随着分子生物学的不断发展，细菌基因组DNA的提取已成为一种常规的实验手段，但作为分子生物学研究的第一步，高效稳定的细菌基因组DNA提取方法对后续分子生物学的研究有着重要的意义。革兰氏阳性细菌细胞壁是由一层厚且致密的肽聚糖和磷壁酸组成，而肽聚糖的肽链通过5个甘氨酸互相交联着，不易裂解，而目前通行的分子生物学手册中，提取基因组总DNA均以革兰氏阴性菌大肠杆菌为例，这些方法在高效提取革兰氏阳性细菌基因组DNA方面有一定的局限性^[1]。作为分子生物学研究的基础，细菌样品中基因组DNA的浓度、纯度、片段大小及一致性，对后续PCR和克隆的效果会产生较大影响，更制约着Q-PCR的准确性^[2]。张涛涛等^[3]的研究也表明DNA提取方法对基因组DNA的质量、得率以及后续PCR扩增效果影响显著，因此，选用适宜的DNA提取方法对研究至关重要。为保证革兰氏阳性菌分子生物学实验顺利开展，不但要考虑DNA提取得率，还要尽可能地减少DNA的降解^[4]，并保证不同批次DNA提取效率和质量的一致。

1 材料与方法 1.1 实验菌株

嗜热梭菌(Clostridium thermocellum)和热解糖厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)均为革兰氏阳性细菌，由达特茅斯学院(Dartmouth College)的Lynd教授赠予。

1.2 主要试剂和仪器

蛋白酶K、溶菌酶、琼脂糖、SDS均购自Sigma公司。

凝胶成像系统Bio-Rad Gel Doc 2000型，美国伯乐公司；NanoDrop ND1000微量紫外分光光度计，基因有限公司；恒温摇床，上海天呈实验仪器制造有限公司；LDZX-40Ⅱ型立式自动电热压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂。

1.3 实验方法 1.3.1 培养基和培养条件：实验采用改良的MTC培养基(g/L)^[5]：丙磺酸100 (pH 7.9)；A液(酵母粉50)；B液(柠檬酸钾50、柠檬酸31.25、Na₂SO₄ 25、KH₂PO₄ 25、NaHCO₃ 62.5)；C液(尿素250、NH₄Cl 75)；D液(MgCl₂·6H₂O 50、CaCl₂·2H₂O 10、FeCl₂·4H₂O 5、L-半胱氨酸盐酸盐50)；E液(盐酸吡哆胺1、对氨基苯甲酸0.2、生物素0.1、维生素B₁₂ 0.1、维生素B₁ 0.2)；F液(MnCl₂·4H₂O 0.025、CoCl₂·6H₂O 0.025、ZnCl₂ 0.01、CuCl₂·2H₂O 0.002 5、H₃BO₃ 0.002 5、Na₂MoO₄·2H₂O 0.002 5、NiCl₂·6H₂O 0.002 5)。

将储液按比例加入装有5 g/L微晶纤维素(或纤维二糖)为底物的西林瓶中，除氧后分别接种5% (体积比)C. thermocellum、或T. thermosaccharolyticum，于55 °C、180 r/min培养至对数生长期。

1.3.2 几种细菌基因组DNA提取方法比较：选取对数期的C. thermocellum菌种，用水煮法^[1]、传统法^[6]、CTAB-SDS法^[7]、SDS-碱裂解法、酚氯法^[8]和SDS-酶裂解法^[9]提取基因组DNA。SDS-碱裂解法提取的基因组DNA产率较高，但纯度较低，为提高其提取纯度，对该法进行了改良，主要改良之处：在加入碱裂解液Ⅰ的同时加入溶菌酶和RNase A酶，改良SDS-碱裂解法的具体提取步骤为：取菌液1.5 mL，-4 °C、12 000 r/min离心2 min，弃上清液，沉淀依次加入100 μL碱裂解液Ⅰ (50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L pH 8.0 Tris-Cl，10 mmol/L pH 8.0 EDTA)、溶菌酶和RNase A酶，用漩涡振荡仪振荡1 min。加入200 μL现配的碱裂解液Ⅱ (0.2 mol/L NaOH溶液，1% SDS)，快速温柔地颠倒5次，冰浴20 min。加入150 μL预冷的碱裂解液Ⅲ (5 mol/L醋酸钾60.0 mL，冰乙酸11.5 mL，灭菌蒸馏水28.5 mL)，反复颠倒5次，冰浴5 min后-4 °C、12 000 r/min离心5 min取上清液450 μL，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心，取上清液450 μL，加入2倍体积的冰冻无水乙醇，混合均匀，室温沉淀DNA 10 min后离心，干燥沉淀。沉淀加入1 mL 70%的乙醇，颠倒混匀后离心，干燥沉淀。用50 μL含有RNase A酶(10 mg/L)的TE溶液重悬，-20 °C保存。

1.3.3 基因组DNA产率和纯度及完整性检测：将提取所得样液DNA按一定倍数稀释后，用紫外分光光度计测定OD₂₆₀/OD₂₈₀值和OD₂₆₀/OD₂₃₀值，按照1个OD₂₆₀值相当于50 mg/L和稀释倍数来换算DNA的浓度，并计算DNA的产率，用OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值表示DNA样品的纯度。取10 μL基因组DNA提取原液，用0.8%琼脂糖凝胶，电泳(1×TAE，5 V/cm) 40 min，再用核酸染料染色，紫外透射仪观察和拍照，检测DNA条带的亮度及基因组DNA完整性。

1.3.4 统计分析：所有的数据通过3次平行实验收集得到，利用SAS软件进行方差分析，肩注小写字母表示差异的显著性，肩注大写字母表示差异的极显著性，显著性由a、b、c……的顺序依次减弱，小写字母不同表示差异显著(P<0.05)，大写字母不同表示差异极显著(p<0.01)，除非特别说明。

2 结果与分析 2.1 6种提取方法的DNA产率、纯度和完整性

6种提取方法中，有4种能够提取出C. thermocellum基因组DNA，但提取效果有明显差异，见表 1。其中SDS-碱裂解法的产率最高，平均达268.27 mg/L，酚氯法最低，仅为93.68 mg/L；SDS-碱裂解法的OD₂₆₀/OD₂₈₀平均值在1.7以下，提取的DNA纯度较低，可能是残留的蛋白质较多。酚氯法的OD₂₆₀/OD₂₈₀平均值为1.77，提取的DNA蛋白质去除效果较好，但OD₂₆₀/OD₂₃₀值为0.97，DNA盐分去除效果最差，传统法和SDS-酶裂解法提取所得DNA纯度及产量均较低。综上，对SDS-碱裂解法进行改良，在保持其产率的条件下，提高纯度。

DNA样液琼脂糖凝胶电泳分析图谱，见图 1。从图 1中可以看出，4种提取方法均有基因组DNA条带。虽加样量均为10 μL，但DNA条带的亮度明显不同，SDS-碱裂解法和传统法的条带亮度较酚氯法和SDS-酶裂解法明显亮，即提取所得产率较高，这也说明前2种方法产率高，与紫外检测结果相符。

2.2 改良SDS-碱裂解法DNA提取效果验证

改良SDS-碱裂解法提取C. thermocellum和T. thermosaccharolyticum基因组DNA产率见表 2。其中C. thermocellum基因组DNA产率为418.23 mg/L，较未改良前产率提高近2倍，且2株菌的OD₂₆₀/OD₂₈₀值和OD₂₆₀/OD₂₃₀值均在1.8-2.0之间，说明提取所得基因组DNA中蛋白质和盐分去除效果均较好，有利于后续实验的进行。

DNA样液琼脂糖凝胶电泳分析图谱，见图 2。从图 2中可以看出，改良SDS-碱裂解法提取所得基因组DNA条带完整性较好，杂质去除效果好。基因组DNA条带的亮度一致，说明提取所得基因组DNA产率基本一致，稳定性好，与紫外检测结果相符。

实验通过对比目前常见的6种提取方法，对提取所得C. thermocellum的基因组DNA质量和得率进行比较后，对SDS-碱裂解法进行了改良，发现改良后的SDS-碱裂解法提取所得C. thermocellum和T. thermosaccharolyticum的DNA纯度和完整性都较高，且产率、纯度和稳定性明显比未改良前有所提高，这说明本实验在加入碱裂解液Ⅰ的同时加入溶菌酶和RNase A酶的改进是成功的，SDS不仅可以破坏细胞膜，并且可以促进溶菌酶的乳化作用^[10]，二者结合，促进了细胞的裂解，进而优化了基因组DNA的提取步骤，也为其他革兰氏阳性菌总DNA的提取提供参考。

3 结论

通过比较水煮法、传统法、CTAB-SDS法、SDS-碱裂解法、酚氯法和SDS-酶裂解法对革兰氏阳性细菌(Clostridium thermocellum)基因组DNA的提取效率和产率发现，SDS-碱裂解法提取所得基因组DNA产率最高，为268.27 mg/L，但OD₂₆₀/OD₂₈₀值为1.64且OD₂₆₀/OD₂₃₀值为1.65，说明蛋白质和其他影响后续检测的杂质去除情况较差，为适应基因组DNA的提取需要，也为后续实验的进行打下良好的基础，因此对其进行改良。改良后的SDS-碱裂解法提取所得C. thermocellum和T. thermosaccharolyticum基因组DNA产率分别为418.23 mg/L和397.51 mg/L、OD₂₆₀/OD₂₈₀值分别为1.89和1.90，且OD₂₆₀/OD₂₃₀值分别为1.93和1.87，说明改良SDS-碱裂解法提取所得2株不同革兰氏阳性菌的产率稳定，且纯度较高，有利于后续实验的进行。此外，本法所用试剂价格便宜、性质稳定，适用于一般实验室的提取需求。