深海通常是指1 000 m以下的海洋，占地球海洋总体积的3/4，该海洋环境占地球生物圈的62%^[1]。自1977年美国“阿尔文”(Alvin)号载人深潜器在东太平洋加拉帕戈斯群岛附近的2 500 m深海断裂带发现第一个热液区生态系统以来，目前已有500多个类似的海底热泉生态系统被发现，主要集中在太平洋和大西洋，其中又以太平洋的发现点最多^[2]。深海热液区生态系统为原始不需氧的化学自养系统^[3]，化学自养微生物等是该生态系统的初级生产者，通过氧化氢气、还原硫化物、CO等获得能量从而固定CO₂，合成有机物^[4]。超嗜热微生物是该生态系统的重要组成部分，发挥着十分重要的作用。

超嗜热微生物是指最适生长温度大于80 °C的微生物^[5]。尽管其在低于50 °C的环境下不能繁殖，但却能在环境温度和外太空温度(−140 °C)存活多年^[6]。在Woese的有根系统进化树中，超嗜热微生物只在古菌域和细菌域中发现，且绝大多数属于古菌。1969年Thomas Brock从美国黄石国家公园分离到第一株严格意义的高温菌——水生栖热菌(Thermus aquaticus)以来，每年都有大量的高温菌被分离和描述，人们对生命生长的温度上限也在不断刷新。Pyrolobus fumarii的最适生长温度为106 °C，低于90 °C不能生长，其生长温度上限可达113 °C，且在121 °C可存活1 h^[7]。另一株Fe(III)还原菌strain 121的生长温度范围为85−121 °C，当温度低于85 °C时细胞分裂停止，其在121 °C的代时是24 h^[8]。进化地位越低，生长温度越高，这些位于系统进化树基部的超嗜热菌，分支短，进化缓慢，而且其所生存的热液区等环境与生命形成初期环境相似，因此有人认为生命起源于高温菌，它们成为了探索生命起源和进化的焦点。

高温的生长环境使超嗜热微生物编码的蛋白往往也具有一定的特殊性，其生物酶的最适反应温度一般在70 °C以上，热稳定性高，pH适应范围较大，并且对一些酶抑制剂具有显著的拮抗作用。这些特性使其能降低污染概率、降低反应体系粘度、提高转化率和产物可溶性，是工业生物转化中的理想催化剂^[9]。如，绝大多数已知的嗜热和超嗜热厌氧菌均能发酵糖类产生乙醇，生产成本低且高温有利于乙醇挥发回收，可用于生产生物能源。嗜热微生物还具有较强的生物降解能力，尤其是对一些难降解的有机物，如多环芳烃(PAHs)^[10]。此外，在石油开采，生物冶金等方面嗜热微生物也具有巨大的应用潜力^[11]。

本研究从大西洋脊热液区(14.51°W，13.60°S)培养分离得到一株超嗜热厌氧古菌Thermococcus sp. TVG2，进一步对该菌株进行形态、生理生化特征等方面的分析，并通过分子生物学手段对其进行了初步鉴定，为进一步研究深海热液区极端嗜热厌氧古菌并从中开发利用新型工业酶等奠定基础。

1 材料与方法 1.1 样品

深海热液区样品TVG2、TVG8、TVG12和TVG13采集自2012年中国大洋科学考察26航次第三航段(14.51°W，13.60°S)。

1.2 培养基和主要试剂 1.2.1 培养基：YTSV培养基^[12]微量元素溶液A 10 mL，微量元素溶液B 1 mL，(NH₄)₂SO₄-KH₂PO₄溶液10 mL，FeEDTA溶液2 mL，维生素混合液1 mL，Resazurin 1.00 mg，Cysteine-HCl·H₂O 0.25 g，Na₂S·9H₂O 0.25 g，酵母提取物1.00 g，胰蛋白胨 1.00 g，元素硫5.00 g，人工海水定容至1 L，pH 6.5。

人工海水(g/L)：NaCl 19.60，Na₂SO₄ 3.30，KCl 0.50，KBr 0.05，H₃BO₃ 0.02，MgCl₂·6H₂O 8.80。

微量元素溶液A (g/L)：CuSO₄·6H₂O 0.01，ZnSO₄·7H₂O 0.10，CoCl₂·6H₂O 5.00 mg，MgCl₂·4H₂O0.20，Na₂MoO₄·2H₂O 0.10，KBr 0.05，KI 0.05，H₃BO₃ 0.10，LiCl 0.05，Al₂(SO₄)₃ 0.05，NiCl₂·6H₂O 0.01。

微量元素溶液B (g/L)：VoSO₄·xH₂O 0.05，H₂WO₄ 0.05，Na₂SeO₃ 0.05，NiCl₂·6H₂O 0.05，SrCl₂·6H₂O 0.05，BaCl₂ 0.05。

(NH₄)₂SO₄-KH₂PO₄溶液(g/L)：(NH₄)₂SO₄ 43.0， KH₂PO₄ 3.6。

FeEDTA溶液(g/L)：FeSO₄·7H₂O 1.54，Na₂EDTA 2.06。

维生素混合液(mg/L)：Niacin 10.0，Biotin 4.0，Pantothenate 10.0，Lipoic acid 10.0，Folic acid 4.0，p-Aminobenzoic acid 10.0，Thiamine (B₁) 10.0，Riboflavin (B₂) 10.0，Pyridoxine (B₆) 10.0，Cobalamin (B₁₂) 10.0。

将YTSV培养基分装于血清瓶中，用高纯氮除尽血清瓶中的空气，盖上橡胶塞，并用铝盖进行密封。培养基在1×10⁵ Pa灭菌20 min，使用前加入过滤除菌的维生素混合液。

1.2.2 主要试剂：dNTPs、rTaq DNA聚合酶、Loading buffer、DNA标准分子质量、蛋白酶K和RNase A等购自宝成生物工程有限公司；酵母提取物、胰蛋白胨等购自Oxoid公司；Lysozyme购自生工生物工程(上海)股份有限公司；QIAquick PCR Purification Kit (50)试剂盒购自QIAGEN公司；Tris、EDTA、元素硫、NaCl、Na₂SO₄和MgCl₂·6H₂O等无机盐类均为国产分析纯试剂。

1.3 菌株富集及分离培养 1.3.1 富集培养：分别配制pH为6.0、7.0和8.0的YTSV培养基。在厌氧操作箱中将TVG2、TVG8、TVG12和TVG13四种样品按体积比1:100接入上述各培养基中，分别置于60、65、70、75和80 °C恒温培养箱中进行富集培养。

1.3.2 分离培养：用减绝稀释法对TVG2富集培养物进行分离纯化，即以10⁻²为稀释梯度设置10⁻²、10⁻⁴和10⁻⁶三个梯度，按1%接种量用注射器吸取富集培养物接入新鲜培养基中，在80 °C静置培养3 d，记为一代。之后取10⁻⁶稀释培养物继续进行上述稀释培养，依次推之。

纯化获得的菌株TVG2混匀于终浓度为25%的厌氧灭菌甘油中，保存在−80 °C。

1.4 菌株特征分析 1.4.1 菌株形态学特征：光学显微镜观察：用注射器抽取少量菌液，涂布于洁净干燥的载玻片上，自然干燥后，将载玻片迅速通过酒精灯外焰2−3次以固定菌体，对其进行革兰氏染色后置于光学显微镜下观察。

透射电子显微镜观察：抽取培养24 h的菌液20 mL，8 000 r/min离心5 min，弃上清；然后用5 mL新鲜YTSV培养基重悬菌体沉淀，6 000 r/min离心3 min，弃上清；再用1 mL新鲜YTSV培养基重悬菌体沉淀并将其转移至1.5 mL离心管中，10 000 r/min离心1.5 min，弃上清，重复此操作2−3次；用1 mL人工海水重悬菌体沉淀，10 000 r/min离心1 min，弃上清，重复此操作1次；用1 mL 2%生理盐水重悬菌体沉淀，13 000 r/min离心30 s，快速弃上清，并用滤纸条吸干离心管中残留的液体，风干2 min。用无 菌 牙签蘸取适量的菌体以磷钨酸(EPA)溶液染色后置于铜网上，在透射电子显微镜下观察。

1.4.2 菌株生长特性和生理生化特性分析：参照文献^[13]的方法进行菌株生长和生理生化特性分析。

按1%接种量取1 mL 82 °C (温度测定实验除外)恒温静置培养24 h的TVG2菌液接种于新鲜YTSV培养基中，按设定条件培养后取0.5 mL菌液在600 nm处测定OD₆₀₀，测定3组数据求平均值及标准差，无特别说明均以 0 h菌液为空白对照。

生长温度范围测定：按1%接种量取1 mL 80 °C恒温静置培养24 h的TVG2菌液接种于新鲜YTSV培养基中，温度范围设置为40−90 °C，以10 °C为梯度递增；在80−90 °C间以2 °C为梯度递增。将接种后的培养瓶置于以上各温度静置培养24 h。

生长曲线测定：按1%接种量取1 mL菌液接种于新鲜YTSV培养基中，82 °C恒温静置培养，每隔4 h取0.5 mL菌液在600 nm处测定OD₆₀₀，以未接种82 °C恒温静置的YTSV培养基为空白对照。

生长pH范围测定：将培养基pH范围设置为5.0−9.0，5.0−6.0和8.0−9.0间按1.0递增设置；6.0−8.0间按0.5梯度递增。按1%接种量取1 mL菌液接种于上述培养基中，82 °C恒温静置培养24 h，取0.5 mL菌液在600 nm处测定OD₆₀₀。

NaCl浓度范围测定：将培养基NaCl浓度范围设置为0.5%−4.0% (质量体积比)，以0.5%为梯度递增。按1%接种量取1 mL菌液接种于上述培养基中，82 °C恒温静置培养24 h，取0.5 mL菌液在600 nm处测定OD₆₀₀。

生长影响因素测定：分别配制下列培养基：YTSV、不含元素硫的YTSV [YTSV (S-)]、添加0.1% (质量体积比)丙酮酸钠的YTSV [YTSV (Sodium pyruvate)]和添加0.1% (质量体积比)葡萄糖的YTSV [YTSV (Glucose)]。按1%接种量取1 mL菌液接种于上述培养基中，82 °C恒温静置培养24 h，取0.5 mL菌液在600 nm处测定OD₆₀₀，以0 h菌液为空白对照。

所有实验均做3个重复，数据均用平均数±标准差表示，显著性用双尾t检验计算。

1.5 菌株的分类鉴定 1.5.1 菌株基因组提取：培养100 mL的TVG2培养物至饱和状态，8 000 r/min离心5 min，小心倒去上清；向沉淀物中加入567 μL的ELB缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；20 mmol/L EDTA；1.2% Triton X-100；Lysozyme 5 (g/L)使之充分重悬，置于37 °C水浴中温育1−2 h；加入30 μL 10% SDS和25 μL 20 g/L的蛋白酶K，颠倒混匀，置于55 °C水浴中温育3 h；加入100 μL 5 mol/L NaCl，充分混匀，再加入80 μL CTAB/NaCl溶液(NaCl 41 g/L，CTAB 100 g/L)，轻轻颠倒混匀，于65 °C水浴中温育10 min；加入5 μL RNase A，轻轻颠倒混匀，于37 °C水浴中温育10−30 min；加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1，体积比)，轻轻颠倒混匀，13 000 r/min、4 °C离心10 min，小心吸取上清并将其转入新离心管中(如果难以移出上清，可先用无菌牙签去除界面物质，或重复多次此操作至界面澄清)；加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1，体积比)，轻轻颠倒混匀，13 000 r/min、 4 °C离心10 min，小心吸取上清并转入新离心管中；加入2倍体积−20 °C预冷的无水乙醇和1/10体积 3 mol/L醋酸钾溶液(pH 8.0)，轻轻颠倒混匀，−20 °C放置2 h以上至DNA充分沉淀下来；13 000 r/min、4 °C离心20 min，小心弃上清；沿离心管壁小心向沉淀中加入1 mL −20 °C预冷的70%乙醇洗涤沉淀，13 000 r/min、4 °C离心5 min，小心弃上清，重复此操作一次；静置3−5 min使沉淀挥发残留乙醇，稍加风干，将DNA沉淀溶于适量无菌双蒸水中并于−20 °C保存。用Nanodrop 2000测定基因组DNA溶液浓度，并取200 ng左右DNA进行琼脂糖胶电泳。

1.5.2 16S rRNA基因序列分析：根据文献^[14]报道，合成16S rRNA基因引物ARCH 16S forward (5′-ATTCCGGTTGATCCTGCCGG-3′)，ARCH 16S reverse (5′-AGGAGGTGATCGAGCCGTAGGTTC-3′)。配制50 μL PCR反应体系：10xbuffer 5 μL，2.5 mmol/LdNTPs 4 μL，20 μmol/L ARCH 16S forward 1 μL，20 μmol/L ARCH 16S reverse 1 μL，rTaq DNA聚合酶0.25 μL，TVG2基因组DNA (200 mg/l) 0.5 μL，无菌双蒸水补齐至50 μL。PCR反应条件：94 °C 3 min；94 °C 30 s，56 °C 30 s，72 °C 1.5 min，30个循环；72 °C 10 min。

PCR产物用QIAquick PCR Purification Kit (50)试剂盒纯化回收后由上海英潍捷基贸易有限公司测序。将所测得的16S rRNA基因序列与NCBI数据库中的已有序列进行Blastn分析。根据分析结果从NCBI数据库中选取近缘菌株的16S rRNA基因序列，并由ClustalW^[15]进行比对，随后利用软件MEGA 5.0的邻接法(Neighbour-Joining method)^[16]对各16S rRNA基因序列构建系统进化树，以确定该菌株的分类地位。

2 结果与分析 2.1 菌株富集分离

用YTSV培养基对深海热液区样品TVG2、TVG8、TVG12和TVG13分别进行富集培养。其中TVG12的富集培养物生物量低，未获得有效基因组DNA；通过16S rRNA基因测序分析，TVG8富集的微生物与Sphingomonas sp.、Janibacter sp.和Knoellia sp.亲缘性最高(97%−99%)，TVG13富集的微生物与Ralstoniasp.亲缘关系最近(99%−100%)。TVG8和TVG13所富集的微生物均与嗜中温细菌相似性较高，因此未继续进行分离纯化。

TVG2样品在YTSV培养基中富集效果较好，80 °C培养2−3 d后培养瓶中出现大量气泡，初步的16S rRNA基因测序分析表明其富集的微生物与Thermococcus sp.和Pyrococcus sp.的亲缘性最高(96%−99%)。用减绝稀释法对TVG2富集培养物进行进一步的分离纯化，通过 25代的稀释分离培养，最终获得了纯化的单一菌株TVG2。

菌株TVG2在培养过程中可观察到在元素硫附近产生大量的气泡，并且培养瓶内气压增大，瓶盖开启后伴随有浓烈的臭鸡蛋味，表明菌株在含元素硫的YTSV培养基中可还原元素硫产生大量硫化氢。

2.2 菌株形态特征

用注射器抽取少量TVG2菌液做革兰氏染色，置于倒置显微镜下观察。结果表明菌株TVG2革兰氏染色呈阳性，菌体形态大小均一，多成对出现(图1A)。进一步在透射电子显微镜下观察，TVG2菌体为球状，直径约1 μm，无鞭毛(图1B)。

2.3 菌株的分类鉴定

结合PCR扩增和测序，获得了菌株TVG2的16S rRNA基因序列，长度为1 343 bp。将菌株TVG2的16S rRNA基因序列提交NCBI数据库获取GenBank的登录号为KM 434133。通过16S rRNA基因序列相似性比较得出其与Thermococcus sibiricus strain MM739 (NR 102888)亲缘关系最近，相似性达99%。因此，可初步确认该菌为热球菌属(Thermococcus)。为分析菌株TVG2与近缘菌株的进化关系，根据blastn比较结果从NCBI数据库中选取近缘菌株的16S rRNA基因序列，并由ClustalW进行比对，随后利用软件MEGA 5.0的邻接法(Neighbour-Joining method)对各16S rRNA基因序列构建系统进化树，同源关系的可靠性由自举值(Bootstrap=1 000)进行评估(图2)。系统进化树进一步证明菌株TVG2属于热球菌属，因此命为Thermococcus sp. TVG2。

2.4 菌株的生理生化特性

2.4.1 生长特性：为了了解菌株T. sp. TVG2的生长特性，测定了温度、生长曲线、pH和NaCl质量浓度等对该菌株生长的影响。结果表明T. sp. TVG2可在50−88 °C范围内生长，其最适生长温度为82 °C，该温度曲线呈典型的“钟罩形”；低于50 °C不能生长，在50−70 °C范围内菌体的细胞分裂活动弱，生物量较低(图3A)。

在此基础上，测定了T. sp. TVG2在最适生长温度82 °C下的生长曲线。在经历4 h的延滞期后，该菌进入对数生长期，约在20 h菌体浓度达到最高值。在测定过程中未出现较为明显的平台期，且衰退期出现较迟，在培养32 h后仍有较高的菌体浓度(图3B)。

T. sp. TVG2生长的pH范围为5.0−9.0，最适生长pH为6.5，但在碱性环境也能较好生长，在pH 7.0−9.0范围内菌体浓度变化不明显，因此该菌株可能存在耐碱机制(图3C)。

鉴于该菌分离自深海环境，分析NaCl质量浓度对其生长的影响。结果发现适合菌株生长的NaCl质量浓度为1.0%−4.0%，最适生长的NaCl质量浓度为2.5%。当生长环境中NaCl质量浓度低于1.5%或高于3.5%时，T. sp. TVG2不能良好生长繁殖，结果表明NaCl质量浓度对菌株的生存和生长影响重大(图3D)。

2.4.2 生长影响因子：深海热液区尤其是“黑烟囱”附近，有丰富的硫化物沉积，大量文献报告指出厌氧嗜热菌的生长代谢与硫有关。因此，探讨了元素硫对T. sp. TVG2生长的影响。在不含元素硫的YTSV (S-)培养基中该菌株生长缓慢，无硫化氢气泡产生，且培养液浊度低，菌体浓度低；而在培养基中添加元素硫可促使菌株快速生长，生物量显著增加，表明T. sp. TVG2生长为非硫必需型，但元素硫可刺激其生长(图4A)。

大多数Thermococcus属成员为异养营养型，有研究报道添加葡萄糖和丙酮酸钠可以促进该属菌株生长。通过实验，发现T. sp. TVG2不能利用葡萄糖和丙酮酸钠作为唯一碳源进行生长(结果未列出)。将T. sp. TVG2菌液分别接种在含0.1%葡萄糖的YTSV (Glucose)和0.1%丙酮酸钠的YTSV (Sodium pyruvate)培养基中，结果表明丙酮酸钠能显著促进菌株生长，而菌株在添加葡萄糖的培养基生长水平明显较低(图4B)。这一结果说明该菌株可能存在丙酮酸盐相关代谢途径，而葡萄糖对其有生长抑制作用。

3 讨论

深海热液区自发现以来就有大量的嗜热和超嗜热微生物随之出现在研究者们的视野中，并成为研究热点^[17]。深海热液生态系统具有高温、高静水压、黑暗、剧变的理化梯度及广泛的化能合成作用等特征，其热液流富含重金属、甲烷和硫化氢等生命体有毒物质，且呈酸性、高还原态。热球菌目(Thermococcales)是该恶劣生态系统中原核生物的主流群体。目前为止，在已分离的超嗜热古菌中，热球菌目(Thermococcales)所占比例最大，共有 43个种，其中热球菌属(Thermococcus) 34个、火球菌属(Pyrococcus) 6个、古老球菌属(Palaeococcus) 3个^{[18, 19]}。绝大多数Thermococcales为严格厌氧异养营养型，它们通过发酵有机物获取能量，常分离自海洋高温含硫环境。Thermococcus是已分离的Thermocaccales的主体，多分离自深海或浅海热液区、地底深部生物圈，也有来自陆地热泉(如T. zilligi)和近岸及陆地高温油井(如T. sibiricus)^[20]。其中T. onnurineus和T. sp. AM4能以CO为底物行自养营养^[19]。通常，元素硫有利于Thermococcales生长但非必需，但T. thioreducens为严格的硫还原菌，必须以元素硫为电子受体。大多数Thermococcus为硫还原型，而T. sp. T642则以Fe(III)为电子受体进行异化还原^[21]。Palaeococcus属有3种，其中 P. ferrophilus^{[ 22]}和P. pacificus^[23]均为超嗜热厌氧嗜压古菌(最适生长压力为30 MPa)，前者以元素硫或二价铁离子作电子受体，后者兼性利用元素硫或硫酸盐作电子受体。另外，P. helgesonii^[24]为超嗜热兼性厌氧古菌，依赖元素硫，在厌氧及微氧环境均能良好生长。Pyrococcus为超嗜热嗜压厌氧古菌，目前只从海洋热液区分离获得，其最适生长温度为95−100 °C，比Thermococcus高(80−90 °C)^[25]。Thermococcales因其分布广泛，生长迅速，因此在环境中占据主导地位。

从大西洋脊热液区采集获得TVG2、TVG8、TVG12和TVG13 四份样品，采用YTBC、2216E、MJYPS和YTSV培养基在60−80 °C温度范围进行富集培养。除样品TVG2富集培养物1 6S rRNA基因测序结果与古菌相似性较高外，其他样品均未获得有效富集培养物：其中TVG12的4种富集培养物生物量较低，无法获得有效基因组DNA；TVG8和TVG13所富集的微生物与Sphingomonas sp.、Janibacter sp.、Knoellia sp.和Ralstonia</ i>sp.等嗜中温细菌相似性较高，因此未继续进行分离纯化。最终通过减绝稀释法分离得到了一株厌氧超嗜热古菌。通过倒置显微镜和透射电镜的观察，结果均显示该菌株形态一致，对其第25代分离纯化培养物的DGGE检测也表明，所分离菌株为单一菌株(结果未列出)。

通过16S rRNA基因的测序与比较分析，初步鉴定菌株TVG2属于热球菌属(Thermococcus)。系统进化树表明T. sp. TVG2与T. Sibiricus处于同一分支，其亲缘关系最近，相似性高达99%。热球菌属(Thermococcus)菌株的细胞为球形，有或无鞭毛，最适生长温度在80−90 °C，且大多数在pH 6 .0−7 .0中性偏酸环境生长良好，只有T. alcaliphilus和T. acidoaminovorans 的最适生长pH 9.0^[25]。多数成员为严格厌氧有机异养营养型，以有机复合物如蛋白胨、酵母提取物为底物，也有发酵糖和氨基酸等简单有机物获取能量，以元素硫或质子作为最终电子受体^{[20, 26]}。以所构建的系统进化树为基础，对T. sp. TVG2与近缘的T. sibiricus和T. barophilus^[27]，以及亲缘关系较远的T. kodakaraensis KOD1^[28]和T. hyperthermalis^[29]分别进行比较(表1)。T. sp. TVG2

在形态上具有热球菌属(Thermococcus)菌株的一些共性特征：细胞呈球形，无鞭毛，成对或单个存在。在生长温度、pH、NaCl浓度范围等生理生化方面，与参与比较的4个菌株比较相似。这一结果进一步说明T. sp. TVG2属于热球菌属(Thermococcus)。

16S rRNA基因序列是传统菌种鉴定的常用指标，但随着微生物分类鉴定手段的丰富，一些16S rRNA基因序列同源性很高的微生物也可能是不同的种。如T. nautili 与T. sp. AM4和T. gammatolerans的16S rRNA基因序列相似性分别为99.3%和99.2%，而通过生物信息学手段分析得出T. Nautili与二者的DNA-DNA杂交数值均低于70%，分别为33%和32%，即T. Nautili为Thermococcus家族新成员^[19]。进一步对T. sp. TVG2与16S rRNA基因序列相似性最高的T. sibiricus进行了比较分析。T. sp. TVG2较后者生长温度范围窄，但最适生长温度高于后者；最适生长pH比后者低；T. Sibiricus生长的NaCl质量分数范围为0.5%−7.0%，在低于0.2%或高于7.5%的环境中不生长，而当NaCl质量分数低于1.0%时T. sp. TVG2细胞溶胀破裂，高于3.5%时其生物量极低(表1)。另外，T. Sibiricus可利用蛋白胨、酵母提取物和牛肉膏，不能利用淀粉、葡萄糖和丙酮酸盐等生长^[20]，T. sp. TVG2虽然不能利用牛肉膏，但可利用淀粉、蔗糖等进行生长。综合以上，尽管T. sp. TVG2与T. sibiricus在16S rRNA基因序列的同源性很高，但其生理生化特性存在着显著的区别，这说明了T. sp. TVG2可能为新种。

热球菌目(Thermococcales)主要包括一些严格厌氧并严格依赖元素硫生长的超嗜热古菌，但Pyrococcus和Thermococcus这两个属的菌株在缺失元素硫的环境中也能生长。通过实验同样发现元素硫能显著促进T. sp. TVG2生长，但非生长所必需。嗜热厌氧古菌通常以H₂、元素硫等还原态物质作为最终电子受体而获取能量，添加元素硫无异于增加了培养环境中的电子受体，使T. sp. TVG2更易获取生长所需的能量，实现快速生长。

在90 °C及以上的海洋环境中，如深海热液区，严格厌氧、异养营养型和还原元素硫是主流代谢途径，且几乎所有的超嗜热微生物都以有机复合物作为碳氮源^[12]。王淑军等的研究同样也指出添加葡萄糖和丙酮酸钠均能刺激深海热液区来源的超嗜热古菌HJ21生长^[30]。但通过实验表明，T. sp. TVG2均不能以葡萄糖和丙酮酸盐作为唯一碳源，但额外添加丙酮酸钠则能显著促进T. sp. TVG2的生长，而添加葡萄糖对T. sp. TVG2的生长却具有一定的抑制作用。Smith等的研究曾指出超嗜热菌中普遍存在丙酮酸在铁氧还蛋白还原酶的作用下氧化脱羧生成乙酰-CoA、CO₂和H₂的代谢途径^[31]。在超嗜热古菌T. kodakaraensis KOD1中除存在上述途径外，还在丙氨酸转氨酶作用下以谷氨酸提供的氨基生成丙氨酸。此外，该菌还有独特的丙酮酸-甲酸裂合酶基因，其编码的丙酮酸-甲酸裂合酶能使丙酮酸裂解为乙酰-CoA和甲酸，这一丙酮酸氧化途径为菌体适应胞外环境改变提供充足的碳源和能量代谢^[32]。我们的研究结果表明T. sp. TVG2可能存在丙酮酸盐相关代谢途径，这将为进一步研究T. sp. TVG2的代谢机制和环境适应性提供理论依据。

综上所述，我们通过减绝稀释法培养分离获得了一株超嗜热厌氧古菌，通过形态学和分子生物学分析，初步鉴定其属于热球菌属(Thermococcus)，并命名为Thermococcussp.TVG2。通过对该菌株生理生化特性及生长影响因素的测定，表明T. sp. TVG2具有典型的热球菌生物学特性。该菌株的分离将为研究深海热液区嗜热古菌及开发新型工业酶奠定基础。