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文章信息
- 郭向娇, 王颖芳, 段广才, 王琳琳, 王鹏飞, 杨海燕, 郗园林
- GUO Xiang-Jiao, WANG Ying-Fang, DUAN Guang-Cai, WANG Lin-Lin, WANG Peng-Fei, YANG Hai-Yan, XI Yuan-Lin
- 临床分离志贺菌中CRISPR/Cas 系统的分布及其与毒力基因的关系
- Distribution of CRISPR/Cas system in Shigella clinical strains and its relationship with virulence genes
- 微生物学通报, 2015, 42(3): 543-549
- Microbiology China, 2015, 42(3): 543-549
- 10.13344/j.microbiol.china.140529
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文章历史
- 收稿日期: 2014-07-07
- 接受日期: 2014-09-15
- 优先数字出版日期(www.cnki.net): 2014-09-23
2. 河南科技大学 预防医学教研室 河南 洛阳 471023
3. 新乡医学院分子诊断与医学检验技术河南省协同创新中心 河南 新乡 453003
2. Department of Preventive Medicine, Henan University of Science and Technology, Luoyang, Henan 471023, China
3. Henan Innovation Center of Molecular Diagnosis and Laboratory Medicine, Xinxiang Medical University, Xinxiang,
由志贺菌引起的细菌性痢疾是发展中国家的常见病和多发病,严重危害人类尤其是儿童的健康。志贺菌的致病性主要取决于毒力基因的编码产物对肠粘膜上皮细胞的侵袭及毒性作用,所以毒力基因的存在与否是决定细菌致病性高低的关键因素。志贺菌的多个毒力因子与细菌的基因水平转移有关。因此如果能够阐明志贺菌毒力基因水平转移的方式和机制,对于志贺菌毒力变异的检测和有效控制将具有重要意义。
成簇的规律间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)与CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated,Cas)一起是近年来发现的细菌处理噬菌体等外源遗传物质的原核生物免疫系统[1, 2, 3]。由于CRISPR/Cas系统对于细菌遗传物质的获得和整合具有重要作用,因此受到学者们的极大关注。目前已在很多细菌基因组中发现CRISPR基因座(Locus),其中古菌詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcus jannaschii)所含的CRISPR基因座数目高达18个,而且不同CRISPR基因座其重复序列并不是保守的[4, 5]。目前学者通过对基因库中已进行全基因组测序的志贺菌分析发现:志贺菌最多存在3个CRISPR基因座,根据其所在位置的不同将其分别命名为CRISPR1-3,其中CRISPR1和CRISPR2含有相同的重复序列,CRISPR3含有与其不同的重复序列,但仅有CRISPR1临近cas基因簇,可形成完整的CRISPR/Cas系统,即I-E型CRISPR/Cas系统[6]。本课题组前期已进行CRISPR/Cas系统的检测[7],在此基础上,本研究探讨CRISPR/Cas系统在志贺菌中的分布情况,并初步分析该系统与毒力基因的关系,或许能为高毒力志贺菌的防控提供新的思路。
1 材料与方法 1.1 菌株所选57株志贺菌均为本实验室采集,于1996-2008年分离于河南及江西临床病人。所有菌株均经过生化与血清学鉴定:包括43株福氏志贺菌、12株宋内志贺菌株及2株痢疾志贺菌。
NCBI公布的全基因组测序的志贺菌CRISPR/Cas系统的简要介绍[6]:宋内志贺菌Ss046含有CRISPR1基因座和cas基因簇(cas3-cse1-cse2-cas7-cas5-cas6e-cas1-cas2),但其cas6e-cas5基因及cse2基因中存在插入序列ISSfl2和IS600;痢疾杆菌sd197虽然含有CRISPR1,但所含cas基因不完整;鲍氏志贺菌sb227只可检测到不完整的cas基因簇;4株福氏志贺菌sf301、sf8401、sf2002017和sf2457T中仅可检测到部分cas3基因和一条重复序列。这为我们分析CRISPR/Cas系统提供依据。
1.2 主要试剂细菌基因组DNA提取试剂盒购自上海莱峰生物有限公司,Taq DNA聚合酶以及DNA Marker购自上海生工生物工程技术服务有限公司,琼脂糖为BIOWEST公司进口分装。
1.3 主要设备PTC-100型基因体外扩增仪,MJRESEARCH公司;DYY-8C型稳压稳流定时电泳仪,北京六一仪器厂;Genesnap图像扫描仪,美国Syngene公司。
1.4 CRISPR1基因座及cas基因的PCR检测 1.4.1 DNA模板的制备:采用基因组DNA试剂盒从菌液中提取全基因组DNA。 1.4.2 引物序列:用于扩增CRISPR1基因座及其cas基因的引物序列见表1,所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。基因 Gene | 引物 Primer | 引物序列 Primer sequence (5′→3′) | PCR扩增产物长度 The length of PCR product (kb) |
CRISPR1 | CR1 fw | AGCGACTAACTGGAATCTTG | 0.7 |
CR1 rev | CAATCTGGCTACTGGAAGTG | ||
cas2-cas1 | cas2 fw | CCCATCCAAATCCACCGGAA | ~1.0 |
cas1 rev | CGCCTGCATTATGCTCGAAC | ||
cas6-cas5 | cas6 fw | TTGCTGTTGTCGGTAGGCAT | ~2.6/1.3 |
cas5 rev | ATGAACTTCCTTCGCGCTCA | ||
cas7 | cas7 fw | CACGTCCTTCATGCTTCCCT | ~1.0 |
cas7 rev | AACTGTGGTGCTGGATGGAG | ||
cse2 | cse2 fw | GCCCAGCGGATACGGATAAA | ~1.6/0.4 |
cse2 rev | ACGGATGGATTTCGCCTGTT | ||
cse1-cas3 | cse1 fw | TTTCTCCCTGGCGGCTTTAG | ~2.6 |
cas3 rev | GTCATTCCTGCTTCCAGCCT |
将CRISPR1的PCR扩增产物交由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。测序结果通过CRISPR finder在线软件进行CRISPR1信息的查询。
1.6 志贺菌毒力基因检测参照文献[8, 9, 10]设计毒力基因ipaH、ial、virA和ipaBCD引物,序列见表2,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。所选4种毒力基因中除ipaH基因在质粒和染色体上均有存在外,ial、virA以及ipaBCD基因仅在质粒上存在。
基因 Genes | 引物 Primers | 引物序列 Primer sequences (5′→3′) | PCR扩增产物长度 The length of PCR products (bp) |
ipaH | ipaH fw | TGGAAAAACTCAGTGCCTCT | 423 |
ipaH rev | CCAGTCCGTAAATTCATTCT | ||
Ial | ial fw | CTGGATGGTATGGTGAGG | 320 |
ial rev | GGAGGCCAACAATTATTTCC | ||
virA | virA fw | CTGCATTCTGGCAATCTCTTCACATC | 215 |
virA rev | TGATGAGCTAACTTCGTAAGCCCTCC | ||
ipaBCD | ipaBCD fw | GCTATAGCAGTGACATGG | 612 |
ipaBCD rev | ACGAGTTCGAAGCACTC |
应用SPSS 17.0软件进行卡方检验,P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果与分析 2.1 CRISPR1基因座以及cas基因的PCR扩增结果对57株志贺菌菌株的CRISPR1、cas2-cas1、cas6e-cas5、cas7、cse2和cse1-cas3基因进行PCR扩增,以菌株mel-sf2006242/zz (A)和mel-sf2008123/zz (B)为例(图1)说明PCR扩增结果。菌株mel-sf2006242/zz的cas6e-cas5以及cse2的基因片段长度较菌株mel-sf2008123/zz明显更长,说明菌株mel-sf2006242/zz这两个基因片段中含有插入序列。
2.2 志贺菌毒力基因ipaH、ial、virA及ipaBCD的PCR扩增结果志贺菌毒力基因的PCR扩增结果见图2。毒力基因ipaH以及ial在所有志贺菌中均可检测到;virA基因的阳性率为98.2% (56/57);ipaBCD基因的阳性率为87.7% (50/57)。
2.3 CRISPR1测序结果分析对志贺菌CRISPR1的PCR扩增结果进行测序,并通过CRISPR finder软件对测序结果进行分析,结果显示有48株志贺菌可以检测到重复序列和间隔序列,其余9株细菌仅含有部分cas3基因和一条重复序列。
志贺菌CRISPR1基因座中间隔序列数目最多有9条,但大部分菌株只含有2或3条间隔序列。本研究共发现了15条特异的间隔序列,将其分别编号为*1-15,通过分析可得到结果如表3所示:重复序列数为1的全为福氏志贺菌(9株);重复序列序列数目为3的30株志贺菌,不论其血清型为福氏志贺菌(23株)还是宋内志贺菌(7株)其间隔序列(*1和*2)是完全相同的;在重复序列数目为4的16株菌株中,有13株不论其血清型为福氏志贺菌(10株)、宋内志贺菌(2株)还是痢疾志贺菌(1株)其间隔序列(*1、*3和*4)是完全相同的,另3株包括2株宋内志贺菌和1株痢疾志贺菌其间隔序列(*1、*5和*6)也保持一致;仅有1株福氏志贺菌可检测到9个间隔序列(*7-*15)。
重复序列数目 Number of repeats | 间隔序列 Spacers | 福氏志贺菌 S. flexneri | 宋内志贺菌 S. sonnei | 痢疾志贺菌 S. dysenteriae | 合计 Total |
1 | - | 9 | 0 | 0 | 9 |
3 | *1, *2 | 23 | 7 | 0 | 30 |
4 | *1, *3, *4 | 10 | 3 | 1 | 14 |
4 | *1, *5, *6 | 0 | 2 | 1 | 3 |
10 | *7-*15 | 1 | 0 | 0 | 1 |
Note: *1: TTACTGCTTGGTATGCGGAATCACACCCTGAA; *2: TAAGTGATATCCATCATCGCATCCAGTGCGCC; *3: TGTACGCGG CGAGTTTTAGCGACAGGTCATCC; *4: GGGGCGATCAATTGAGCCGTACTTTTCTGAAA; *5: CCTGACGCGCCGCAGTATTTATCT GCTCTGGC; *6: GGGTGCGTGTGGCTGCCAGTGCCGGAGAACGG; *7: AAAACCAAACTTCTCCATAAATTCCATAGCCG; *8: GAGTCTATCAGCGACACTACCGGCAATAGCGA; *9: CTATAGCGCCAC GTTCCGAGCGCTGCGAGCTG; *10: GCATCCATGCCGA CGCCTTTACGTGTGCGGGG; *11: GCGCGAATTTGTGCGCATGGGGCGCATTTTTGG; *12: ACGATGGCGATGCGTGAGAAAGG GGGTCGATA; *13: AGTTCGCTGAGTAGCCTTTTTTCTGTGCCTAA; *14: GAGGTGGCAATACGCGTAGATCATTTGGTCGT; *15: CAAAATATTACGAGCTTTCGTCAGGCCATGGAC. |
根据cas基因的PCR扩增结果及CRISPR1的测序结果,我们将cas基因中含有插入序列的称为失活CRISPR/Cas系统(Inactive-CRISPR/Cas);cas基因中不含插入序列的为活性CRISPR/Cas系统(Active-CRISPR/Cas);其余则为CRISPR/Cas系统缺失(Absent-CRISPR/Cas)。比较分析CRISPR/Cas系统在志贺菌不同血清型中的分布显示(表4):57株志贺菌中,CRISPR/Cas系统总的检出率较高,为84.2% (48/57),但活性CRISPR/Cas系统的检出率较低,仅为26.3% (15/57);只在福氏志贺菌中发现CRISPR/Cas系统的缺失。
Group | 福氏志贺菌 S. flexneri | 宋内志贺菌 S. sonnei | 痢疾志贺菌 S. dysenteriae | 合计 Total | ||||
Active-CRISPR/Cas | 9 | 5 | 1 | 15 | ||||
Inactive-CRISPR/Cas | 25 | 7 | 1 | 33 | ||||
Absent-CRISPR/Cas | 9 | 0 | 0 | 9 | ||||
Total | 43 | 12 | 2 | 57 |
由于所检测的4种毒力基因中ipaH、ial及virA的阳性率非常高,因此分析了CRISPR/Cas系统与毒力基因ipaBCD的关系,结果如表5所示:志贺菌中活性CRISPR/Cas系统的分布与ipaBCD的检出率无关(P>0.05)。
Group | ipaBCD+ | ipaBCD- | Chi-square | P-value | ||||
Absent and inactive-CRISPR/Cas | 39 | 3 | ||||||
Active-CRISPR/Cas | 11 | 4 | 2.308 | 0.129 | ||||
Total | 50 | 7 |
CRISPR/Cas系统是近年来发现的细菌处理噬菌体、质粒等外源遗传物质的原核生物免疫系统[1, 2, 3]。本研究首次分析了临床分离志贺菌中CRISPR/Cas系统的分布情况,并初步探讨了该系统与毒力基因的关系。
本研究发现CRISPR1基因座中间隔序列的数目较少且一致性较高:重复序列数目为1的全为福氏志贺菌(9株);重复序列序列数目为3的30株志贺菌,不论其血清型为福氏志贺菌(23株)还是宋内志贺菌(7株)其间隔序列是完全相同的;在重复序列数目为4的16株菌株 中,有13株不论其血清型为福氏志贺菌(10株)、宋内志贺菌(2株)还是痢疾志贺菌(1株)其间隔序列是完全相同的,另3株包括2株宋内志贺菌和1株痢疾志贺菌其间隔序列也保持一致;仅有1株福氏志贺菌可检测到9个间隔序列。部分福氏志贺菌中出现了间隔序列的完全缺失可能是由于福氏志贺菌含有丰富的可移动遗传物质以及假基因[11],而CRISPR/Cas系统的功能之一为阻断可移动遗传物质的转移。间隔序列在不同菌株间的一致性可能是由于本实验所用大部分菌株均分离自河南省,相同的生活环境导致它们的间隔序列较一致。有研究表明cas基因的活性与间隔序列数目有关[6],这与本研究一致:cas基因中含有插入序列的大部分菌株其间隔序列数目较少。另外我们推测cas基因中的插入序列可能晚于CRISPR/Cas系统出现,其出现可能是由于高毒力或(和)高耐药环境下志贺菌不得不使CRISPR/Cas系统失活的一种方式,这样志贺菌就能获得更多的毒力或耐药特征,从而更利于其生存。
另外我们分析了志贺菌中CRISPR/Cas系统与毒力基因的关系,结果显示志贺菌中活性CRISPR/Cas系统的存在与所检测毒力基因的分布无关。我们推测原因之一可能是本研究所检测毒力基因的阳性率均较高,其中检出率最低的ipaBCD基因也达到87.7%;另外样本量较小可能也是一个重要原因。因为研究者已发现CRISPR/Cas系统干扰可以阻挡质粒结合以及转移[12]。而且在其他致病菌中,学者还发现CRISPR/Cas系统与毒力基因或耐药基因的分布呈负相关。例如在肠球菌(Enterococci)中,具有多重耐药特征的菌株通常缺失CRISPR/Cas系统[13]。相似的情况出现在粪肠球菌(E.faecalis)中,CRISPR/Cas系统的分布与编码乳糖操纵子(Cytolysin operon)和粘附素(Aggregation substance,AS)的基因呈负相关,由于乳糖操纵子基因以及粘附素基因均位于毒力岛上,因此他们推测该系统在毒力岛的获得中具有重要作用[14]。更重要的是,在肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)中,学者通过实验发现CRISPR/Cas系统干扰可以有效阻断含有荚膜基因的质粒进入无毒菌株,从而避免了不含荚膜基因的无毒菌株转化为含荚膜基因的有毒菌株,从而抑制毒力株的出现[15]。因此,为了更好地理解志贺菌中CRISPR/Cas系统与毒力基因的关系,今后应该注重扩大研究所需样本量并且更多的关注存在于质粒上的其他毒力基因。
由于CRISPR/Cas系统可以阻挡基因的水平转移,因此该系统或许为今后高毒力志贺菌的防控提供新的思路。本研究探讨了临床分离志贺菌中CRISPR/Cas系统的分布特征,但并未发现CRISPR/Cas系统与毒力基因的分布有关,为今后志贺菌中CRISPR/Cas系统的研究奠定基础。
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