1998年，Handelsman等^[1]首次提出“宏基因组”的概念，即特定生态环境中所有生物遗传物质的总和，目前宏基因组学已经被广泛用于挖掘新型生物催化剂中。宏基因组的产生克服了传统微生物分离培养的难题，扩大了微生物资源的利用。利用宏基因组学技术已经筛选到多种新型生物催化剂^{[2, 3, 4, 5]}，使得宏基因组成为微生物活性物质筛选的新途径^[6]。

磷脂酶来源不同，其与磷脂的作用方式也不同，根据其作用位点的差异(图1)可以将磷脂酶分为磷脂酶A₁、磷脂酶A₂、磷脂酶C和磷脂酶D四种，其中磷脂酶A₁和磷脂酶A₂能应用于植物油脱胶，它们能特异性的水解磷脂的1位或2位脂肪酸链^[7]，其中磷脂酶A₂必须以钙离子为激活剂，且来源有限，价格昂贵。因此，磷脂酶A₁日益受到研究者的关注，对磷 脂酶A₁应用于植物油脱胶的研究越来越深入^{[8, 9, 10, 11]}。传统的油脂精炼由于脱胶不完全导致精炼损失大，对设备影响也较大，且易造成成品油酸败和回色现象^[7]，而利用磷脂酶A₁的酶法脱胶反应条件温和，大大节约化学物质的消耗量，几乎不产生废水，在工业应用中具有潜在优势，但是磷脂酶A₁在天然材料中含量低以及其理化性质的缺陷无法完全满足生产的要求，因此获得高产量且适合工业生产应用的磷脂酶迫在眉睫。目前对于磷脂酶的研究，主要是通过筛选性能优良的磷脂酶产生菌，但是环境中的微生物大部分是不可培养的，大大限制了微生物磷脂酶资源的利用。

本研究通过宏基因组学的方法，利用功能筛选方法以三丁酸甘油脂为底物，从红树林这一特殊生境中筛选新型酯酶，而磷脂酶是酯酶的一种，也可以三丁酸甘油脂为底物，所以同时也可用于磷脂酶的筛选。本研究中筛选到的磷脂酶能水解三丁酸甘油脂且不需钙离子作激活剂，所以为磷脂酶A₁类。对筛选到的磷脂酶A₁进行酶学性质分析，为其工业化应用奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料

土样采自广东珠海琪澳岛沿海红树林，采集深度10-20 cm的表层土样，于-20 °C保存。Escherichia coli DH5α和原核表达载体pET-32a(+)由本实验室保存。载体pUC118/BamH I (BAP)、BamHⅠ、Hind Ⅲ、EcoRⅠ、PstⅠ、Prime STAR^TM Max Premix、Protein marker及DNA marker购自TaKaRa公司；氨苄青霉素(Amp)、X-gal (5-溴-4- 氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷)、IPTG (异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)购自Amresco公司；Plasmid Mini Kit、DNA Gel Extraction Kit购自OMGEA公司；三磷酸甘油酯(Tributyrin)购自阿拉丁；p-nitrophenyl acetate (C2)、p-Nitrophenyl butyrate (C4)、p-Nitrophenyl caproate (C6)、p-Nitrophenyl octanoate (C8)、p-Nitrophenyl caprate (C10)、p-Nitrophenyl laurate (C12)、p-Nitrophenyl myristate (C14)、p-Nitrophenyl palmitate (C16)、乙腈购自Sigma公司。

1.2 方法 1.2.1 提取环境样品宏基因组DNA：土壤宏基因组DNA的提取方法在Zhou等^[12]方法上加以改进。如增加一倍体积的DNA extraction buffer，减少土壤中腐植酸对DNA的吸附，促进DNA的溶解；70%乙醇洗涤DNA沉淀时，选用冰乙醇，低温促进DNA的沉淀，增加DNA的回收率。提取的基因组DNA用琼脂糖凝胶电泳检测并采用OMEGA公司Gel Extraction Kit，回收并纯化所提取的土壤基因组DNA。

1.2.2 红树林土壤宏基因组文库的构建：纯化后的基因组DNA用BamH I酶切5 h，回收2-8 kb的DNA片段。不完全酶切的基因组片段与载体pUC118/BamH I (BAP)采用Fermentas公司的T4 DNA ligase于22 °C连接2 h，连接产物纯化具体步骤如下：加入0.7倍体积异丙醇混匀后，-20 °C过夜沉淀，14 000 r/min离心20 min后弃上清，沉淀用80%的乙醇洗涤，离心收集管中沉淀，室温晾干后加入10 μl灭菌的超纯水重悬连接产物。将纯化好的连接产物用电击转化法转入E. coli DH5α超级感受态细胞中。E. coli DH5α超级感受态细胞的制备和电转的具体步骤参考分子克隆实验指南^[13]。取适量培养物涂布于蓝白斑筛选平板上(100 mg/l Amp、0.1 mmol/L IPTG和40 mg/l X-gal)，37 °C倒置培养过夜。

1.2.3 磷脂酶A₁基因的筛选：将白色克隆点板于以三丁酸甘油酯为底物、罗丹明B为背景染料的筛选(100 mg/L Amp、1% tributyrin、1% arabic gum)平板中，37 °C恒温培养2-3 d，观察克隆子周围有无透明圈。挑取有透明圈的克隆子，进行提质粒、酶切验证之后送Invitrogen公司序列测定。测序后序列进行生物信息学分析。

1.2.4 磷脂酶A₁基因的PCR扩增和纯化：按照磷脂酶基因phop1413的序列设计引物如下：phop1413-Fw：5′-CCGGAATTCATGAAAAAATCG AAACTGCATCTTCACCTGGCGG-3′ (下划线部分为EcoR I酶切位点)；phop1413-Rv：5′-CCCA AGCTTTCATGGCCAGACCCTGGAGGCCTTG-3′ (下划线部分为Hind Ⅲ酶切位点)。引物合成由Invitrogen公司完成。以含目的基因的质粒为模板，利用高保真酶Prime STAR^TM Max Premix进行PCR扩增。扩增后的PCR产物用OMEGA胶回收试剂盒纯化。

1.2.5 构建表达体系及重组菌株的表达：用EcoR I和Hind III对纯化后的PCR产物和pET-32a(+)分别进行双酶切，37 °C酶切10 h，用OMEGA胶回收试剂盒纯化酶切产物，采用T4 DNA ligase对经过双酶切并纯化后的pET-32a(+)载体及PCR产物进行连接，连接产物导入E. coli BL21感受态细胞中。E.coli BL21感受态细胞及转化具体步骤参考分子克隆实验指南^[13]。随机挑取转化子培养后，提取其质粒并双酶切验证。酶切结果表明，该基因已经成功构建表达载体。转化子于37 °C摇床中培养，当OD₆₀₀达0.8左右时，加入IPTG，使其终浓度为 1 mmol/L，30 °C诱导表达16 h。培养好的发酵液离心后收集菌体并超声破碎，并对发酵液上清、细胞破碎液进行SDS-PAGE电泳分析。后期粗酶液采用His·Bind^® Resin试剂盒对重组磷脂酶Phop1413进行纯化.

1.2.6 磷脂酶Phop1413底物特异性研究：在54 °C、pH 7.8条件下，取10 μl粗酶液在400 μl反应体系中：1 mmol/L底物，1%乙腈，40 mmol/L B-R酸缓冲液(pH 7.8)混匀后54 °C反应20 min，每个反应设置3个平行实验和1个空白对照实验。底物分别为p-nitrophenyl acetate (C2)，p-Nitrophenyl butyrate (C4)，p-Nitrophenyl caproate (C6)，p-Nitrophenyl octanoate (C8)，p-Nitrophenyl caprate (C10)，p-Nitrophenyl laurate (C12)，p-Nitrophenyl myristate (C14)，p-Nitrophenyl palmitate (C16)。测定磷脂酶水解不同底物的酶活力，探究其底物特异性。

1.2.7 温度对酶活力及酶稳定性的影响：pH 7.8时，测定在不同温度下(4、30、40、50、60 °C)磷脂酶A₁水解对硝基苯酚己酸酯的活力，再缩小温度区间(间隔2 °C)，逐步确定最适温度；在不同温度下分别温育15、30、45、60、120 min，以4 °C保存的酶液酶活为100%，计算残余酶活。

1.2.8 pH对酶活力及稳定性的影响：54 °C时，测定磷脂酶A₁在pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0时水解对硝基苯酚己酸酯的活力，再缩小pH区间，逐步确定最适pH；在不同pH时分别温育15、30、45、60、120 min，以4 °C保存的酶液酶活为100%，计算残余酶活。

1.2.9 磷脂酶酶活的测定：方法参加1.2.6。磷脂酶A₁酶活力(U)单位的定义：每分钟水解底物对硝基苯酚己酸酯生成1 μmol对硝基苯酚所需的酶量。计算公式为：酶活(U/ml)=ΔA₄₀₅×V×K×1 000/(T×ε)。其中，A：吸光度，V：反应液体积(ml)，K：酶液稀释倍数，T：反应时间(min)，ε=0.016 μmol/L。

1.2.10 目的蛋白浓度测定：采用BCA法测定蛋白质浓度，以牛血清白蛋白作为标准对照。标准曲线如图2所示，标准方程为y=0.034 7x+0.014 2，R²=0.992 0。

2 结果与分析 2.1 土壤总DNA的提取

获得高纯度、高浓度的基因组DNA是构建宏基因组文库的前提。本研究土壤基因组DNA提取结果如图3所示，提取的宏基因组DNA主要集中在23 kb以上，且较少降解，满足构建宏基因组文库的需要。

2.2 红树林土壤宏基因组文库的构建

不完全酶切后的基因组片段与pUC118载体相连后，采用电击方法转化入E. coli DH5α超级感受态中，蓝白斑平板显示转化情况良好，计算该文库约含50 000个阳性克隆子，文库含量较多，随机挑取20个阳性克隆子提质粒、BamH I酶切验证，电泳检测插入片段的大小及多样性。插入片段平均大小约3.5 kb，且文库基因片段的多样性较好，文库质量符合后期筛选要求。

2.3 磷脂酶基因的筛选

以1%三丁酸甘油酯为底物和罗丹明B为背景染料配制磷脂酶筛选培养基，对宏基因组文库进 初筛，筛选出一株有明显透明圈的克隆，初步确定其有水解活性。后期通过提质粒、酶切验证后送Invitrogen公司测序。

2.4 磷脂酶基因phop1413的序列分析

经NCBI中的ORF Finder进分析，插入片段中含有一个全长1 413 bp的磷脂酶基因，该基因命名为phop1413，已将其序列提交到GenBank获得登录号为KF767097。该基因可编码一个由470个氨基酸残基组成的、预计分子量为51.7 kD的磷脂酶蛋白。经NCBI的BLAST软件分析Phop1413与已报道的磷脂酶Pseudomonas (WP 018928790.1)，序列相似性最大为42% ，所以我们将其归为磷脂酶类。而采用MEGA软件对Phop1413与已知报道的酯水解酶类做进化关系分析，构建系统发育树(图4)，结果显示Phop1413属于fAMILY Ⅵ家族。

2.5 磷脂酶基因phop1413的克隆

以重组质粒pUC118-phop1413为模板，以phop1 545-Fw/phop1 545-Rv为引物扩增，得到一条明显的特异性DNA条带(图5)，片段大小在1 400 bp左右，与预期相符。

2.6 基因phop1413的表达

将重组质粒pET-32a(+)-phop1413转化至E. coli BL21感受态细胞，IPTG诱导后30 °C表达16 h，超声裂解菌体，SDS-PAGE电泳分析表达产物，如图6A所示。在65 kD处有明显的蛋白条带，与理论预测大小相符，说明phop1413基因正确表达。纯化后的SDS-PAGE电泳检测结果如图6B所示，为单一条带，分子量大小与预测相符。可见，该重组蛋白表达量较高，采用BCA法测得 蛋白表达量高达220 mg/L。

2.7 磷酯酶A₁ Phop1413的底物特异性

如表1所示，Phop1413对C2-C16的对硝基苯酚酯有不同的水解活性，其中对对硝基苯酚己酸酯(C6)活性最高，计算其比酶活为124 U/mg。该酶对C2-C16底物都具有水解活性，表明该重组酶水解底物范围较广，由于对C14仍具有较高活性，推测该磷脂酶也具有部分脂肪酶活性，更适合用于油脂精炼。

2.8 温度对酶活性的影响

从图7中可以看出，随着温度的升高，酶活性逐渐上升，且在54 °C时达到最大值，因此该重组蛋白的最适温度为54 °C，且温度在40-65 °C时，相对酶活性仍保持50%以上，说明该重组蛋白较耐高温。在40、45、50、60 °C温育不同时间，重组酶相对活力呈现下降趋势，50 °C温育1.5 h后残余酶活为44%，45 °C温育2.5 h后仍残余45.3%，表明该重组酶有较好的热稳定性。

2.9 pH对酶活力的影响

如图8所示，当pH小于5.5时，Phop1413的酶活性随着pH值的升高而增加；pH达到7.8时，酶活性最高；之后随着pH值的升高，酶活性逐渐降低，当pH为4.0或10.0时该酶几乎没有活性，pH为6.0时，温育2.5 h后仍残存50%以上酶活， pH为8.0时，温育1 h后，酶活仅剩16%，说明该重组酶对酸的耐受性比对碱的耐受性好。

3 讨论

新开发的脱胶工艺，主要是采用酸脱胶、化学添加剂络和法脱胶、酶法脱胶及超滤脱胶等方 法^[14]。酶法脱胶广泛应用于各种植物油，与其他脱胶方法相比，该法脱胶条件温和，营养成分不被破坏，而且节省能源，且由于酶专一性强，副反应少，产品容易回收^[15]，目前酶法脱胶技术已经引起了世界油脂工业界的高度重视。但是脱胶工业生产过程的高温、高压、高酸度以及重金属离子超标等造成的极端环境，使得野生的磷脂酶很难满足工业生产的需要^[16]。

长期生活在特定环境中的微生物具有特有的酶学特性，红树林是自然分布于热带、亚热带海岸的潮间带的木本植物群落，处于海洋与陆地的动态交界面，该地区的微生物由于长期处于湿热环境，环境中的土著菌及其酶类具有耐热等特质。本研究中的新型磷脂酶Phop1413的最适反应温度为54 °C，这比大多数已报道的磷脂酶最适温度都要高。如Gomes Heleno等^[17]所研究的磷脂酶最适温度为35-45 °C，Mo等^[18]研究的磷脂酶C最适温度为45 °C；该酶最适反应pH为7.8，与大多数已报道的磷脂酶相差不大；此外该酶较其他已报道的磷脂酶有更好的热稳定性以及在弱酸环境中稳定性更好的特性。但由于工业化油脂精炼生产中的极端环境，下一步我们将对该重组蛋白进行定向进化分子改造，以期获得对温度和pH耐受性更好的酶；其次通过固定化技术获 得性质更稳定的磷脂酶，从而为工业化应用奠定基础。