2015, Vol. 42扩展功能
文章信息
- 吴照祥, 郝志鹏, 曾燕, 郭兰萍, 黄璐琦, 王勇, 陈保冬
- WU Zhao-Xiang, HAO Zhi-Peng, ZENG Yan, GUO Lan-Ping, HUANG Lu-Qi, WANG Yong, CHEN Bao-Dong
- 三七根腐病原菌毁坏柱孢霉分子定量检测方法及其应用
- Molecular quantification of Cylindrocarpon destructans in the rhizosphere of Panax notoginseng for predicting plant
- 微生物学通报, 2015, 42(3): 598-607
- Microbiology China, 2015, 42(3): 598-607
- 10.13344/j.microbiol.china.140557
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文章历史
- 收稿日期: 2014-07-21
- 接受日期: 2014-10-27
- 优先数字出版日期(www.cnki.net): 2014-10-31
2. 中国药材公司 北京 100097;
3. 道地药材国家重点实验室 中国中医科学院中药资源中心 北京 100700;
4. 文山学院 文山三七研究院 云南 文山 663000
2. China National Group Corporation of Traditional and Herbal Medicine, Beijing 100097, China;
3. State Key Laboratory of Dao-di Herbs, National Resource Center for Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China;
4. Wenshan Institute of Sanchi Ginseng, Wenshan, Yunnan 663000, China
三七[Panax notoginseng (Burkill) F. H. Chen]是一种五加科人参属多年生草本植物，以其干燥的块根及茎入药，具有止血散瘀、消肿定痛等良好功 效[1]，已成为我国特有的大宗中药材之一。除广东、广西有极少量栽培外，目前三七主要分布于我国云南省文山壮族苗族自治州及其相邻地区[2]。由于长期的单一化、规模化密集栽培，加上阴凉潮湿的栽培环境及其自身的生理特性[3]，三七生产过程中普遍出现严重的连作障碍现象[4]，主要表现为不能连茬栽培和随着在地时间的延长土传病害发生愈发严重，其中根腐病的发生尤为突出[5]。三七根腐病的发生常常使七农遭受不同程度的经济损失，年平均损失在5%-20%之间，严重时全园绝收，已经成为阻碍产区三七种植业发展的主要制约因子之一[6]。
三七根腐病在各个季节均有发生，每年有两次发病高峰期，分别是3-4月和7-8月，与雨水充沛程度以及空气湿度密切相关[7]。关于三七根腐病病原已有不少的研究，其结果各不相同。Ma等[8]认为土壤真菌可能是引发三七根腐病发生的主导因子，也有研究[9, 10]认为细菌的侵染在根腐病的发生过程中起主导作用。对其他具有严重连作障碍的作物开展的研究多数表明随着连作时间的延长，土壤微生物群落逐渐从细菌主导型向真菌主导型转化[11, 12]，我们认为在三七根腐病发生过程中真菌的主导地位可能更加突出[13]。通过进一步对根腐病田间跟踪、病原分离鉴定等研究，缪作清等[3]认为毁坏柱孢霉(Cylindrocarpon destructans)和三七黄腐病菌(C. didymum)是田间三七根腐病的重要病原菌。朱有勇院士研究团队针对三七根腐病开展了深入而细致的研究工作，通过严格的分离、鉴定以及回接和再分离等程序后确定了毁坏柱孢霉是三七根腐病的重要病原菌地位[14]。目前，三七根际土壤毁坏柱孢霉的定量检测及其数量与植株生长、健康 状况等的数量效应关系方面的研究尚未有报道。
AM真菌是一种能与80%以上的陆生植物共生的有益土壤微生物[15]，与宿主植物建成良好共生后能够帮助宿主植物吸收矿质养分[16]，改善植物营养状况并提高其质量和产量[17]，增强其对生物和非生物胁迫的抗性[18, 19, 20]。已有研究表明大田条件下AM真菌的侵染状况与三七植株的健康状况密切相 关[21]。根据生态位理论，在资源有限的情况下，不同生态元占据相同生态位时就会出现典型的竞争共存和竞争淘汰的现象[22]，这也是AM真菌增强宿主对生物胁迫特别是土传病害抵抗能力的理论基础[23]。目前，三七根腐病的微生物防治方面的研究工作开展较少，AM真菌与病原菌侵染三七根系的相互关系还鲜有报道。
本研究利用含有SYBR Green I的实时荧光定量PCR对三七根际土壤毁坏柱孢霉进行定量检测，旨在构建其定量检测方法。同时，应用相关分析探究根际土壤毁坏柱孢霉的数量与植株生长以及AM真菌侵染的数量效应关系。
1 材料与方法 1.1 材料与试剂标准菌株C. destructans ACCC36225由中国农业微生物菌种保藏管理中心(Agricultural Culture Collection of China，ACCC)提供，该菌株由中国农业科学院植物保护研究所自云南省文山壮族苗族自治州砚山县两年生三七黄腐病块根组织分离 获得。
试验样品采自三七道地产区云南省文山壮族苗族自治州6个三年生三七栽培样点。各样点前茬未种植过三七或栽种三七后已经轮作10年以上(前茬作物均为玉米)。各样地三七的平均发病率在30%以下(表1)。
| 代码 Code | 行政区划 Administrative area | 纬度 Latitude | 经度 Longitude | 海拔 Altitude (m) | 发病率 Disease incidence (%) | |
| 1 | 干河乡 | 23°42'31.00"N | 104°25'11.07"E | 1 524 | 15 | |
| 2 | 追栗街彝族乡 | 23°18'28.35"N | 104°20'44.85"E | 1 390 | 30 | |
| 3 | 追栗街彝族乡 | 23°18'29.18"N | 104°20'43.14"E | 1 382 | 10 | |
| 4 | 柳井彝族乡 | 23°11'00.86"N | 104°13'27.03"E | 1 552 | 15 | |
| 5 | 古木镇 | 23°13'48.43"N | 104°12'39.84"E | 1 593 | 5 | |
| 6 | 古木镇 | 23°13'53.53"N | 104°12'01.63"E | 1 684 | 5 | |
提取基因组的试剂盒DNA FastDNA® SPIN购于美国MP Biomedicals公司；琼脂糖凝胶回收纯化试剂盒QIA quick gel extraction购于美国QIAGEN公司；质粒提取纯化试剂盒MiniBEST Plasmid Purification Kit购自大连TaKaRa Biotechnology公司；测定质粒浓度用Nanodrop® ND-1000购自美国NanoDrop Technologies公司；pGEM-T Easy载体购自美国Promega Corp.公司；大肠杆菌(Escherichia coli JM109)感受态细胞购自大连TaKaRa Biotechnology公司；SYBR® Premix Ex TaqTM购自大连Ta KaRa Biotechnology公司；iCycler iQ5 Thermocycler购自美国Bio-Rad公司。
1.2 方法 1.2.1 引物设计和特异性检测：根据Kernaghan 等[24]设计的引物对CDU1和CDL1b对混合土壤样品DNA以及毁坏柱孢霉纯培养菌株DNA进行PCR扩增，对扩增产物进行测序并与毁坏柱孢霉rDNA基因IGS序列(GenBank登录号：AY037554)进行比对。在此基础上利用Primer Premier 5.0设计其特异性定量引物CDU2 (5′-GCTACCCTATAGCGCAG GTG-3′)和CDL2b (5′-CCGTACTGGCTGAAGAGT CA-3′)，目标扩增片段长度152 bp。利用设计的引物对CDU2和CDL2b再次对混合土壤样品DNA和纯培养毁坏柱孢霉菌株基因组DNA进行PCR扩增并测序验证。 1.2.2 标准曲线的制作：用于毁坏柱孢霉rDNA基因IGS序列片段扩增的标准曲线采用C. destructans ACCC36225作为标准品来源。ACCC36225在PDA培养基上菌落呈现褐色(图1A)，具有大小分生孢子。大分生孢子呈柱状，有1-3个隔，大小约为(27-38) μm×(5-7) μm；具有黄色、间生或顶生的厚垣孢子，近球形，直径约为12-16 μm。收集ACCC36225菌丝和孢子等菌物材料，采用FastDNA® SPIN试剂盒提取其纯培养菌株全基因组DNA，经PCR扩增、1%琼脂糖凝胶分离后，回收152 bp大小的目标条带，用QIA quick gel extraction试剂盒纯化。纯化后的产物经测序验证后连接到pGEM-T Easy载体上。将连接后的载体转入大肠杆菌(Escherichia coli JM109)感受态细胞，挑取经蓝
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| 图1 毁坏柱孢霉C. destructans ACCC36225菌落形态(A)和特异性目标基因片段电泳图谱(B) Figure 1 Colonial morphology of C.destructans on PDA (A) and electrophoresis spectrum of targeted gene fragment (B) Note: M: DNA marker DL2000. |
白斑筛选和菌落PCR鉴定所获得的阳性克隆子送交北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序验证。所得克隆子经含有Ampicillin的LB液体培养基在37 °C、200 r/min培养过夜，采用MiniBEST Plasmid Purification Kit质粒提取纯化试剂盒提取质粒，并用Nanodrop® ND-1000测定质粒浓度。标准品质粒DNA模板中的毁坏柱孢霉rDNA基因IGS序列片段的拷贝数浓度(拷贝/μL)依照如下方法进行计算：基于标准品质粒DNA的大小为3 015 bp，每个标准品质粒DNA只含有一个毁坏柱孢霉 rDNA基因IGS序列拷贝，且1 bp的平均摩尔质量为660 g/mol，根据公式计算出标准品质粒DNA模板中目标片段的拷贝数浓度，rDNA基因IGS序列片段拷贝数浓度(拷贝/μL)=[6×1023 (拷 贝/mol)]×[DNA浓度(mg/L)/[一个基因组的摩尔质量(g/mol)]。
将标准品质粒DNA进行10倍梯度稀释制作的10−1-10−7系列标准样品和待测样品同时进行扩增，根据所得标准曲线计算出待测样品中的目标基因拷贝数，最后以每克干土的目标基因拷贝数为单位进行分析。
1.2.3 定量PCR体系：定量PCR体系(25 μL)包括12.5 μL SYBR® Premix Ex TaqTM，上下游引物 (10 μmol/L)各0.5 μL，灭菌超纯水10.5 μL，模板DNA 1 μL (约1-10 ng)。反应在iCycler iQ5 Thermocycler上按照以下程序运行：94 °C 5 min；95 °C 30 s，60 °C 40 s，72 °C 1 min，40个循环；72 °C 10 min。起始模板浓度由Ct值确定，采用iCycler 软件(Version 1.0.1384.0 CR)进行数据分析。按照0.1 °C/s的升温速率从65 °C升至95 °C进行熔解曲线的分析验证，分析标准曲线的扩增效率，并检测线性相关系数。 1.2.4 病原菌毁坏柱孢霉数量与植物生长及AM真菌侵染效应分析：按照6级标准[25]划分根腐病发生等级，其中0级：主根、须根健全，无病斑；1级：主根上有零星病斑，但不连片，须根上无病斑；2级：主根病斑连片，但小于根部周长的1/4，须根略微发病；3级：主根病斑大于周长的1/4，但小于1/2，须根病斑较多，但不连片；4级：主根病斑大于周长的1/2，但小于根部周长的3/4，须根略微发病；5级：整个根部均有病斑包围，根部腐烂，须根近无。每个样点按照蛇形法分别采集3-4株健康和3-4级的发病植株，其中健康植株地上部和根系表观生长正常，发病植株地上部发生萎蔫，块根中部及末端出现典型组织腐烂坏死病征。采用抖根法获得相应根际土壤样品[26]。沿土表分离植株地上部和根系，与根际土壤一道置冰上运回实验室。用自来水和去离子水冲洗干净植株根系，取下全部的细根剪成大约1 cm长的根段，剪下的根段先经过透明、酸化处理，再采用曲利苯蓝染色和乳酸甘油脱色后随机挑选30条根段制作临时装片。依据Duc等[27]的方法，按照菌根侵染和丛枝丰度分级的标准，设置等级参数，借助“mycocalc”软件，计算出表征AM真菌侵染状况的菌根侵染强度M%和整个根系的丛枝丰度A%。剩下的试验样品置80 °C烘箱中烘至恒重后称取干物重，经折算获得总干重。土壤样品装入无菌袋置低温下运回实验室，过 2 mm筛处理后一部分风干用于土壤理化性状分析，一部分保存于−80 °C，用于毁坏柱孢霉分子生态学定量分析。土壤理化性状指标按史瑞和等[28]《土壤农化分析(第3版)》所述方法测定并进行配对T检验，结果显示健康株和发病株根际土壤的物理化学性状无显著差异，其中pH值(水土比1:2.5) 4.66-5.52，有机质(重铬酸钾氧化还原滴定法) 8.74-16.41 g/kg，速效磷(0.5 mol/L NaHCO3提取，钼锑抗比色) 98.54-386.60 μg/g。土壤粒径组成基本一致，粘粒1.37%-57.66%、粉粒24.95%- 69.87%和沙粒5.14%-51.36%。土壤样品使用FastDNA® SPIN试剂盒提取其总基因组DNA，经1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段大小，并用Nanodrop® ND-1000测定其浓度和纯度，于−20 °C保存待用。所有试验数据使用Microsoft Excel进行均值和标准误计算并作图，使用SPSS统计软件(SPSS 16.0 for Windows，SPSS Inc，Chicago，USA)对数据进行统计分析，其中健康植株和发病植株根际毁坏柱孢霉rDNA基因IGS序列片段拷贝数浓度及植株生物量采用配对t检验，病原菌rDNA基因IGS序列片段拷贝浓度通过对数(log)正态分布转化后进行相关分析。
2 结果与分析 2.1 毁坏柱孢霉定量检测体系构建借助引物对CDL1b和CDU1分别对纯培养菌株DNA和混合土壤样品DNA进行扩增并测序，获得了单一的序列，经比对发现该序列与AY037554对应区段有99%的相似性。在该序列的基础上设计的定量引物对CDL2b和CDU2，对纯培养菌株DNA和混合土壤样品DNA进行再次扩增并测序也获得了单一的序列，证明所设计引物是毁坏柱孢霉rDNA基因IGS序列的特异性引物。
C. destructans ACCC36225在PDA培养基上菌落形态如图1A所示。经DNA提取、特异性引物的PCR扩增和测序验证获得152 bp的rDNA基因IGS序列的特异性目标片段(图1B)，该目标片段经连接、转化、质粒提取和再次测序验证获得浓度为3.13×108拷贝/μL含有毁坏柱孢霉特异性目标片段的质粒DNA。对10−1-10−7系列标准样品进行定量PCR扩增，以Ct值为纵坐标，以稀释倍数的对数为横坐标，获得定量PCR标准曲线(图2B)，其相关系数为0.999，扩增效率为90.0%，认为定量PCR对标准样品质粒DNA在10−1-10−7的梯度稀释范围内具有很好的线性关系。在PCR扩增后进行溶解曲线分析，结果表明该PCR反应过程中没有引物二聚体和非特异性扩增产物的产生(图2A)。
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| 图2 定量PCR的溶解曲线(A)和标准曲线(B) Figure 2 Melting curve (A) and standard curve (B) of quantitative PCR |
将上述质粒DNA按照10倍梯度稀释所得的10−1-10−7系列标准样品和待测样品同时进行定量PCR扩增，获得标准曲线(图2B)并对待测样品中的目标基因拷贝数进行换算，得到待测样品中毁坏柱孢霉rDNA基因IGS序列片段拷贝浓度，结果显示三七健康植株根际土壤毁坏柱孢霉rDNA基因IGS序列片段拷贝浓度显著高于健康植株(表2，P＜0.05)，发病植株为8.38×104-1.94×107 拷 贝/g干土，健康植株为7.18×103-1.02×105 拷贝/g干土。
| 样地编号 Sampling site | 健康植株 Healthy plant (copies/g) | 发病植株 Infected plant (copies/g) |
| 1 | 7.18E+03 | 8.38E+04 |
| 2 | 7.50E+04 | 3.20E+06 |
| 3 | 2.61E+04 | 1.94E+06 |
| 4 | 1.02E+05 | 1.44E+07 |
| 5 | 4.90E+04 | 6.62E+06 |
| 6 | 2.83E+04 | 1.94E+07 |
| 均值 Average | 4.80E+04a | 7.61E+06b |
| 标准差 Standard deviation | 1.44E+04 | 3.13E+06 |
健康植株地上部生物量略高于病害植株(P=0.06)，但两者根系生物量无显著差异。三七根际土壤毁坏柱孢霉rDNA基因IGS序列片段拷贝浓度经对数(log)正态转化后与地上部和根系生物量进行相关分析，结果如图3所示，根际土壤毁坏柱孢霉rDNA基因IGS序列片段拷贝浓度与植株地上部生物量表现出显著的负相关关系(图3A，P＜0.05)，植株地上部生物量随着根际土壤毁坏柱孢霉rDNA基因IGS序列片段拷贝的上升而降低，但与根系生物量相关关系不显著(图3B，P=0.066)。
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| 图3 三七根际毁坏柱孢霉rDNA基因IGS序列拷贝数与三七植株植物地上部(A)和根系(B)生物量的相关关系 Figure 3 The correlation of rDNA IGS fragment copies of C. destructans in the rhizosphere of P. notoginseng with plant shoot (A) and root (B) biomass |
三七健康植株的AM真菌侵染强度为 21.86%±4.11%，显著高于发病植株的11.01%±2.92%(P=0.015)，但丛枝丰度没有表现出显著性差异 (0.4%-15.62%)。三七根际土壤毁坏柱孢霉rDNA基因IGS序列片段拷贝浓度经对数(log)正态转化后与AM真菌侵染程度进行相关分析发现，根际土壤毁坏柱孢霉与菌根侵染强度显著负相关图4A，P＜0.05)，植株根际土壤毁坏柱孢霉的数量随着菌根侵染强度的升高而减少，而与丛枝丰度无显著相关关系(图4B，P=0.124)。
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| 图4 三七根际毁坏柱孢霉rDNA基因IGS序列拷贝数与菌根侵染强度(A)以及丛枝丰度(B)的相关关系 Figure 4 The correlation of rDNA IGS fragment copies of C. destructans in the rhizosphere of P. notoginseng with mycorrhizal colonization rate (A) and arbuscule abundance (B) in plant roots |
本研究建立了一种针对三七植株根际土壤中根腐病重要病原真菌毁坏柱孢霉的分子定量检测方法。该方法摆脱了传统的纯培养过程，与传统检测方法相比，具有高效、简单和快速等诸多优点。另外，本研究也初步探讨了三七植株根际土壤毁坏柱孢霉数量与植株生物量以及AM真菌侵染程度之间的数量效应关系。
实时荧光定量分析包括相对定量和绝对定量，两者各有优缺点和特定应用范畴，需要根据研究者的研究目的选择使用[29]。本研究采用了绝对定量分析的方法，它可以得到各个不同样本中目的基因的拷贝数和浓度，结果显示发病植株根际土壤毁坏柱孢霉rDNA基因IGS序列片段的拷贝浓度显著高于健康植株，另外对三七植株根系内的毁坏柱孢霉进行相对定量分析也发现发病植株根系毁坏柱孢霉相对数量显著高于健康植株(结果未显示)，这说明该病原菌在三七根腐病的发生过程中的确具有重要作用，这也验证了前人的研究结果[3, 14]。毁坏柱孢霉是一种多寄主病原菌，普遍存在于农业生态系统中，能侵染多种作物并对其产生不同程度的伤害，目前报道较多的有苹果[30]、人参[31, 32]、西洋 参[33]和油橄榄[34]等。因此，在三七种植前，种植地块的选择对三七生产过程中根腐病病害的发生与否以及发生程度至关重要。目前关于该病原菌数量与三七根腐病发生的临界阈值还缺乏深入的研究，该问题的解决将为三七种植地块的选择提供重要的决策支持。
三七根腐病主要表现为地上部萎蔫，块根中部及末端出现组织腐烂坏死[3, 4, 7]。通过分析发现三七根际土壤毁坏柱孢霉rDNA基因IGS序列片段的拷贝浓度与植株地上部生物量呈显著的负相关关系，而与根系生物量相关关系不显著。分析其原因我们认为三七植株根系被该病原菌侵染后消耗其营养转化为自身生物量，并通过影响植株生理作用引起其地上部的黄化、萎蔫。由于光合作用受阻和营养向下传递的双重作用，植株地上部生物量急剧下降。由于病原菌侵染可能诱导植株地上部光合产物更多向根部转运，因而根系生物量对病害的响应可能与地上部响应并不同步。与此类似，Aldea的研究也发现根系中侵染中柱的真菌数量与地上部的生长量成显著负相关关系[35]。病原菌侵染植物后，以植物组织为养料快速繁殖、扩散，并引起植物组织的发病症状。Johnson等[36]的研究发现引发柑橘黄龙病的病原细菌Candidatus liberibacter侵染植株后迅速扩散到植株地上部，并在根部产生病症前引发地上部萎蔫，但是目前关于病原真菌在寄主体内扩散过程还不明了。
AM真菌能够与绝大多数的陆生植物形成共生，促进其营养吸收、水分运输，增强其对生物胁迫和非生物胁迫的抗性[15, 16, 17, 18, 19, 20]。三七作为一种菌根植物，与AM真菌共生后其生长和病原菌抗性都有显著的提高[37]。本研究结果显示随AM真菌侵染程度的提高，三七植株根际土壤病原真菌毁坏柱孢霉的数量显著下降，表明AM真菌可能提高了三七对病原菌的抵抗能力。AM真菌增强植株抵抗病原菌的机制包括体质增强、生理调节以及生态位竞争等诸多理论，但对于三七该作用机制尚待进一步研究。
三七根腐病病原真菌毁坏柱孢霉分子定量检测方法的建立为该病原菌致病过程以及预防研究奠定了方法基础。后续需要进一步明确毁坏柱孢霉的致病数量阈值，深入研究该病原菌致病过程与机制，并有针对性地研究其防治方法，特别需要加强对包括菌根技术在内的生物防治方法的探索。
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