乳酸是三大有机酸之一，被广泛应用在食品、医药、化妆品及化工产业^[1]。乳酸未来最广泛的工业用途是用于生产生物可降解材料聚乳酸(PLA)，聚乳酸由于其良好的材料性能和可降解性，被认为是最可能替代石化塑料的生物可降解塑料^[2]。乳酸单体有两种同分异构体，即D-乳酸和L-乳酸，他们分别由丙酮酸在NAD依赖型D-乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.28)和L-乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.27)的作用下还原产生的^{[3, 4]}。研究表明，在聚L-乳酸中添加等量的聚D-乳酸可以显著提高聚乳酸材料的耐温性。因此，随着聚乳酸产业的不断发展，D-乳酸单体生产受到越来越多的关注。

L-乳酸由于其在食品和工业上有非常广泛的应用空间，发展历史较长，工业化微生物发酵法生产L-乳酸已经很成熟。L-乳酸的发酵温度一般在40 °C以上^{[5, 6]}，近期报道的一些耐热菌种，如凝结芽孢杆菌，最佳的发酵温度在50−55 °C，并产高光学纯度的L-乳酸^[7]。由于该菌株的耐热性，可以满足粗放的不灭菌高温发酵工艺，因此在工业生产上具有很大的优势。与成熟的L-乳酸发酵工艺不同，目前国内还未有D-乳酸的生产线。其原因一方面受到D-乳酸的市场所限；另一方面，目前D-乳酸发酵菌种均不耐热，发酵温度在40 °C以下，因此在工业生产中需要将培养基灭菌；另一方面，由于是常温发酵，操作过程中极易染杂菌从而降低光学纯度和转化率，对发酵过程的操作要求较为严格，这就间接提高了D-乳酸的生产成本。

目前报道比较多的D-乳酸发酵菌株为德氏乳杆菌，该菌株可以产较高光学纯度的D-乳酸，但其最佳的发酵温度为37 °C。当培养温度达到40 °C左右时，D-乳酸的产率显著降低。同时，随着对乳酸脱氢酶的研究不断深入，发现即便在同一个菌体里，D-乳酸脱氢酶的热稳定性要明显低于L-乳酸脱氢酶^[8]。目前报道的L-乳酸的热稳定性普遍在50 °C以上，而热稳定性好的D-乳酸脱氢酶很少有报道，D-乳酸脱氢酶在45 °C以上的酶活损失很快^[9]。因此，推测D-乳酸脱氢酶热稳定性较差可能是限制菌种具有高温D-乳酸发酵能力的重要原因。为了提高D-乳酸发酵的经济性，开发耐热的发酵菌种和开放式发酵工艺是未来的技术方向。D-乳酸生产的最关键酶——目前报道的D-乳酸脱氢酶不耐热的性状严重制约了高温工程菌株的构建。因此找到或设计出耐高温的D-乳酸脱氢酶将是构建D-乳酸高温发酵菌株的关键步骤。

在20世纪70年代，有研究者报道，在测定詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)的粗酶液酶活时，发现存在耐温的D-乳酸脱氢酶酶活，对该酶进行了初步的纯化，但是其基因信息未知^[9]。近年来，随着基因组测序技术的不断发展，越来越多的新酶资源从海量的基因组数据中被发掘出来。本研究中，我们根据最近公布的全基因组序列，在詹氏乳杆菌的基因组中注释获得一个D-乳酸脱氢酶，并对其进行了克隆纯化。与来自植物乳杆菌中的常温D-乳酸脱氢酶的酶学相比较，发现来自詹氏乳杆菌中的D-乳酸脱氢酶具有较好的耐温特性，并且催化活力更高，为下一步进行D-乳酸高温发酵菌株的构建提供了非常好的元件。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株和质粒：詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii DSM 20557)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum subsp. plantarum DSM 20174)购自德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,DSMZ)；用于酶的克隆表达菌株E.coli DH5α和E. coli BL21(DE3)购自天根生化科技(北京)有限公司；质粒pETDuet-1本实验室保藏。

1.1.2 主要试剂：细菌基因组DNA提取试剂盒、DNA快速回收纯化试剂盒、胶回收试剂盒购自OMEGA公司；Ex Taq DNA聚合酶及限制性内切酶Hind III和Xho I均购自TaKaRa公司。

1.2 方法 1.2.1 引物设计：詹氏乳杆菌DSM20557是已报道过的含有最耐热的D-乳酸脱氢酶基因^[9]，但是由于其没有基因测序信息，无法查到其D-乳酸脱氢酶基因。因此根据最新詹氏乳杆菌269-3的基因组测序信息(GenBank登录号：ACOY00000000)，设计了其D-乳酸脱氢酶基因引物。上游引物序列为：5′-CCCAAGCTTATGACAAAGATTTTTGC-3′，下游引物序列为：5′-TATCTCGAGTTAACCTAACTT AACTGG-3′，扩增的基因含有终止密码子，表达的蛋白在N端有His-tag标签。同时根据公布的植物乳杆菌DSM20174 (ACGZ02000000)的基因组信息(GenBank登录号：ACGZ02000000)，设计了其D-乳酸脱氢酶基因(ldhD)引物。上游引物序列为：5′-CGCAAGCTTATGAAAATTATTGCATATGC-3′，下游引物序列为：5′-TATCTCGAGGTCAAACTTAA CTTGTGTGT-3′ (北京睿博兴科生物技术有限公司合成)，均分别引入了Hind III和Xho I两个酶切位点(下划线)。为保持与参考文献^[3]一致，扩增的来自植物乳杆菌的D-乳酸脱氢酶基因不含终止密码子，表达的蛋白除了在N端含有His-tag标签外，同时在C端含有S-tag的标签。

1.2.2 重组质粒的构建：詹氏乳杆菌和植物乳杆菌基因组DNA的提取按照试剂盒说明书操作。经过PCR扩增分别得到两株菌的ldhD。将扩增后的目的片段和pETDuet-1使用相应的限制性内切酶酶切后，用T4 DNA连接酶进行连接，转化至E. coli BL21(DE3)中，分别得到携带pETDuet-ldhD20557和pETDuet-ldhD20174质粒的E. coli BL21(DE3)重组菌株。挑取单菌落经菌落PCR及提取质粒双酶切验证后送去北京睿博兴科生物技术有限公司测序。

1.2.3 重组蛋白D-乳酸脱氢酶的表达与纯化：分别挑取携带pETDuet-ldhD20557和pETDuet-ldhD20174质粒的E. coli BL21(DE3)单菌落，至5 mL LB液体培养基中(蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，氨苄青霉素100 mg/L)，过夜培养。以1%的接种量转接到200 mL LB新鲜培养基中，37 °C培养直至OD₆₀₀达到0.6左右，加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG，转到18 °C过夜诱导。

13 000×g、4 °C离心10 min收集E. coli BL21(DE3)菌体细胞，重悬于结合液中(20 mmol/L pH 7.9 Tris，10 mmol/L咪唑，0.5 mol/L NaCl)，加入100 μL 20 g/L的溶菌酶，混匀冰上静置30 min，超声破碎细胞，12 000 r/min、4 °C离心10 min，上清液过膜(0.45 μm)后利用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒进行纯化，利用4 mmol/L pH 7.9 Tris，60 mmol/L咪唑，0.1 mol/L NaCl的洗脱液进行杂蛋白的洗脱，利用10 mmol/L pH 7.9 Tris，300 mmol/L咪唑，0.25 mol/L NaCl的洗脱液进行目的蛋白的洗脱，SDS-PAGE检测目的条带，超滤柱脱盐浓缩后，−80 °C保藏。

1.2.4 D-乳酸脱氢酶活力测定：D-乳酸脱氢酶能催化丙酮酸与还原型辅酶Ⅰ(还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，NADH)反应生成D-乳酸与氧化态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)，通过测定NADH的变化可以表征酶反应的快慢^[10]。

NADH在340 nm有最大吸光度，纯化的D-乳酸脱氢酶活力通过酶标仪检测NADH在340 nm吸光度的减少量，通过标准曲线可以计算出D-乳酸脱氢酶的酶活。具体测定体系(200 μL)：pH 7.0磷酸缓冲液100 mmol/L；丙酮酸20 mmol/L；NADH 0.2 mmol/L；酶液适量；检测OD₃₄₀的变化。1个酶活单位(1 U)定义为每分钟内氧化1 μmol NADH所需要的酶量。

1.2.5 D-乳酸脱氢酶产物光学纯度的测定：根据文献^[11]利用高效液相手性柱检测来自两种菌的酶促反应产物的光学纯度，看是否只产生D-乳酸，同时将来自詹氏乳杆菌的D-乳酸脱氢酶分别放置在不同温度下(35、45、55 °C)进行反应，观察温度对D-乳酸脱氢酶的立体选择性的影响。其流动相是 2 mmol/L的硫酸铜溶液，柱温是25 °C，检测波长为254 nm，流速为0.5 mL/min，进样5 μL。根据标品确定反应产物的纯度。

1.2.6 D-乳酸脱氢酶的最适反应温度：在0.1 mol/L pH 7.0磷酸缓冲液中，加入底物丙酮酸20 mmol/L，辅酶NADH 0.2 mmol/L。在不同温度下反应，酶标仪测其反应速度，以最高的反应速度作为100%反应活力，得到其他的相对活力，100%反应活力对应的温度即是最适温度。

1.2.7 D-乳酸脱氢酶最适pH的筛选：在不同pH的0.1 mol/L磷酸缓冲液中，加入底物丙酮酸 20 mmol/L，辅酶NADH 0.2 mmol/L，37 °C反应，酶标仪测其反应速度，以最高的反应速度作为100%反应活力，得到其他的相对活力。

1.2.8 D-乳酸脱氢酶动力学参数测定：在最适pH磷酸缓冲液(0.1 mol/L)中加入辅酶NADH 0.2 mmol/L，不同浓度的底物丙酮酸，最适温度下反应，测其反应速度。用双倒数方程求得动力学参数。

1.2.9 D-乳酸脱氢酶的热稳定性和热失活性：将酶在不同温度(25、30、35、40、45、50、55和60 °C)下分别放置10 min，冰浴0.5 h后，在各自最适pH和最适温度下进行反应，分别测定其剩余酶活。定义25 °C温度下处理10 min后的剩余酶活为100%，分别计算在不同温度下处理10 min后酶的相对酶活。T₅₀¹⁰定义为酶在放置10 min后，酶活力降低到相对于置于25 °C 10 min的酶活力一半时，所需要的温度。

酶在特定的温度下的热失活性是通过将酶在45 °C下放置0-90 min，冰浴10 min，分别测定其剩余酶活。酶的热失活半寿期(t_1/2)是指酶活力降低到初始活力的一半时所需要的时间。

2 结果与分析 2.1 D-乳酸脱氢酶基因克隆、表达与纯化

以詹氏乳杆菌和植物乳杆菌基因组DNA为模板进行PCR扩增，产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，得到的目的片段大小分别在1 002 bp和999 bp左右，与预期大小一致。经酶切后，连接到经同样酶切处理的pETDuet-1质粒，分别构建了重组质粒pETDuet-ldhD20557和pETDuet-ldhD20174质粒，经测序分析验证，证明重组质粒插入片段正确，并与GenBank中对应的D-乳酸脱氢酶基因一致。

分别使用携带pETDuet-ldhD20557、pETDuet-ldhD20174质粒的E. coli BL21(DE3)来表达D-乳酸脱氢酶，在18 °C低温诱导下，细胞能较好破壁，并且由于目的蛋白上已被添加His标签，通过Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化后的蛋白条带单一(图1)，可用于下一步酶学实验。

2.2 反应产物光学纯度检测

用纯化、脱盐后的詹氏乳杆菌和植物乳杆菌的D-乳酸脱氢酶催化丙酮酸与NADH反应，得到反应产物。用高效液相手性柱可以将D-乳酸、L-乳酸分离，根据标准品的出峰时间可以确定反应产物的光学纯度。如图2所示，来自詹氏乳杆菌和植物乳杆菌的D-乳酸脱氢酶均仅催化丙酮酸生成D-乳酸，

而没有L-乳酸的产生，说明两种来源的D-乳酸脱氢酶均是严格的D-乳酸脱氢酶，且来自詹氏乳杆菌的D-乳酸脱氢酶的催化特性并未受到温度的影响。

2.3 D-乳酸脱氢酶的最适反应温度的确定

由图3A可见詹氏乳杆菌的D-乳酸脱氢酶的最适温度在45 °C左右，而植物乳杆菌D-乳酸脱氢酶(图3B)的最适温度则在30 °C左右，从最适反应温度上来看詹氏乳杆菌的D-乳酸脱氢酶的最适温度要大于植物乳杆菌D-乳酸脱氢酶的最适温度，因此詹氏乳杆菌的D-乳酸脱氢酶更适于高温生产D-乳酸。

2.4 D-乳酸脱氢酶的最适酶反应pH值

分别在不同pH条件下的磷酸缓冲液中反应，把最高的活力算作100%的活力。来自詹氏乳杆菌的D-乳酸脱氢酶(图4A)和植物乳杆菌的D-乳酸脱氢酶(图4B)分别在pH为6.5和7.0的时候酶的活力最高。

2.5 D-乳酸脱氢酶的热稳定性和热失活性的确定

将酶在不同温度下放置10 min后，再测其酶活。根据酶活的大小判断在不同温度下D-乳酸脱氢酶的稳定性。将放在25 °C的酶作为对照，其反应活力为100%，其他则有相对的活力(图5A)。来自詹氏乳杆菌的D-乳酸脱氢酶的酶活力随着温度的升高热稳定性在缓慢的降低，当温度达到55 °C以后时，酶活力降低到25 °C的酶活力的一半，60 °C温浴后酶完全失活，所以T₅₀¹⁰要在55−60 °C之间。而来自植物乳杆菌的D-乳酸脱氢酶在温度达到35 °C之后，酶活力迅速下降，仅剩下25 °C下的酶活力的25%左右，T₅₀¹⁰仅在35−40 °C之间，与来自詹氏乳杆菌的D-乳酸脱氢酶的T₅₀¹⁰相比低了近20 °C，表明来自詹氏乳杆菌的D-乳酸脱氢酶热稳定性良好。

将酶在同一温度下放置0−90 min，每10 min测其酶活，根据酶活的大小判断在不同加热时间下的酶热失活性。将放置0 min的酶作为对照，其反应活力为100%的活力，计算其他的相对活力(图5B)。来自植物乳杆菌的D-乳酸脱氢酶在加热初期酶活力就迅速降到40%左右，t_1/2不足10 min。而詹氏乳杆菌的D-乳酸脱氢酶的酶活力虽然在开始温浴的10 min中里，酶活力迅速降到66%，但之后酶活下降缓慢，直至接近80 min时酶活力才降低到初始活力的50%，t_1/2在70−80 min之间，与来自植物乳杆菌的D-乳酸脱氢酶相比较，具有较高耐热性。

2.6 D-乳酸脱氢酶动力学参数的确定

在各自最适反应条件下，分别测定两种不同来源D-乳酸脱氢酶的动力学参数。采用Lineweaver-Burk双倒数法作图，计算D-乳酸脱氢酶对丙酮酸的K_m值、k_cat值以及k_cat/K_m值(表1)。其中来自植物乳杆菌D-乳酸脱氢酶的K_m值约是来自詹氏乳杆菌D-乳酸脱氢酶的K_m值的14倍，说明植物乳杆菌D-乳酸脱氢酶对丙酮酸的亲合力不如詹氏乳杆菌。虽然来自詹氏乳杆菌的D-乳酸脱氢酶的k_cat值要比来自植物乳杆菌D-乳酸脱氢酶的k_cat值低，但是来自詹氏乳杆菌的D-乳酸脱氢酶对底物丙酮酸的亲和力更高(相差13倍)，从而使得k_cat/K_m值比来自植物乳杆菌的D-乳酸脱氢酶的k_cat/K_m值高出3倍多，表明其在D-乳酸的生产上有更高的催化效率，这些说明了来自詹氏乳杆菌的D-乳酸脱氢酶在生产D-乳酸上更具潜力。

3 结论

随着聚乳酸产业对高光学纯D-乳酸的需求不断增长，D-乳酸的发酵生产逐步受到重视。目前D-乳酸发酵菌种均为常温菌株，培养基及发酵系统需要灭菌处理，并且操作过程中要求较高，需要避免染菌，从而提高了D-乳酸的发酵成本。而在L-乳酸发酵中采用耐热的凝结芽孢杆菌作为发酵菌株，该菌株的最佳发酵温度在50 °C以上，可以采用不灭菌的开放式发酵工艺，从而显著降低了发酵成本^[12]。由于D-乳酸脱氢酶的不耐热性，限制了D-乳酸的高温发酵菌株的构建。本文通过基因资源发现，并分别克隆了来自詹氏乳杆菌和植物乳杆菌的D-乳酸脱氢酶的基因，实现其在E. coli BL21(DE3)中的高效异源表达。通过对两株菌的D-乳酸脱氢酶的一系列酶学性质的比较，詹氏乳杆菌比目前报道的来自植物乳杆菌中的D-乳酸脱氢酶的温度耐受性更佳，并且詹氏乳杆菌的D-乳酸脱氢酶的催化效率也远大于来自植物乳杆菌中的D-乳酸脱氢酶的催化效率。通过本文获取的来自詹氏乳杆菌的耐温D-乳酸脱氢酶，采用耐热的宿主，如凝结芽孢杆菌作为宿主，通过基因工程改造，替换原有的L-乳酸脱氢酶，可以构建重组凝结芽孢杆菌，实现高光学纯D-乳酸的高温开放式发酵，从而显著降低生产成本。