氨基糖苷类抗生素，如庆大霉素、妥布霉素等，不仅是良好的抗菌药物，而且还具有潜在的治疗人体免疫缺陷^[1]和消除抗药性质粒功能^{[2, 3]}。G418是庆大霉素生物合成的中间体，可作用于真核生物的80S核糖体亚基上，有效抑制寄生虫和原生动物的生长；在分子生物学实验中，G418通常作为细胞转染的筛选标记材料^[4]。但作为中间体是含量很少，分离提取困难；产G418的小单孢菌(Micromonospora rhodorangea NRRL 5326)代谢产物也是多组分，分离提取复杂^[5]，价格昂贵。因此，如果能工程化庆大霉素产生菌绛红小单孢菌G1008，获得积累单组分G418的工程菌，不仅可以完善庆大霉素生物合成途径的研究，而且还有重要的产业化意义。

自庆大霉素问世以来，对其生物合成过程进行了广泛的探索。通过对阻断突变株喂养中间产物，或突变株之间的共合成，以及使用¹⁴C-、¹³C-甲硫氨酸进行研究，提出了庆大霉素生物合成途径的轮廓^{[6, 7, 8]}，如图 1所示。随后分子生物学技术在氨基糖苷类抗生素研究中的广泛应用，为从分子遗传水平阐明生物合成过程奠定了技术基础，如丁酰苷菌素已经从酶催化水平解析了生物合成的全过程。庆大霉素的生物合成过程也逐步取得突破，GenBank数据库中，先后公布了棘孢小单孢菌中庆大霉素的生物合成基因簇gnt (登录号：AJ524043)、gtm (登录号：AJ575934)和gen (登录号：AJ628149)，长度分别为38146、32 666和84222 bp。通过生物信息学分析，推测各个基因的功能，结合预测的生物合成代谢途径，形成了完整的庆大霉素代谢网络^[9]。Park等^[10]通过在委内瑞拉链霉菌中异源表达确认了由6-磷酸葡萄糖至庆大霉素A2的最小生物合成基因模块。2012年，通过接合转移方法将质粒成功导入绛红小单孢菌，并敲除genK基因，构建了C1a产生菌，间接证明其甲基化功能^[11]。同时，Kim等^[12]证明GenK是一个钴胺素依赖的S-腺苷-甲硫氨酸激酶，在体外实现了庆大霉素X2转变为G418的催化活性，验证了前者的推测。2014年，Guo等^[13]阐明了庆大霉素生物合成分支点处催化酶的专一性和交叉性，GenQ为双功能酶，同时作用于庆大霉素X2和G418；GenB1为C-6′位主要的转氨酶，GenB2为C2a与C2的差向异构化酶，而GenB3和GenB4参与了C-3′,4′的双脱羟基作用，其中GenB2、GenB3和GenB4也具有C-6′位转氨作用。

综上所述，利用分子遗传学方法进行定向改造绛红小单孢菌是可行的。2012年洪文荣等公布了绛红色小单孢菌G1008的庆大霉素生物合成基因簇(登录号：JQ975418)，其中基因genQ*与棘孢小单孢菌中genQ为同源基因，本研究通过敲除M. purpurea G1008中genQ*阻断庆大霉素的生物合成代谢流，构建一株具有工业应用潜质的G418单组分工程菌，同时验证GenQ在绛红小单孢菌中的双功能催化作用及是否有可替代酶。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株和质粒：绛红小单孢菌G1008为庆大霉素产生菌，大肠杆菌E. coli Top10为质粒克隆宿主，大肠杆菌E. coli ET12567 (pUZ8002)为接合转移供体菌，pKC1139 (aac(3)IV，oriT)为大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒，以上均为本实验室保藏。克隆载体pMD19-T购自日本TaKaRa公司。

1.1.2 培养基和抗生素：绛红小单孢菌G1008固体培养基、种子培养基、发酵培养基及预萌发培养基均参照文献^[11]。绛红小单孢菌菌丝体生长培养基和大肠杆菌生长培养基分别为YEME培养基^[14]和LB培养基。本研究中使用的抗生素及其终浓度分别为：氨苄青霉素100 mg/L、安普霉素100mg/L、氯霉素25 mg/L、卡那霉素50 mg/L、萘啶酸25 mg/L。

1.1.3 主要试剂：限制性内切酶、Taq DNA聚合酶和T4DNA连接酶购自日本TaKaRa公司；溶菌酶、RNase A酶、Proteinase K和DNA凝胶回收试剂盒购自生工生物工程(上海)有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯或色谱纯。732型阳离子树脂购自上海华震科技有限公司。

1.2 方法 1.2.1 引物设计：根据庆大霉素的生物合成基因簇(登录号：JQ975418)，使用VectorNTI软件设计genQ*的同源交换臂引物：P1/P2扩增上游交换臂B1，P3/P4扩增下游交换臂B2。根据同源重组原理设计一对筛选与鉴定突变株引物：P5/P6。以pKC1139质粒为模板，设计安普霉素抗性基因筛选引物：P7/P8。引物序列及其限制酶见表 1。

1.2.2 分子克隆：绛红小单孢菌基因组提取方法参照链霉菌遗传操作手册^[14]。质粒提取、酶切、酶连、PCR以及大肠杆菌感受态细胞制备及转化等常规操作方法参照分子克隆实验手册^[15]。孢子PCR：刮取少量的绛红小单孢菌孢子，悬浮于无菌水，再用振荡器打散至均匀；以孢子悬浮液作为PCR扩增模板，其余组分及程序与普通PCR相同。DNA测序由金斯瑞公司完成。

1.2.3 接合转移：绛红小单孢菌与大肠杆菌间接合转移方法根据Hong等^[11]所述。

1.2.4 代谢产物提取及组分分析：小单孢菌发酵培养及代谢产物提取参照Hong等^[11]所述，生物效价测定和TLC (薄层色谱)参照《中华人民共和国药典》(2010版)^[16]。质谱分析方法：安捷伦6520四级杆飞行时间串联质谱仪。参数设置：ESI (+)， 100-800 m/z；流速 8.0 L/min；温度 350 °C；喷雾器压力 2.07×10⁵ Pa；Vcap 3 500V；碰撞电压 135 V。

2 结果与分析 2.1 基因genQ*的功能分析

采用VectorNTI软件，将绛红小单孢菌基因genQ* (登录号：JQ975418)、棘孢小单孢菌基因genQ (登录号：AJ628149)、丁酰苷菌素生物合成过程的C-6′脱氢酶基因btrQ(登录号：AJ629247.1)和新霉素生物合成过程中C-6′和C-6′′′脱氢酶基因neoQ (登录号：AB066276) 4个基因DNA序列转译成氨基酸序列，进行氨基酸多序列比对，结果如图 2所示，深灰色代表保守序列，中灰色代表相同氨基酸，浅灰色则代表相似氨基酸。其中，GenQ*与GenQ的相似度为95.5%，而4个基因的氨基酸序列相似度高达90.8%。同时，通过在线软件SWISS- MODEL (http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/)分析GenQ*蛋白的结构域，存在一个FAD依赖的氧化还原结构域和两个GMC (Glucose-methanol-choline)氧化还原结构域，推测基因genQ*为绛红小单孢菌G1008中庆大霉素生物合成的脱氢酶基因。

2.2 重组质粒 pQB303 的构建

参照方法1.2.1，扩增genQ*的上游交换臂B1(1 995 bp)和下游交换臂B2 (1 917 bp)，分别克隆至pMD-19T上，得到中间质粒pQB301和pQB302，经酶切验证正确。质粒pQB301经Hind III/EcoR I双酶切，回收B1片段；质粒pQB302经Hind III/ Xba I双酶切，回收QB2片段；与此同时，pKC1139经EcoR I/Xba I双酶切，回收6 477 bp片段，与交换臂B1、B2混合酶连，克隆得到重组质粒pQB303。重组质粒图谱(图 3A)中存在6个Sac I酶切位点，可以将质粒切割成6 214、1 606、1 217、751、531和82 bp6个线性片段，其中82 bp因太小，电泳检测未能清楚观察到；2个Hind III限制酶酶切位点，可以切割成8 457和1 944 bp两个片段；而经EcoR I/XbaI双酶切，则可以切割成 6 477和3 924 bp两个片段。重组质粒pQB303经过以上3种方式酶切验证，电泳检测结果如图 3B所示，电泳条带大小与理论分析一致，并经测序证明得到目的质粒正确，可用于后续的接合 转移。

2.3 genQ*阻断突变株的筛选和验证

genQ*大小为1 515bp，根据同源重组模型，如图 4A所示，敲除基因621bp (412-1 032 bp)，并被限制酶Hind III (AAGCTT)序列替代。设计双交换筛选引物P5/P6，单交换菌株可以扩增出561和1 183 bp，genQ*阻断突变株可以扩增出561 bp，而回复突变或亲株G1008则只能扩增出1 183 bp。同时，设计安普霉素抗性基因扩增引物(P7/P8)，引物序列见表 1。

参照方法1.2.3，将同源重组质粒pQB303导入到绛红小单孢菌G1008中。质粒pQB303携带链霉菌温敏型复制起始位点psG5 ori，只有温度低于34 °C时，才能在绛红小单孢菌G1008中游离存在。因此在37 °C及安普霉素和萘啶酸两种抗生素筛选下，只有质粒pQB303整合到G1008基因组中，能在固体平板上生长，即为单交换菌株。选择其中一株长势较好的，命名为绛红小单孢菌GQ1，用于双交换菌株的筛选。GQ1转点至含有安普霉素 100 mg/L和萘啶酸25 mg/L的固体平板中，培养3代，彻底清除可能夹杂的大肠杆菌和G1008。再提取GQ1基因组为模板，用筛选引物P5/P6和安普霉素抗性引物P7/P8进行PCR扩增，PCR产物电泳如图 4B所示，与理论一致，进一步证明GQ1为目的单交换菌株。

单交换菌株具有遗传不稳定性，在没有筛选压力下，容易在同源交换臂上发生第二次重组，依据这一特性即可筛选得到阻断突变株。单交换菌株GQ1经松弛培养3代后，开始分离单菌落直至第8代，单菌落影印至含有阿泊拉霉素平板和无抗平板上，得到11株安普霉素敏感菌株，这些菌落可能为阻断突变菌株，也可能为回复突变菌株。经孢子PCR初步检测，有两株可能为阻断突变株。对两株进行斜面培养，观察其生长形态和孢子丰厚度，并进行发酵和生物效价测定，选择生长状态好及生物效价高的一株，提取其基因组DNA，采用引物(P5/P6)进行PCR扩增，PCR产物电泳结果如图 4B，与理论大小561bp一致，经DNA测序，结果准确，最终得到了目标菌株，即genQ*基因缺失工程菌，命名为绛红小单孢GQ175。

工程菌GQ175经斜面培养3代，其形态特征没有发生明显变化，生长良好，产孢丰富，说明其遗传性状稳定。对GQ175进行摇瓶发酵，并以亲株G1008作对照，发酵完成后，对GQ175和G1008两者发酵液进行预处理，检测生物效价。结果显示，GQ175的生物效价为828 mg/L，与亲株G1008的930mg/L相当，说明其产抗能力没有因为genQ*缺失而受到影响。

2.4 绛红小单孢菌 GQ175 的代谢产物分析

将预处理的发酵液经732氨型树脂吸附，洗脱后再用乙醇沉淀，得到粗制样品。粗制样品通过TLC和MS检测，GQ175的代谢产物与亲株G1008进行比较，分析基因genQ*缺失对庆大霉素代谢流的影响。TLC检测结果如图 5所示，GQ175不再合成庆大霉素C族组分，只产生了一种与G418标准品迁移率一样的物质，初步判定为G418。经MS进一步分析，G1008代谢产物质谱图有3个主峰：分子量为450.3 (C1a)、464.3 (C2、C2a、C2b)和478.3 (C1)，而497.3 (G418)分子强度峰极低；而GQ175代谢产物的质谱图主峰为497.3，与G418的分子量吻合，322.2的峰为碎片峰，249.1的为双电荷峰。因此，阻断突变株GQ175不再合成庆大霉素C族组分，只合成G418单一组分。

3 讨论

氨基糖苷类抗生素具有抗菌谱广、杀菌完全等特征，是临床上应用广泛的抗感染药物。获得单组分高产菌株是从根源上降低其工业生产成本的主要措施，但不管是传统的育种还是基因工程定向育种都难以取得良好的效果。如Hong等^[17]敲除了黑暗链霉菌Tt-49中aprH-M基因模块，得到了一株氨甲酰妥布霉素单组分产生菌，但可能是由于破坏的菌株基因模块太大，其整体的产抗能力不如 亲株。

绛红小单孢菌G1008中庆大霉素生物合成基因genQ*，与棘孢小单孢菌中庆大霉素C-6′脱氢酶GenQ氨基酸序列相似高达95.5%，其长度则相差3 个氨基酸。本研究通过破坏绛红小单孢菌G1008中genQ*的功能，构建G418单组工程菌。为了尽量避免对菌株的损伤以及影响genQ*上下游基因的表达，选择敲除genQ* 1/3 (621 bp)的中间序列，得到一株G418单组分工程菌M. purpureaGQ175 (CGMCC No. 8543)，不积累庆大霉素X2及其他庆大霉素组分。生物效价测定，GQ175的发酵单位为828 mg/L，与亲株G1008的930 mg/L相当，说明工程菌保持了亲株的产抗能力。然而G418的抑菌效率比C族复合物低得多，因此工程菌产G418的物质量已经超过了亲株产C族复合物的物质量。可能是由于庆大霉素生物合成中左支路物质流量也流向了G418的合成，或者庆大霉素C族终产物抑制效应的解除。此外，工程菌GQ175和亲株G1008代谢产物MS分析中，其分子峰强度可以粗略反映物质的含量，其中G418分子峰的强度已经高于庆大霉素C族复合物；单从G418来比较，工程菌已经高于亲株约200倍。

敲除棘孢小单孢菌ATCC15835中基因genQ序列1 494bp (全序列1 524 bp)获得一株突变菌 ΔgenQ，主产G418 (比野生菌高100倍)并积累少量庆大霉素X2^[13]。与突变株ΔgenQ相比，工程菌GQ175除去了庆大霉素X2这一杂质组分，并且产G418增长倍数也比较高。产生这种区别的原因可能是敲基因序列的量不一样，也有可能是棘孢小单孢菌与绛红小单孢菌菌株的区别。此外，结果证明绛红小单孢菌中庆大霉素C-6′脱氢酶基因只有genQ*，不存在其他可替代基因，与棘孢小单孢菌一样，说明不同菌种间存在保守性。