枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性菌的模式生物，同时也是一种安全性很高的重要工业微生物^[1]。多年以来，枯草芽孢杆菌广泛应用于生物基化学品、维生素和抗菌素等产品的生物转化^[2]。此外，枯草芽孢杆菌因其强大的分泌蛋白的能力和无毒性副产品的特性已经成为重组蛋白工业生产最重要的微生物^{[3, 4]}。1997年，枯草芽孢杆菌基因组测序和注释使研究人员对菌株有了更深入的理解和认识，同时也对基因的功能研究和表达调控提出了新的要求^[5]。

遗传操作技术对代谢工程和基因功能研究是必不可少的^[6]。为了提高目标代谢产品的生产率和得率，经常需要对一些代谢通路的基因进行敲除，对产品合成的代谢通路基因进行强表达，甚至是对某些关键基因的表达强度进行微调。这些都需要对基因组进行多轮修饰和改造。虽然随机突变和定向进化的方法对提高产量和研究基因功能也有很大帮助，但本文仅讨论理性遗传操作技术。

经典的理性遗传操作是通过正筛选标记基因来筛选重组子的，每进行一次遗传操作都需要引入一个正筛选标记基因。一些研究仅需要对基因组进行简单的遗传操作，例如敲除2个基因，可以直接通过同源重组分别在2个目标基因内部插入不同的标记基因来实现。但是一些代谢工程的研究需要对多个基因靶点进行顺序的操作，于是利用有限的标记基因在同一菌株中所能进行的操作数量也就非常有限。对于这个问题，一个有效的解决方法是将引入的标记基因从基因组消除，从而实现对标记基因的循环利用。这样，一个循环操作不会在基因组上留下任何筛选标记，因此这种操作手段就叫做无标记遗传操作。最近，枯草芽孢杆菌的无标记遗传操作技术有了很大的发展，使我们可以更加快速和高效地对基因组进行编辑^[7]。在本文中，我们从负筛选标记基因的选择和无标记遗传操作的策略两个方面对目前常用的枯草芽孢杆菌的无标记遗传操作技术进行总结，试图为读者选择最合适的策略

提供一些帮助。168菌株作为枯草芽孢杆菌的模式菌株，应用最广泛，研究最深入；而且168菌株经过了长期的驯化，相比野生的菌株具有更高的转化效率和生长速度，也更容易进行遗传操作^[8]。因此，本文综述的遗传操作技术主要针对168菌株。

将正筛选标记从基因组上消除通常需要负筛选标记的参与。负筛选标记基因是在特定的条件下将菌株杀死的基因。将负筛选标记与正筛选标记连在一起使用进行遗传操作，再利用负筛选标记对菌株致死的特性，就可以将标记基因从基因组上消除。常用的负筛选标记基因包括特定条件下的毒性基因和正筛选标记的抑制子。

枯草芽孢杆菌中常用的，作为负筛选标记的毒性基因包括upp ^[9]、mazF ^{[10, 11]}和hewl基因^[12]。枯草芽孢杆菌的upp基因编码尿嘧啶磷酸核糖转移酶(UPRTase)，它可以催化尿嘧啶生成尿苷单磷酸，使细胞利用胞外尿嘧啶。5-氟尿嘧啶是嘧啶类似物，可以被UPRTase催化反应生成枯草芽孢杆菌胸苷酸合成酶的强烈抑制剂5-F-dUMP，它的存在会导致枯草芽孢杆菌细胞的死亡。Fabret等最早利用upp基因作为负筛选标记在枯草芽孢杆菌中实现无标记的遗传操作^[9]。该基因也适用于多种革兰氏阳性菌，包括谷氨酸棒状杆菌^[13]、解淀粉芽孢杆菌^[14]等。

大肠杆菌的mazF基因表达一个核酸内切酶，切割mRNA的ACA序列，从而对细胞产生毒性。Zhang等利用IPTG诱导型启动子Pspac控制mazF的表达，在含有IPTG的培养基中，mazF表达使细胞致死，从而筛选出mazF基因片段弹出的菌株^[10]。

鸡卵溶菌酶基因hewl对芽孢杆菌属有很好的杀灭效果。它的抑菌作用不仅仅是由溶菌酶效果导致的，还与它的强阳离子性和疏水性有关系。Wang等使用一个温敏性启动子PR控制hewl的表达^[12]。在30 °C PR启动子受CI857蛋白的阻遏；在42 °C阻遏关系被解除。这样就可以通过温度来开启或关闭hewl的毒性作用。

另外一类常用的负筛方法是通过一个启动子和其配套的抑制子，将正筛选标记转变成负筛选标记(图 1)。具体来说，将一个正筛选标记(比如新霉素抗性基因neo)置于启动子(Pro)的控制之下，启动子Pro的起始转录可以被蛋白R所抑制。这样，如果R的表达基因reg在基因组上表达，R就会抑制neo的表达，从而使菌株丧失特定的抗性。这样，reg就成为了这种抗性中的负筛选标记基因。常用的抑制基因/启动子的组合包括blaI/PblaP、araR/Para、lacI/Pspac和cI857/PR。

图 1 　利用新霉素抗性基因的抑制子作为负筛选标记 Figure 1 　Using the repressor ofa neomycin resistance gene as counter-selectable marker

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地衣芽孢杆菌中的blaI基因在β-内酰胺酶调控中发挥作用，它的表达蛋白BlaI在转录水平抑制blaP基因的表达。Brans等^[15]将枯草芽孢杆菌赖氨酸合成关键基因lysA的启动子替换成PblaP。于是在blaI基因表达的情况下，lysA表达受抑制，菌株呈现赖氨酸缺陷型。这样blaI基因就成为了缺少赖氨酸的培养基中的负筛选基因。同样是利用对lysA表达的控制，Zhang等^[16]使用Psapc和lacI的启动子/抑制子组合，将lacI转换成了负筛选标记。

阿拉伯糖的诱导调控系统广泛应用于对细菌基因表达的控制。蛋白AraR抑制Para启动子的转录，在添加阿拉伯糖的情况下才可以解除抑制。Liu等用Para控制新霉素基因neo的表达。当基因组存在araR的情况下，neo表达被抑制。于是通过对培 图1 利用新霉素抗性基因的抑制子作为负筛选标记养基添加新霉素可以对含有araR的片段进行负筛选^[17]。类似的，Tanaka等用噬菌体的Pr启动子控制neo的表达，将Pr启动子的抑制基因cI857转换成了负筛选标记^[18]。

枯草芽孢杆菌的内源重组是一个十分复杂的过程，有大约40个蛋白的参与^[19]。RecA蛋白在枯草芽孢杆菌的重组过程中起核心作用。在枯草芽孢杆菌感受态形成的过程中，RecA蛋白的表达被有效地激活，与进入细胞的DNA相互作用并结合成聚合物。如果DNA与基因组有同源区域，就可以发生同源重组。

枯草芽孢杆菌内源重组机制包括环状质粒介导的单交换重组和线性片段介导的双交换重组。Duncan等最早发现了环状质粒可以通过单交换的方式整合到枯草芽孢杆菌的基因组中^[20]。而Haldenwang等利用这种单交换重组机制，将一个氯霉素抗性基因整合在了基因组上，从而实现了对一个短片段的定位^[21]。实现单交换的重组质粒在受体菌中不能复制而是整合到基因组上，所以又被叫做整合载体。单交换重组广泛应用于基因失活和基因突变中。例如，Vagner等建立了一套整合载体，仅需将一段靶向基因的片段克隆进入整合载体，就能系统地对枯草芽孢杆菌中的基因进行失活^[22]。相比单交换重组，双交换重组机制的发现稍晚一些^[23]，而且重组效率要低一些，因此通常需要更长的同源臂(通常500 bp左右)。实现双交换重组的供体DNA可以是线性化的质粒DNA或者PCR片段。利用线性化质粒作为供体DNA需要额外地构建质粒克隆，但该过程不过分依赖PCR，因此不容易引入随机突变。使用融合PCR构建重组盒子不需要构建质粒克隆，但是由于双交换重组需要较长的同源臂，所以构建重组盒子的过程需要两轮甚至更多轮的融合PCR，因此更容易在PCR过程中引入突变。

单交换重组和双交换重组均可以用来介导无标记的遗传操作(图 2)。对于单交换重组，Zakataeva等^[24]和Zhang等^[16]使用的方法是一个典型的策略(图 2A)。该策略将需要插入或者替换的片段插入上下游同源臂之间，再将他们连接进入一个整合载体。这样，上游同源臂或者下游同源臂介导的单交换重组就可以将这个载体整合进入基因组的特定位置。获得整合片段的菌株有天然的正向重复(Direct repeat，DR)序列，相邻的DR序列之间会发生第二次重组，从而将抗性标记弹出。本实验室代谢工程生产2,3-丁二醇、乙偶姻和核黄素的研究中就大量运用了这种单交换重组介导无标记的遗传操作^{[25, 26, 27]}。但是在利用这种方法消除抗性标记时，其中一对DR序列的重组会形成野生型的菌株，而另一对DR序列的重组形成突变型的菌株。两种重组发生的概率理论上各占50%。但是如果突变型有一定的生长缺陷，那么将其从野生型菌株中分离出来将会比较困难。

图 2 　利用枯草芽孢杆菌内源重组系统进行无标记遗传操作 Figure 2 　Using Bacillus subtilis endogenesisrecombination system for marker-free genetic manipulation 注：A：利用单交换重组引入突变点；B：利用双交换重组引入突变点；C：利用双交换重组敲除大片段. Note: A: Using singe crossover recombination to introduce apoint mutation; B: Using double crossover recombination to introduce a pointmutation; C: Using double crossover recombination to delete large sequence.

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双交换重组介导的无标记的遗传操作应用更广泛一些^{[9, 10, 11, 15]} (图 2B)。实现双交换的重组盒子通常包含4个组成部分：正负筛选标记基因、需要引入的突变、方便标记基因消除的DR序列和连在盒子两端的上下游同源臂。将重组盒子转化进入细胞，经过双交换重组就可以将筛选标记插入基因组，同时引入需要的突变。之后，借助于DR序列之间的重组，通过负筛选标记的致死效果，就可以筛选到抗性标记消除的菌株。在这种方法中，获得重组盒子的菌株只有一对DR序列，所以理论上所有消除抗性标记的菌株都是突变型菌株。

本实验室利用双交换重组的策略对枯草芽孢杆菌进行基因组最小化的研究，使用的大片段敲除方法如图 2C所示。设计供体DNA，利用双交换重组将cat-upp以及C片段整合进入基因组上的特定靶点。C片段与基因组上另一个位置的序列具有同源性，借助于2个C片段的重组，就可以将它们之间的区域敲除，同时消除抗性标记。利用这种方法，我们已经成功敲除了12个基因组大片段，总计745 kb。

位点特异性重组不依赖于DNA序列的同源性。相反地，其重组酶会催化有特定序列的DNA链的断裂和重新连接，从而实现位点特异性重组作用。目前最常用的位点特异性重组系统是来自于P1噬菌体的Cre/loxP系统、来自于Lambda噬菌体的Xis/attP系统和来自于酿酒酵母中的FLP/frt系统。以Cre/loxP系统为例，Cre蛋白可以介导2个loxP位点之间的位点特异性重组。如果2个loxP位点是同向的，重组就会将位点之间的序列消除；如果2个loxP位点是反向的，重组就会将位点之间的序列倒置。位点特异性重组的效率非常高，通常不需要筛选标记就可以筛选到重组子。位点特异性重组在枯草芽孢杆菌的遗传操作中主要应用于抗性标记的消除。其中Cre/loxP系统和Xer/dif 系统都已经被用来开发抗性标记消除系统。例如，Yan等^[28]就利用Cre/loxP系统来实现无抗性遗传操作(图 3A)。作者构建的重组盒子包含2个loxP识别位点和加在位点中间的新霉素抗性基因(lox71-neo-lox66)。在重组盒子整合在染色体上之后，利用温敏型质粒表达Cre酶，促使2个同向的loxP识别位点发生重组，从而将标记基因移除。每一次利用位点特异性重组都会在基因组上留下一个loxP识别位点的疤痕，因此如果对基因组进行多轮的操作，留下的多个识别位点之间可能会发生重组，降低基因组的稳定性。为了避免这种情况，作者使用了一对突变型的loxP识别位点：lox71和lox66位点，分别在位点的左半部分和右半部分有突变。这些突变单独存在并不会影响他们的重组功能，但是lox71和lox66位点发生重组之后形成的lox72位点同时含有左右两部分的突变，与Cre酶亲和力很低，从而提高遗传稳定性，不会妨碍后续的操作。Bloor等^[29]开发了基于Xer/dif的抗性标记消除系统，整体的设计与Yan使用的Cre/loxP系统类似。不同的是，Xer/dif系统的重组酶可以由枯草芽孢杆菌的RipX和CodV蛋白代替，所以不需要引入外源的重组酶表达系统。

图 3 　依赖位点特异性重组、λ Red重组或者Sce I内切酶的无标记遗传操作 Figure 3 　Marker-free genetic manipulation based onsite specific recombination, λ Red recombination, or Sce I endonuclease 注：A：利用位点特异性重组消除抗性标记；B：λ Red重组系统介导的ssDNA重组；C：Sce I内切酶介导的抗性标记的消除. Note: A: Cre/loxP site specific recombination mediatedselectable marker eviction; B: λ Red mediated ssDNA recombination; C: SceI endonuclease mediated selectable marker eviction.

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位点特异性重组通常有非常高的重组效率，所以其介导的抗性标记消除通常不需要使用负筛选标记就可以筛选到抗性消除的克隆。而且重组酶的识别序列比较短，对Cre/loxP系统和FLP/frt系统都是34 bp。这些因素都会减少重组盒子的长度，提高重组的效率。但是由于位点特异性重组需要特定的重组酶识别序列，所以通常会在靶点位置留下疤痕。

利用位点特异性重组也可以直接进行遗传操作。例如，Enyeart等^[30]开发了GETR (Genome editing via targetrons and recombinases)系统。他们利用II型移动内含子(Mobile group II intron)将34 bp的loxP识别位点插入到基因组的特定区域，插入效率可达30%以上。也就是说，可以不通过筛选标记，仅仅利用PCR的方法就可以筛选到loxP位点插入的克隆。然后再利用Cre/loxP系统实现对特定序列的插入、敲除和翻转。为了证明这个系统广泛的适用性，作者对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和希瓦氏菌都进行了操作。

λ Red重组系统被广泛应用于大肠杆菌的基因组工程操作中^[31]。它包含Exo、Beta和Gam三个蛋白质，既可以介导双链DNA(dsDNA)的重组，也可以介导单链DNA (ssDNA)的重组。ssDNA的重组仅需要Beta蛋白的参与，在理想状态下重组效率可以达到约30%^[32]。Wang等首次将Beta蛋白引入枯草芽孢杆菌中，通过电转化的方法导入ssDNA，实现了对目标基因的敲除^[12] (图 3B)。Red重组系统介导的ssDNA重组最大的优势是，利用长度仅为70 bp的短同源臂就能实现高效重组，因此同源臂可以通过DNA合成的方法直接制备，而不需要PCR过程。同时，其对细菌的转化是通过电转化实现的，这就为一些不容易形成感受态的菌株的工程操作提供了可能性。Wang等还发现，ssDNA重组靶向基因组的后随链，以及在重组引物中加入硫代修饰可以显著地提高重组率，这些结论与λRed系统在大肠杆菌中的表现类似。Wang等在工作中也尝试了λ Red系统介导的dsDNA重组，但是没有成功。一个可能的原因是Gam蛋白无法有效地抑制枯草芽孢杆菌的AddAB核酸酶系统。

Sce I内切酶识别一段18 bp的序列，并切割序列形成双链断裂(DSB)。DSB一方面会激活细菌的断裂修复系统，提高DR区之间的重组率，从而提高抗性基因消除的效率。另一方面，DSB会杀死没有发生重组修复的细胞，帮助筛选消除抗性的克隆。本实验室首先在枯草芽孢杆菌中开发了基于Sce I内切酶的抗性标记消除系统^[33]。Shi等将一个Sce I内切酶的识别位点与正负筛选标记以及DR序列连在一起(DR-cat-upp-SceI site-DR)，作为重组盒子整合到基因组上，同时引入所需要的突变点(图 3C)。在宿主菌内表达Sce I内切酶切断基因组。再借助upp基因作为负筛选标记，筛选到抗性基因消除的克隆^[33]。这种方法中仅需要30 bp的DR序列，因此可以通过引物合成而不是通过PCR的方法加入到重组盒子中，方便其构建并且缩短其长度。

作为革兰氏阳性菌株，枯草芽孢杆菌的遗传操作工具没有大肠杆菌和酿酒酵母高效^[7]。但是近几年开发的新方法和新技术也大大提高了对枯草芽孢杆菌基因组改造的效率。正如本文所介绍，这些方法各自有其技术原理及特点。没有一种方法是普遍适用的，针对不同的工程目标和规模或许需要选择不同的技术来进行操作(表 1)。

为了开发更高效的枯草芽孢杆菌的无标记遗传操作技术，笔者认为有以下几个方向可以尝试：(1) 开发更加高效的转化系统。在这方面，Zhang等^[34]和Shi等^[33]通过强表达ComK蛋白提高转化效率就是一个很好的尝试。(2) 开发更加高效的重组系统。例如Wang等^[12]成功地将λ Red重组系统引入到对枯草芽孢杆菌改造中来，实现了高效的ssDNA重组。(3) 引入或开发其他的遗传操作工具。比如近两年，CRISPR技术被证实可以在很多物种当中实现基因组改造，其中也包括大肠杆菌^[35]和酿酒酵母^[36]。CRISPR系统并不依赖Sce I内切酶所需要的特定的识别序列，而是通过表达一段gRNA，引导Cas9内切酶在基因组的任意位置切割形成一个DSB，杀死野生型的细胞，并且大大提高同源重组的效率。(4) 开发多元的基因组操作技术。在大肠杆菌中，已有MAGE^[37]和TRMR^[38]等多元重组技术可以对基因组多个靶点同时进行突变，然而在枯草芽孢杆菌中尚没有开发出类似的技术。一个最可能的原因是枯草芽孢杆菌的转化效率和重组效率相对大肠杆菌来说比较低。笔者认为一个可行的解决方法是：先在细胞中引入含有供体DNA的质粒，再通过Sce I内切酶或者CRISPR系统将质粒切断，释放供体DNA介导重组。这种方法已经有效地在大肠杆菌中提高了大片段插入的效率^[39]，而且CRISPR系统在很多高等动物细胞中都可以介导多个位点的同时修饰，因此利用这个工程思路可能在枯草芽孢杆菌中实现多元的重组。(5) 开发基因调控技术。比如Na等开发了基于sRNA基因的调节技术，可以在不改变基因组序列的情况下对基因的表达强度进行微调^[40]。这类基因调控技术虽然不属于遗传操作技术，但是他们是遗传操作技术很好的补充，可以降低大规模基因组改造的压力，提高探索代谢工程基因靶点的效率。