、尿素为氮源，进一步考察氮源对产酶的影响。然后考察发酵温度(30−55°C)，培养基初始pH (4.0−9.0)以及0.1% (质量体积比)表面活性剂种类对产酶的影响。最后在优化后的培养条件下发酵，考察几丁质酶的产酶历程并确定最佳发酵时间。

SDS-PAGE电泳使用分离胶浓度为12.5%，浓缩胶浓度为4.5%。考马斯亮蓝R-250染色显示蛋白带，并利用Gel-ProAnalyzer软件分析蛋白分子量。

几丁质酶酶谱：电泳分离胶中加入100mg/L乙二醇几丁质，将电泳结束的分离胶用100 mmol/L的乙酸钠溶液(pH 5.0)配成的10 mL/L Triton X-100复性24 h，然后用50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.9)配制的100 mg/L荧光增白剂28染色 5 min，再用蒸馏水洗1 h，最后将分离胶放置在紫外灯下观察，几丁质酶活性带显示为暗带，而背景为蓝色荧光。

数据分析试验数据采用Excel软件进行分析，试验中各发酵条件的优化均做3次平行，结果取3次结果的平均值。

利用几丁质酶筛选培养基，从中国南海水样中发现多个产生明显透明圈的菌株。通过分离纯化并进行摇瓶复筛，发现编号CAU904的菌株产几丁质酶能力较强。初始酶活力达到1.5 U/mL，且产酶稳定，以此菌为进一步实验的菌株。根据分子生物学手册的方法扩增其16S rDNA，测序结果在NCBI数据库中进行比对。结果显示菌株CAU904与巴伦葛兹类芽孢杆菌(Paenibacillus barengoltzii)的一致性达到99%，且系统发育树显示该菌株属于类芽孢杆菌属，与巴伦葛兹类芽孢杆菌(NR_113988)同属一个分支(图1)。

图 1　依据16S rDNA序列构建的菌株CAU904系统发育树 Figure 1　Phylogenetic tree of strain CAU904 based on 16S rDNA sequences 注：括号中的序号代表菌株的GenBank登录号；分支点上的数字代表计算1 000次聚类到一起的几率；标尺刻度代表0.5%的序列差异. Note：Numbers in parentheses represent the sequence’s accession number in GenBank. The number at each branch point is the percentage supported by bootstrap. Bar: 0.5% sequence divergence.

图选项

培养特征显示该菌为革兰氏阳性棒状细菌，周围有椭圆形的孢子产生，严格好氧。菌落扁平，光滑，圆形，呈淡黄或乳白色，周围未发现色素产 生。其生理生化特征(表1)与Osman等^[13]报道的巴伦葛兹类芽孢杆菌(Paenibacillus barengoltzii)特征一致。综上表明菌株CAU904为巴伦葛兹类芽孢 杆菌。

分别采用粉末几丁质、胶体几丁质、虾蟹壳粉、粉末壳聚糖、蔗糖、可溶性淀粉、CMC、葡萄糖作为唯一碳源，进行菌株产几丁质酶发酵实验，结果见表2。当以胶体几丁质为碳源时产酶最高，达到2.8 U/mL，其次为粉末几丁质(1.5 U/mL)和虾蟹壳(1.3 U/mL)。而以葡萄糖、蔗糖、CMC或可溶性淀粉作为碳源时，几丁质酶的产量较低(≤0.4 U/mL)。同时考察了胶体几丁质添加浓度(0.1%−2.0%)对产酶的影响，结果表明0.5%为最佳(数据未显示)。

在最佳碳源的基础上，添加不同氮源(添加量均为0.2%的有效氮)以考察氮源对菌株产几丁质酶的影响，结果见表3。不同氮源对菌株产几丁质酶活力区别较大，其中以酵母浸提物作为氮源时酶活力最高，达到4.9 U/mL，其次为蛋白胨，同时结果还表明该菌株也能利用无机氮源产几丁质酶。

不同温度下发酵培养巴伦葛兹类芽孢杆菌，其产几丁质酶结果如图2所示。当发酵温度为45℃时菌株产酶量最高,达到4.9 U/mL,当培养温度降低到35℃时,酶活力明显下降,为最高酶活力的一半左右,当温度进一步降低到30℃以下或升高到55℃以上时,产酶量出现了显著降低,产酶量仅分别为最高酶活力的40.8%和8.1%。该菌株能在较高温度下高效生产几丁质酶,有利于减少培养过程中的杂菌污染。

图 2　不同温度对巴伦葛兹类芽孢杆菌CAU904发酵产几丁质酶的影响 Figure 2　Effect of temperatures on chitinase production by P. barengoltzii CAU904 Note: Culture conditions: 0.5% (w/v) colloidal chitin, 0.2% (w/v) yeast extract, natural pH (6.0), 45 °C for 3days.

图选项

将液体发酵培养基调节至不同pH进行发酵，以考察初始pH对菌株产酶的影响。结果如图3所示，当初始pH为7.0时，菌株产酶量最高，达到5.6 U/mL。培养基初始pH在6.0−8.0之间变动时，pH对发酵产几丁质酶的影响不大，都保持在较高水平分别为最高值的89.1%和98.1%，而当初始pH继续升高时，酶活力降低明显，当pH升高至9.0时，巴伦葛兹类芽孢杆菌产酶量仅为最高值 的20%。

图 3　培养基pH对巴伦葛兹类芽孢杆菌CAU904发酵产几丁质酶的影响 Figure 3　Effect of initial medium pH on chitinase production by P. barengoltzii CAU904 注：初始培养条件为0.5% (质量体积比)胶体几丁质、0.2% (质量体积比)酵母浸提物、pH自然(6.0)，45 °C发酵3 d. Note: Culture conditions: 0.5% (w/v) colloidal chitin, 0.2% (w/v) yeast extract, natural pH (6.0), 45 °C for 3 days.

图选项

在初步优化培养基的基础之上，添加不同表面活性剂(0.1%)产几丁质酶实验，结果见表4。添加吐温类表面活性剂对产酶有明显的促进作用，其中吐温-80的作用最为明显，最高活力达到8.2 U/mL，曲拉通X-100及司盘-80对产酶也有一定的促进作用，而添加SDS则严重抑制几丁质酶的产生。

在最佳参数的基础上，考察发酵时间对菌株发酵产酶的影响，结果如图4所示。菌株在优化后的发酵条件下，第1天即开始大量产酶，直至第3天时达到产酶高峰，此时酶活力达8.2 U/mL。该菌株在培养4 d后，酶活力开始下降，这与培养基中营养物质的消耗及代谢产物的积累有关。发酵过程中胞外蛋白质量浓度的变化趋势与酶活力的变化趋势相似。

图 4　发酵时间对巴伦葛兹类芽孢杆菌CAU904发酵产几丁质酶的影响 Figure 4　Effect of fermentation time on chitinase production by P. barengoltzii CAU904 注：初始培养条件为0.5% (质量体积比)胶体几丁质、0.2% (质量体积比)酵母浸提物、0.1% (质量体积比)吐温-80，pH 7.0，45 °C发酵3 d. Note: culture conditions: 0.5% (W/V) colloidal chitin, 0.2% (W/V) yeast extract, 0.1% (W/V) Tween-80, pH 7.0, 45 °C for 3 days.

图选项

巴伦葛兹类芽孢杆菌CAU904在优化的培养基条件下发酵3 d，其粗酶液的SDS-PAGE及酶谱见图5。该菌在以胶体几丁质为碳源诱导的情况下，酶谱中出现11条具有几丁质水解活性的同工酶条带。其中有3条主带，表明其活性较高，对应蛋白的分子量分别为54、47和38 kD。

图 5　巴伦葛兹类芽孢杆菌CAU904的粗酶液电泳图及几丁质酶酶谱 Figure 5　SDS-PAGE and chitinase zymogram analysis of the crude proteins from P. barengoltzii CAU904 注：M：低分子量标准蛋白；1：粗酶液；2：几丁质酶酶谱. Note: M: low molecular weight marker; 1: crude enzyme; 2: zymogram.

图选项

类芽孢杆菌属是近来研究较热的细菌，主要包括分泌生防拮抗物质、促进植物生长、产生多种胞外酶等^[16]。同时也是产几丁质酶的重要菌株之一，因此受到研究者越来越多的关注^[17]。本实验室从采集自中国南海的海水样品中筛选得到一株高产几丁质酶的耐热细菌，经鉴定为巴伦葛兹类芽孢杆菌。目前国内外还没有关于巴伦葛兹类芽孢杆菌产几丁质酶的报道。

通过单因素试验优化了巴伦葛兹类芽孢杆菌CAU904液体发酵产几丁酶的发酵条件。不同碳源对产酶的影响较大，蔗糖、可溶性淀粉、CMC和葡萄糖诱导产酶活力较低，而胶体几丁质产酶效果最佳，与Andronopoulou等的报道相似^[18]。Singh报道类芽孢杆菌则以虾蟹壳作为最佳发酵碳源^[10]。胶体几丁质或粉末几丁质能作为单一碳源良好地诱导巴伦葛兹类芽孢杆菌产几丁酶，说明几丁质类物质在菌株产几丁质酶过程中扮演着诱导物的角色^[18]。氮源对产酶的影响也很显著，有机氮源比无机氮源更有利于提高菌株的产酶活力，其中酵母浸提物的效果最佳，其次是蛋白胨。Meena等^[19]也报道了酵母浸提物作为最佳氮源，能够促进类芽孢杆菌发酵产几丁质酶。

发酵温度对产酶的影响实验表明，巴伦葛兹类芽孢杆菌表现了较广的产酶温度范围(30−55 °C)，并且随着温度增加产酶活力逐渐提高。其最佳的培养温度为45 °C，温度在50、55 °C时仍具有一定的产酶能力。大部分细菌的最适产酶温度在30−37°C之间。Kavitha等^[20]报道唐德链霉菌(Streptomyces tendae)最适发酵温度为37 °C。其他耐热细菌则具有更高的发酵温度。如Kudan等^[21]报道肠杆菌(Enterobacter sp.)的最适温度为45 °C。Meena等^[19]报道了一株耐热类芽孢杆菌，其最适发酵温度为45 °C。巴伦葛兹类芽孢杆菌的最适发酵温度较高，表明其具有良好的耐热性。培养基的初始pH值对微生物的发酵同样也起着重要的作用，大多数的细菌产几丁质酶的最适pH在中性或者略偏酸性^[22]。巴伦葛兹类芽孢杆菌的产酶最适pH为7.0，在pH 5.0−8.0之间时仍能保持较高的产酶能力。当培养基初始pH继续调整降低至4.0或升高至9.0时，酶活力开始迅速下降。Singh等^[10]报道的类芽孢杆菌D1最佳pH也为7.0。在发酵时间对产酶历程的影响中，发现巴伦葛兹类芽孢杆菌在发酵第1天时即有几丁质酶活性，在第3天时达到产酶高峰，随后活性逐渐降低。与以前报道的帕布利类芽孢杆菌(4 d)^[11]及类芽孢杆菌BISR-047(6 d)^[19]相比，巴伦葛兹类芽孢杆菌的产酶效率更高，较短的发酵周期有利于生产操作及成本的控制。

目前国内类芽孢杆菌产几丁质酶的报道较少，国际上关于类芽孢杆菌属微生物产几丁质酶的水平大多数在0.10−1.55 U/mL^[8,9,10,11]之间。最高的为Meena等^[19]分离的类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.) BISR-047，经发酵优化几丁质酶活力在第6天时达到11.86 U/mL，提高了3倍。而巴伦葛兹类芽孢杆菌CAU904的产酶水平经过优化后达到8.2 U/mL，产酶水平仅次于Meena等的报道^[19]。关于嗜热微生物产几丁质酶的报道相对较少，杨绍青等^[14]筛选出一株高温紫链霉菌(Streptomyces thermovolaceus) Z16，通过优化产酶条件后，产酶水平达到 5.5 U/mL。本研究中巴伦葛兹类芽孢杆菌发酵条件经优化后的产酶量处于较高的水平。此外，比较特别的是该菌株能同时分泌多达11种胞外几丁质酶，这对于几丁质酶的多样性研究也具有潜在价值。许多微生物能够分泌不止一种几丁质酶(内切几丁质酶、外切几丁质酶、N-乙酰氨基葡萄糖苷酶)。如真菌哈茨木霉(Trichoderma harzianum)可以产生7种不同的几丁质酶，包括2个N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(102 kD和73 kD)，4个内切几丁质酶(52、42、33和31 kD)和1个外切几丁质酶(40 kD)；细菌中作为几丁质酶研究代表的粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)已报道产5种不同几丁质酶(21、36、48、52和57 kD)；其他产几丁质酶较多的细菌，如环状芽孢杆菌(B. circulans)可产生6种几丁质酶，地衣芽胞杆菌(B.licheniformis)可产生5种几丁质酶^[23]。当这些酶协同作用时，能够更高效地分解几丁质，产生微生物可以利用的几丁单糖或寡糖，为微生物提供营养^[24]。本研究为深入分析巴伦葛兹类芽孢杆菌的产几丁质酶特性，及其在未来工业化领域上的应用提供了基础。